Introduction
Генетические исследования на живых организмах часто используют куриный эмбрион в качестве модели, потому что в ово электропорации представляет собой быстрый и недорогой способ частично трансфекции эмбриональных структур в естественных условиях с ДНК строит 1-5. Бицистронный векторы экспрессии, которые кодируют один транскрипт, содержащий флуоресцентный репортер вместе с представляющим интерес геном, таким как pCIG 6 или 7 ПМЭС, позволяют быстро проверку качества трансфекции в требуемой области под стереомикроскопом до обработки эмбрионов для нисходящего анализа.
С учетом последних достижений в секвенирования ДНК, что теперь можно получить цифровые целые профили экспрессии транскриптом с использованием образцов РНК Секвенирование РНК 8,9. Таким образом, вместо того, чтобы трудоемких методов, которые позволяют анализ лишь несколько генных продуктов в параллель, например, в гибридизация, иммуногистохимии и количественной ПЦР, приготовление библиотек кДНК длявысокопроизводительного секвенирования может предоставить информацию о всей транскриптома. Наблюдение за экспериментальными эффектов на уровни экспрессии каждого отдельного гена может, в свою очередь обеспечивают мощные представление о путях изменены конструкции, используемой. Это особенно легко, если геномной сборка для организма, используемой доступен, таким образом, снова куриного эмбриона является подходящей моделью.
Если пользователь имеет доступ к надежным секвенирования генома центра, главный вопрос заключается в получении образцов РНК высокого качества. Эта работа показывает, к способу получения образцов РНК из трансфицированных нейронных труб, пригодных для Секвенирование РНК, а также на последующих стадиях для силикомарганца в анализе полученных данных. После электропорации в HH12-13 последующим 48 ч инкубации трансфецировали магистральные половинки спинного мозга рассекали в рибонуклеазных свободной условиях, немедленно лизируют и дальше не защищены от разрушения сверхнизким замораживания до очистки РНК и библиотеки подготовка трион.
Общественность сервер Galaxy 10 обеспечивает доступ к бесплатным ресурсам для анализа данных секвенирования высокой пропускной. Объем пространства предложены для зарегистрированных пользователей достаточно для небольших экспериментов, тем самым устраняя необходимость в локальной вычислительной инфраструктуры. Анализ данных Секвенирование РНК включает в себя фильтрацию, выравнивание и количественного / сравнение экспрессии генов. Хотя существуют общие принципы для анализа данных Секвенирование РНК, параметры фильтрации во многом будет зависеть от качества секвенирования и должна быть определена после анализа контроля качества исходных данных.
Этот протокол описывает шаги, чтобы получить и сравнить Секвенирование РНК профили из куриных эмбриональных спинного мозга трансфектированных в естественных условиях. Как представительный результат, сравнение наборов данных, полученных от двух независимых контрольных образцов, трансфицированных пустым вектором, показали, что метод является воспроизводимым и должен позволить идентифицировать дифференциально ExpresSED транскриптов в экспериментальных образцах. Таким образом, применение этого метода имеет потенциал, чтобы значительно увеличить число открытий после одного эксперимента и, таким образом, обеспечить большой набор данных для последующего расследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. электропорации Construct интересов в нейронных труб из HH12-13 куриных эмбрионах В яйце
С помощью флуоресцентного репортера, предпочтительно в бицистронной транскрипта или слитый с представляющим интерес белком с интеркалирующего вирусной 2а пептида 11, с тем чтобы быстро идентифицировать людей с удовлетворительные уровни трансфекции. ПРИМЕЧАНИЕ: Типовое время инкубации для этой стадии составляет около 48 часов при температуре 37,8 ° С.
- Открыть небольшое окно в яйцах после удаления 3 мл альбумина с помощью шприца, соединенного с 18 G х 1 1/2 иглы. Для повышения визуализации эмбриона, вводят небольшое количество тушью разведенного 1:50 в стерильного раствора Рингера под эмбриона 1-4.
- После покрытия эмбриона с стерильного раствора Рингера, придать 10 мМ Трис-HCl, рН 8,2 и 0,1% пищевой краситель (F, D & C) раствора, содержащего 2,5 мкг не / мкл ДНК через задний конец нервной трубки, пока он заполняетдо заднего мозга области. Для электропорации, платиновые электроды позиции (0,5 мм в диаметре), разделенных на 4 мм 1 по фланкирующего и доставить 5 импульсов 50 мс и 20 V с интервалом 100 мс между ними 4.
- После электропорации, инкубировать манипулировать эмбрионов в течение 48 часов больше, пока они не достигнут стадии HH23 и выявления лиц, представляющие высокий уровень трансфекции в боку регионе под флуоресцентным стереомикроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность инкубации после электропорации зависит от цели эксперимента. Электропорированные плазмиды может генерировать значительные уровни экспрессии после 2 ч 2. Таким образом, если интерес заключается в ранних генов наступающими после электропорации Инкубационный период может быть уменьшен.
2. Урожай успешной трансфекции эмбрионов и Рассеките шнур таймах электропорации спинного
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура длится от 2-3 часов за каждые 10 эмбрионов и урожайности 1-2 Мкг общей РНК в зародыше. Рассечение нервных трубок требуется мелкие движения и некоторые практические занятия могут быть необходимы перед его применением в экспериментальных образцах.
- Дезактивации металлических инструментов рассечение РНКазой дезактивации раствора или путем обжига при 150 ° С в течение 4 ч 12 и подготовить DEPC обработанных PBS. Используйте только новый сертифицированный РНКазы Пластик.
ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора урожая, важно следовать стандартное лечение, чтобы предотвратить РНКазы загрязнения во время вскрытия. - Заготавливают эмбрионов, используя пару тонких ножниц рассечения и просеивают ложки сбора. Держите эмбрионов в холодной DEPC обработанных PBS в 100 мм чашки Петри.
- С парой тонких пинцетом, вырезать всю фланговую область (между задней границы передней бутон конечностей и передней границы заднего почки конечности) и передать этот раздел для нового блюда, содержащего холодную DEPC обработанных PBS.
- Используйте два прекрасных стеклянных игл для перфорации на три разныеуказывает на каждой дорсолатеральной стороне эмбриона между нервной трубки и параксиальном мезодермы.
- Введем два стеклянных иголок в центральной перфорацией и медленно переместите один из них далеко вдоль нервной трубки передне-задней оси. Повторите эту процедуру для перфорации, не были достигнуты первые движений. Снимите отдельностоящий параксиальное мезодерму с парой тонких пинцетом.
- Поверните эмбрион в сторону, вставьте кончики пинцета между нервной трубки и хорды и сдвиньте их в противоположных направлениях вдоль передне-задней оси, чтобы разделить две структуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это также должно снять большую часть мезодермы еще привязаны к нервной трубки. - При необходимости, удалить крупные куски mesodermic ткани, остаются прикрепленными потянув с пинцетом, слегка удерживая нервную трубку с другим пинцетом. Когда закончите, осторожно перенести нервную трубку в другую блюдо, содержащее холодный DEPC обработанных PBS, используяРНКазы стекло пипетки Пастера в сочетании с механической коробкой пипетки насоса и держать на льду, пока все трубки не расчленены.
- Разделите нервные трубки на две половины. Для этого вставьте острый кончик закрытом пинцетом в просвете и открыть верхнюю пластину, перемещая пинцет через него. После этого, разделите половинки разрезанием плиты перекрытия с помощью пинцета советы.
- Сорт электропорации от не-электропорации половин под флуоресцентным рамки вскрытии и переносят в 1,5 мл пробирку, наполненную ледяной DEPC обработанных PBS. Если необходимо, щелкнуть микропробирки осторожно, чтобы освободить любой ткани, прикрепленный к пластиковыми стенками и способствовать осаждению трубок.
- Спин на 100 мкг в течение 3 сек и удалить очень медленно, как много PBS, как это возможно с 1 мл микропипеткой. Сделайте это, глядя на источник света, который светит через микропробирку контролировать, если любой эмбриональный материал всасывается до кончика пипетки; если это произойдет, постепенно разряжается, и повторить centrifugaции.
- Добавить 70 мкл лизиса решение для экстракции РНК в нервных половине трубки и вылить трубку, чтобы перемешать содержимое. Выдержите при комнатной температуре в течение 5 мин и вихря энергично. Повторите 5 мин инкубации и вихревание еще два раза. Хранить при -80 ° С.
- Соберите по крайней мере, восемь половинки нервной трубки на образец, чтобы обеспечить адекватную доходность для следующего шага. Бассейн меньшие образцы, если несколько сеансов электропорации / рассечение обязаны накопить достаточное количество нервных трубок. Храните достаточное образцы для дубликатов или трижды для каждого условия.
3. Очищение РНК и подготовить библиотеки для Illumina Секвенирование
- Удалить образцы из -80 ° C хранения и поместить на льду в течение 15-30 мин. не Возобновление оттаивания при комнатной температуре до полного.
- Вихревой хорошо и оставить при комнатной температуре в течение 5 мин. Vortex снова и центрифуге при 15000 мкг в течение 1 мин для осаждения нерастворимого материала.
- Передача супернатант в новую пробиркуи приступить к добыче РНК в соответствии с полной изоляции РНК инструкции комплект ручных. Элюции в минимальной рекомендованной объема для повышения концентрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДНКазы лечение после очистки рекомендуется во избежание возможного загрязнения геномных последовательностей ДНК в РНК-Seq данных. - Флик трубку, чтобы перемешать содержимое и удалить 5 мкл для анализа контроля качества. Хранить оставшегося образца при -80 ° С до получения библиотеки; эти образцы можно разморозить только один раз, чтобы избежать деградации РНК.
- Запустите очищенной РНК в приборе Bioanalyzer помощью Nano комплект РНК 6000; Значение РИН должен составлять, как минимум 7, чтобы продолжить.
- Генерация библиотек с использованием совместимого Секвенирование РНК подготовки библиотека комплект Illumina и мультиплексирования до 4 библиотеки в одной полосы в HiSeq инструмента, установленного для генерации 100 б.п. один читает. Если это возможно, включать в себя все образцы в той же перспективе, чтобы минимизировать потенциальные технические артефакты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно дать до 50 млн тEADS на образец, который более чем достаточно, чтобы получить покрытие для большинства генов 13.
4. Сравните Секвенирование РНК наборов данных в Galaxy общественного Server 10.
ПРИМЕЧАНИЕ: место для хранения серверов ограничено и эксперименты, сравнивающие много образцов может потребоваться удаление промежуточных файлов, созданных в шагов фильтрации.
- Создайте учетную запись пользователя в публичном сервере Galaxy ( https://usegalaxy.org ) и FTP загружать наборы данных Illumina в формате fastq.
- Подготовка загруженные файлы с FastqGroomer 14 инструмента под NGS: КК и манипуляции меню; если баллы качество уже закодированы в Phred + 33 (Sanger), пропустить этот шаг, просто изменив тип файла для fastqsanger под атрибуты для каждого набора данных.
- Проанализируйте общее качество каждого набора данных, используя инструмент FastQC под NGS: КК и манипуляции меняню.
ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание должно быть уделено в результате графики для содержания последовательности в качестве базовой последовательности и в базовой, так как это обеспечит оценки параметров, используемых для отделки концы читает. - Обрезать читает отбросить 3 'концы с низким качеством данных с помощью инструмента FASTQ качества триммер 14 под NGS: КК и манипуляции меню. Установите инструмент для обработки только 3 'концы для показателя качества ниже 20.
- Снимите адаптер последовательности из считывает с помощью клипа инструмент ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) под NGS: КК и манипуляции меню. Установите инструмент для отмены читает с менее 45 б.п. слева входной последовательности адаптера, используемого и выбрать выход включать как подрезанные и не обрезается последовательности. Кроме того, выбор не отбрасывать последовательности с неизвестными баз, так как большинство низкие основы качества были уже удалены в последнем шаге. Используя инструмент Сократить последовательности ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) под NGS: КК и меню манипуляции, обрезать первые основы читает удалить 5 'уклон последовательность, обнаруженную FastQC (обычно 10).
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, это хорошая идея, чтобы запустить FastQC снова и сравнить с предыдущим анализом, чтобы определить, была улучшена качество набора данных. - Скачать и распаковать последнюю курица генома сборку для УСК генома браузера от Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) и загрузить файл весь геном Fasta формат и формат файла GTF гены аннотаций в истории Галактики, используя инструмент Загрузить файл под меню Get Data.
- Карта читает для каждого образца в курином генома с использованием выпрямитель TopHat2 15 подв NGS: меню РНК анализ. Выберите использовать геном из истории (выберите файл Fasta закачанный в шаге 4.7).
- Построить предсказанный транскриптом для каждого образца с помощью Запонки 16 под NGS: меню РНК анализа. Выберите, чтобы использовать справочную аннотацию в качестве руководства (выберите GTF загруженных в шаге 4.7) и включить опции Выполните Bias Correction (от истории, Fasta файла с шагом 4,7) и использовать мульти-читать правильно.
- Слияние предсказанные transcriptomes для всех образцов с использованием Cuffmerge 16 под NGS: меню РНК анализа. Выберите, чтобы использовать справочную аннотацию (GTF файл из шага 4.7) и данных о последовательностях (от истории, FASTA файл с шага 4.7).
- Сравните BAM файлы, созданные TopHat2 для каждого образца, используя Cuffdiff 16 под NGS: меню РНК анализа. В полевых стенограммы выберите меняrged транскриптомный генерируется Cuffmerge и включить опции Выполните Bias Correction (от истории, Fasta файла с шагом 4,7) и использовать мульти-читать правильно.
- Сортировать дифференциальное выражение тестирования таблицы численно восходящие в столбце 13 (д стоимости) с помощью приспособления Сортировать под фильтр и меню сортировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гены / стенограммы, показывающие существенное дифференциальную экспрессию между экспериментальных условиях представит самые низкие значения Q. - Чтобы проверить результаты визуально с покрытия графиков, сначала преобразовать BAM файлов в формате bedGraph используя инструмент Создать BedGraph покрытия генома 17 под меню BEDTools. Отключить отчетность регионах без покрытия, выбрать для лечения сплайсированные записи как отдельных интервалов и масштабировать покрытие с коэффициентом, который нормализует глубину секвенирования для всех наборов данных сравниваемых.
- Преобразование полученного bedGraph файл в формат воротила с помощьюПарик инструмент / BedGraph-на-воротила ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) в меню конвертировать форматы. Загрузите воротила файлы как пользовательские треки в геноме браузера УСК ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) для сборки galGal4 и поиск интересующего гена визуализировать освещение в наборах данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для проверки метода, описанного, две контрольные образцы были получены из эмбрионов электропорации с пустой вектор ПМЭС 7 и одного образца из эмбрионов, трансфицированных вектором, содержащим же вставка построить SCRT2-ZNF, который кодирует цинк-пальцев домены куриного SCRT2 18. Образцы, дающие 11-22 мкг общей РНК были получены друг из пулов 8 до 12 эмбрионов. Все три образца забил оптимальное значение РИН из 10 в проверке качества выполненных с прибором Bioanalyzer (рисунок 1), демонстрируя, что высокое качество РНК может быть получена с этим протоколом.
После секвенирования, описанный процесс фильтрации увеличена скорость выравнивания от 83 до 91% от считывает (данные не показаны). Как и ожидалось, сравнение transcriptomes из двух контрольных образцов не показал четкое различие при сравнении глобально в диаграммы рассеяния (рисунок 2) и коэффициент корреляции Пирсона 0.99. Кроме того, дисплей покрытия для всех трех наборов данных вдоль локуса, содержащего часть последовательности SCRT2 показали явное увеличение числа чтениями в этом регионе в экспериментальном образце (рисунок 3), указывая, что избыточная экспрессия была успешной и что различия между контрольной и экспериментальной выборок должны быть обнаружены с помощью метода, описанного здесь.
Рисунок 1:. Контроль качества РНК Bioanalyzer электрофореграммы показывая высокий уровень целостности для двух контрольных общих образцов РНК, обозначенных 18S и 28S рибосомных РНК пиков. Вставки представляют собой виртуальный гель для бега.
FIGURe 2:. Воспроизводимость Секвенирование РНК результатов количественного точечный график, показывающий, что RPKM для большинства генов такое же, как в контрольных образцах. Практически все гены, которые не следуют этому образцу имеют очень низкие значения RPKM и, таким образом, как правило, игнорируются при сравнении транскриптом.
На рисунке 3: Визуализация различий в качестве экспериментального образца УСК Геном браузера отображение локуса SCRT2 в геноме курицы (galGal4), показывающие, видимый рост охвата области, которая кодирует домен белка (SCRT2-ZNF) эктопически выраженную в. Экспериментальный образец.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предлагаем рекомендации для анализа эффектов после электропорации куриного спинного мозга. Хотя электропорации векторов ДНК чаще используется для гиперэкспрессией гена интереса, можно также использовать конструкции, кодирующие доминантные негативов, quimeric белки или прекурсоры в миРНК для создания условий функция гена бросовым 19-21. На самом деле, сравнение транскриптом профили в результате как амплитудно и потери от-функции анализа могут указать на гены разному экспрессируются в противоположных направлениях в каждом состоянии, тем самым, имея потенциал для раскрытия более специфические эффекты.
Как любой метод применяется вниз по течению к экстракции РНК, синтез РНК-Seq библиотек требует минимального начальное количество исходного вещества. С помощью этого протокола, 8 эмбрионов, должно быть достаточным, чтобы получить около 10 мкг общей РНК. Начиная с меньшим количеством лиц без ущерба адекватную рабочую концентрацию, вероятно,возможно с использованием системы экстракции РНК, которые позволяют конечное разведение в меньших объемах.
Правильное разделение нервной трубки от всех мезодермы следует практиковать несколько раз, до обращения в важных образцов, как это деликатный шаг, который требует некоторого опыта. Чтобы избежать чрезмерного деградации РНК в процессе стадии вскрытия, важно также, чтобы завершить всю процедуру для всех трубок в нейронных около 1-2 ч. Опять же, практика будет иметь важное значение для улучшения времени вскрытия. Одним из важных наблюдения является то, что связь между мезодермальных тканей сильнее, чем связь между мезодермы и нервной трубки, таким образом, потянув мезодермальные структуры, специально хорды, является более эффективным, чем пытаться сократить нежелательную ткань. Кроме того, исследователи должны чувствовать себя свободно развиваться самостоятельно техника оптимизирован для собственных условиях рассечение. Тем не менее, следует соблюдать осторожность для образцов по сравнению в одном эксперименте, чтобы разрезать же так, что Левел загрязнения с мезодермы тканей является как можно более однородными между образцами.
Наш протокол демонстрирует сравнение транскриптом профили из стадии HH23 куриных эмбриональных спинного мозга трансфектированных на этапе HH12-13. Тем не менее, небольшие изменения должны позволить его применение к эмбрионов, собранных на более ранних стадиях. С другой стороны, если более поздние стадии желательны для анализа конечного результата, что упомянутые векторы бицистронный может не быть пригодным из-за непрерывного уменьшения числа молекул на клетку по мере развития. Таким образом, особенно если конечная точка предназначена достигается после более чем 72 часов после трансфекции, это может быть необходимо использовать векторы, кодирующие транспозонов опосредованной геномной интеграции конструкции используется 22.
Другой вопрос, который необходимо рассмотреть, является неоднородность эффективности электропорации. Количество не трансфецировали клеток колеблется от нескольких до значительной АМОЕНТ, особенно те, в вентральной части нервной трубки. Поскольку после вскрытия все клетки подвергаются последующей анализа, низкая эффективность электропорации снизит чувствительность анализа в. Подход обогатить образец с электропорации клеток является использование клеток с возбуждением флуоресценции (FACS сортировки), чтобы уменьшить количество людей, не трансфицированных клеток из конечного образца 23. Если используется такой подход, однако, большее количество эмбрионов необходимо для достижения достаточной выход для РНК-Seq подготовки библиотеки.
Illumina секвенирование рекомендуется, так как это более широко предлагаемые секвенирования центров и в силикомарганца Секвенирование РНК анализа данных упрощается по сравнению с другими доступными платформами 24. Тем не менее, другие варианты по-прежнему соответствовал с изменениями в фильтрации данных шаги больше подходит для выбранной платформы. Принципы анализа данных Секвенирование РНК до сих пор не полностью установлены и сравнение выходов фрOM различные доступные инструменты, некоторые из которых уже включены в общественном сервере Galaxy, настоятельно рекомендуется. Тем не менее, анализ в силикомарганца описано здесь должны быть пригодны для получения хороших результатов сравнения с высокими наборов данных качества. Как и во всех других областях в биологии, высокой пропускной последовательности возрастает в огромной количество информации, которое может быть получено из одного эксперимента, и способ, описанный здесь, является одним из способов его применения к изучению развития спинного мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
- Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
- Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
- Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 Forthcoming.
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
- Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
- Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40 (2008).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1982).
- Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).
- Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).
