Abstract
الكلى الجنينية من القيطم المورق (ضفدع)، وسليفة الكلوة، يتكون من كليون واحد، ويمكن استخدامها كنموذج لأمراض الكلى. الأجنة القيطم كبيرة، وتطوير خارجيا، ويمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق حقن مكروي أو العمليات الجراحية. وبالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء خرائط مصير لأجنة القيطم مبكرة. حقن مكروي المستهدفة في قسيم أرومي الفردية التي من شأنها أن تؤدي إلى عضو أو نسيج من الفائدة في نهاية المطاف يمكن استخدامها لبإفراط بشكل انتقائي أو هدم التعبير الجيني داخل هذه المنطقة المحظورة، والحد من الآثار الثانوية في بقية الجنين النامي. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية الاستفادة من إنشاء خرائط مصير القيطم لاستهداف القيطم الكلى تطوير (وسليفة الكلوة)، من خلال حقن مكروي إلى قسيم أرومي معين من الأجنة 4- و8 خلايا. حقن استشفاف النسب يسمح بالتحقق من استهداف معين من الحقن.بعد الأجنة قد وضعت لمرحلة 38-40، كلها جبل المناعية يستخدم لتصور تنمية سليفة الكلوة، ومساهمة من قبل خلايا تستهدف سليفة الكلوة يمكن تقييمها. يمكن تكييفها نفس الأسلوب لاستهداف أنواع الأنسجة الأخرى بالإضافة إلى سليفة الكلوة.
Introduction
الكلى الجنينية القيطم، وسليفة الكلوة، هو نموذج جيد لدراسة تطور أمراض الكلى و. تكوين الجنين من الخارج، كبيرة الحجم، يمكن أن تنتج بأعداد كبيرة، والتلاعب بها بسهولة من خلال حقن مكروي أو العمليات الجراحية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم حفظها الجينات التي تحكم تطور الكلى في الثدييات والبرمائيات. الكلى الثدييات التقدم من خلال ثلاث مراحل: سليفة الكلوة، mesonephros، والكلوة التالية 1، في حين البرمائيات الجنينية لديها سليفة الكلوة والبرمائيات الكبار لديهم الكلوة التالية. وحدة التصفية الأساسية لهذه الأشكال الكلى هي كليون، وكل من الثدييات والبرمائيات تتطلب نفس شلالات الإشارات والأحداث الاستقرائية للخضوع لتكون الكلية 2 و 3. وسليفة الكلوة القيطم يحتوي على كليون واحد يتألف من الداني والمتوسط والبعيد، وربط الأنابيب، والكبة (مشابهة لالكبيبة الثدييات) 1 و4-6 (الشكل 1 القيطم يجعلها مناسبة كنموذج بسيط لدراسة الجينات المسؤولة عن عمليات التنمية الكلى والأمراض.
وقد وضعت خرائط مصير خلية للأجنة القيطم في وقت مبكر، وتتوفر على الانترنت في Xenbase 7-11 بحرية. هنا، نحن تصف تقنية ل microinjection من استشفاف النسب لاستهداف سليفة الكلوة القيطم النامية، على الرغم من أن نفس الأسلوب يمكن تكييفها لاستهداف الأنسجة الأخرى مثل القلب أو العينين. استشفاف النسب هي تسميات (بما في ذلك الأصباغ الحيوية، dextrans fluorescently المسمى، والانزيمات التي يمكن اكتشافها الكيميائيه النسيجيه، ومرنا ترميز البروتينات الفلورية) التي يمكن حقنها إلى قسيم أرومي في وقت مبكر، والسماح للتصور من سلالة تلك الخلية خلال التنمية. يستخدم هذا البروتوكول MEM-طلب تقديم العروض مرنا، غشاء ترميز استهدف الحمراء بروتين فلوري 12، والتتبع النسب. التكنولوجيا حقن مكروي المستهدفةniques لعن Blastomeres الفردية في الأجنة 4- و8 خلايا وصفها هنا يمكن أن تستخدم للحقن مع morpholinos لاسقاط التعبير الجيني، أو مع RNA خارجي لبإفراط عن الجين من الفائدة. عن طريق حقن في بطني، قسيم أرومي النباتي، في المقام الأول سيتم استهدفت سليفة الكلوة من الجنين، وترك سليفة الكلوة المقابل كعنصر تحكم التنموية. شارك في حقن التتبع يتحقق من أن قسيم أرومي الصحيح تم حقن، والعروض التي أنسجة في الجنين نشأت من قسيم أرومي حقن، والتحقق من استهداف سليفة الكلوة. المناعية للسليفة الكلوة يسمح تصور مدى تم استهداف الأنابيب سليفة الكلوة. ويمكن بعد ذلك Overexpression وضربة قاضية الآثار أن سجل ضد الجانب المقابل للجنين، والتي هي بمثابة السيطرة التنموية، ويمكن استخدامها لحساب مؤشر سليفة الكلوة 13. توافر خرائط مصير خلية يسمح هذا الأسلوب حقن مكروي المستهدفة لاستخدامها لاستهداف الأنسجة أوراسكوم تليكوم القابضةإيه من سليفة الكلوة، وشارك في حقن التتبع الفلورسنت يسمح للحقن مكروي الموجه إلى كل الأنسجة ليتم التحقق منها قبل التحليل.
خلال حقن مكروي الجنين، ينبغي تنظيم درجة حرارة التنموية بإحكام، بالنظر إلى أن معدل التنمية القيطم يعتمد اعتمادا كبيرا عليها 14. يجب حضنت الأجنة في درجات الحرارة (14-16 درجة مئوية) لحقن 4- و8 خلايا وذلك لأن سرعة تطور الزمن إلى أسفل. في 22 درجة مئوية، والوقت اللازم لتطوير من المرحلة 1 (1 الخلية) إلى مرحلة 3 (4 خلايا) ما يقرب من 2 ساعة، بينما في 16 درجة مئوية وقت التطوير إلى مرحلة 3 ما يقرب من 4 ساعات. يستغرق حوالي 15 دقيقة من نهاية المباراة من جنين 4 خلايا إلى 8 خلايا (المرحلة 4) الجنين في 22 درجة مئوية، ولكن يستغرق حوالي 30 دقيقة في 16 درجة مئوية. وبالمثل، في 22 درجة مئوية، فإنه يأخذ فقط 30 دقيقة لجنين 8 خلايا للتقدم إلى جنين 16 خلية (المرحلة 5). ويزداد هذا الوقت إلى 45 دقيقة في 16 درجة مئوية. الrefore، من المفيد أن يتباطأ معدل نمو الأجنة لتمكين ما يكفي من الوقت لحقن في مرحلة 8 خلايا قبل التقدم الأجنة إلى مرحلة 16 خلية. بالإضافة إلى ذلك، ودرجات حرارة النمو يمكن أن يكون منظم لتسريع أو إبطاء التطور الجنيني حتى وضعت الكلى تماما.
البشرة من الشرغوف مرحلة الأجنة القيطم شفافة نسبيا، مما يسمح للتصوير السهل من سليفة الكلوة النامية دون تشريح أو إزالة الأنسجة 15. نظرا لشفافية النسبية للأجنة القيطم، ويعيش التصوير الخلية هو أيضا من الممكن 16،17. كامل جبل المناعية لتصور سليفة الكلوة من الممكن مع الأجسام المضادة ثبت أن تسمية القريبة والمتوسطة، القاصي وربط الأنابيب من مرحلة 38-40 الأجنة التي تسمح لتقييم التنمية سليفة الكلوة بعد استهداف التلاعب في التعبير الجيني في الأجنة القيطم 18-20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكول التالية من جامعة تكساس مركز العلوم الصحية في مركز هيوستن للالطب المخبري جنة الحيوان رعاية الحيوان، والتي هي بمثابة الرعاية المؤسسية واللجنة الاستخدام (بروتوكول #: شهادة الثانوية العامة الائتلاف المناهض للحرب-13-135).
1. تحديد واختيار عن Blastomeres لحقن المستهدفة الكلى
- قبل توليد الأجنة، استخدم الجدول العادي من القيطم التنمية 21 لفهم التوجه للانقسامات الخلية الأولى في الجنين. بدلا من ذلك، الرسوم البيانية الوصول للمراحل النمو المبكرة من القيطم على Xenbase 11.
- الوصول إلى القيطم خرائط مصير خلية التفاعلية على Xenbase 11 لتحديد أي قسيم أرومي ستستهدف ل microinjection.
- نلاحظ أن الجنين خلية واحدة لديه القطب الحيواني المصطبغة بحزن والقطب النباتي، لونه أبيض وyolky. لاحظ أن الغشاء الواقي، والمعروفة باسم المحي هnvelope، ويغطي الجنين.
- لاحظ أن الانقسام الأول يحدث عادة بين الجانبين الأيمن والأيسر من الجنين. هذه الخلايا تساهم بنفس القدر على النسب سليفة الكلوة.
- لاحظ أن الانقسام الثاني يقسم ظهري وبطني نصفين من الجنين، مما يؤدي إلى الجنين 4 خلايا. الخلايا الظهرية هي أصغر حجما والصباغ أقل من الخلايا بطني (الشكل 2A) والشكل (3A).
- تحديد عن Blastomeres البطنية (V، وكبيرة، زنازين مظلمة) على الجانبين الأيسر والأيمن، والتي تساهم أكثر لنمو الكلية من الظهرية (D، صغيرة، وخلايا ضوئية) عن Blastomeres (الشكل 2A).
- إذا حقن في جنين 4 خلايا، وضخ قسيم أرومي البطني الأيسر لاستهداف الكلية اليسرى (الشكل 3A والقسم 3).
- الشق الثالث يشطر الجانبين الحيوانية والنباتية، مما أدى إلى الجنين ثمانية الخلايا. في هذه المرحلة، وهناك أربعة عن Blastomeres الحيوان [اليسار واليمين بطني(V1) والظهرية (D1)] وأربعة عن Blastomeres النباتية [اليسار واليمين بطني (V2) والظهرية (D2)] (الشكل 2B والشكل 3B).
- تحديد موقع بطني، عن Blastomeres النباتية (V2). هذه عن Blastomeres أسهمت في الكلى تطوير أي خلايا أخرى في هذه المرحلة (الشكل 2B). لاستهداف الكلية اليسرى من جنين 8 خلايا، وضخ في V2 قسيم أرومي اليسار (الشكل 3B والقسم 3).
- لاحظ أن الانشقاقات الرابعة والخامسة شطر عن Blastomeres الحيوانية والنباتية. يتم إنشاء اثنين من ذرية من كل قسيم أرومي، مما أدى إلى الجنين 16 خلية. تتم تسمية الخلايا بعد السلف. على سبيل المثال، وقسيم أرومي V2 من مرحلة 8 خلايا يثير V2.1 وآله V2.2 في المرحلة 16 خلية (الشكل 2C). الخلية V2.2 في المرحلة 16 خلية توفر غالبية الخلايا المساهمة في الكلى النامية.
- ملاحظة الانشقاقات السادسة والسابعة تؤدي إلى امبري 32 خليةس. مرة أخرى، يتم إنشاء اثنين من ذرية من كل قسيم أرومي، التي تتم تسمية التالية سابقيهم. على سبيل المثال، وقسيم أرومي V2.2 من المرحلة 16 خلية يثير V2.2.1 وV2.2.2 في المرحلة 32 خلية. هناك نظام تسمية بديل في المرحلة 32-الخلية التي يتم تحديد الخلايا في الصفوف الأربعة كما A، B، C، و D (من الحيوان الى نباتية)، وأربعة أعمدة 1، 2، 3، 4 ( من ظهري إلى بطني). وهكذا، فإن قسيم أرومي V2.2.2، الأمر الذي يسهم في معظم لسليفة الكلوة النامية، ويسمى C3 في ظل هذا النظام تسمية بديل (الشكل 2D).
2. إعداد الأجنة
- تجهيز 50 مل من Dejelly الحل (2٪ السيستين، هيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة 8.0).
- عزل كل من الخصيتين من الضفادع الذكور واحد وفقا لبروتوكولات القياسية 14. وضع الخصيتين في صحن 60 ملم بيتري مليئة 10 مل الخصية حل التخزين (1X مارك في التعديل قارعو الأجراس [MMR؛ 0.1 M كلوريد الصوديوم، 2 مم بوكل، 1 ملي MgSO 4، 2 ممCaCl 2، 5 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 8، 0.1 ملي EDTA] 12، 1٪ زلال المصل البقري، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين). تخزين الخصيتين عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين الخصية ما يقرب من 7-10 أيام في 4 درجات مئوية، ولكن كفاءة التسميد يقلل من أطول تم تخزينها في الخصيتين. - يسجل الضفدع الإناث للحصول على البيض وفقا لبروتوكولات القياسية 14. جمع البيض في 100 مم طبق بيتري. تخلصي من أي المياه الزائدة.
- قطع ¼ من الخصية أثناء وجوده في الخصية حل التخزين باستخدام ملقط وشفرة حلاقة. نقل قطعة من الخصية إلى طبق بتري تحتوي على البيض. ضبط حجم الجزء الخصية تستخدم لحساب لحجم الخصية، متى تم تخزين الخصية، وعدد البيض هي أن المخصبة. عموما استخدام ¼ إلى 1/3 من الخصية تشريح حديثا لتخصيب مخلب واحد من البيض.
- وقطع جزء من الخصية إلى قطع صغيرة باستخدام ملقط وشفرة حلاقة. إضافة ما يكفي من MMR 0.3x+ 30 ملغ / مل الجنتاميسين على طبق بيتري لتغطية البيض. دوامة معدل وفيات الأمهات في صحن خلط.
- انتظر حوالي 30 دقيقة للإخصاب لتأخذ مكان في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أن نصف الكرة الحيوان (الجانب المصطبغة الجنين) سوف يجلس على رأس الجنين على الإخصاب فعال. ثم، إزالة معدل وفيات الأمهات من طبق بيتري باستخدام ماصة نقل. إضافة ما يكفي من الحل Dejelly إلى الطبق لتغطية الأجنة.
- خلال الدقائق القليلة القادمة، دوامة بلطف الطبق بشكل متقطع. اهتزاز قوي للطبق في هذا الوقت يمكن أن يسبب تشوهات محور. ومعطف هلام على الأجنة حل، وسوف الأجنة يتجمعون في وسط الطبق خلال دوامات. مرة واحدة الأجنة ولمس عن كثب بعضها البعض في وسط الطبق، وإزالة الحل Dejelly مع ماصة نقل. لا تترك الأجنة في حل Dejelly لفترة أطول من 5 دقائق، أو قد يكون معطوبا الأجنة.
- غسل الأجنة dejellied 3-5 مرات في 0.3xMMR + 30 ملغ / مل الجنتاميسين بصب بعناية أو pipetting لمن معدل وفيات الأمهات وملء الطبق مع MMR جديدة. لا تقم بإزالة كل من معدل وفيات الأمهات من الطبق، أو قد يكون معطوبا الأجنة.
- إزالة أي بويضة غير مخصبة أو قطعة من الخصية من طبق بيتري باستخدام ماصة نقل.
- احتضان الأجنة بين 14 و 22 درجة مئوية.
ملاحظة: الأجنة نمت في درجات حرارة منخفضة تتطور ببطء أكثر من الأجنة نمت عند ارتفاع درجات الحرارة. توقيت مراحل النمو يمكن الاطلاع على Xenbase 22.- إلى مساحة من تنميتها، وأبقى مكان نصف الأجنة من الإخصاب واحد في طبق بيتري في 14 درجة مئوية، والنصف الآخر من الأجنة في طبق بيتري أبقى عند 18 درجة مئوية. وهذا يسمح لمجموعتين من الحقن في 4 خلايا أو 8 خلايا الأجنة من الإخصاب واحد.
3. إعداد حلول حقن وMicroinjection من الأجنة
- تحضير محلول الحقن التي تحتوي على 0.01نانوغرام / نيكولا لانغ بروتين بغشاء أحمر فلوري (MEM-RFP) مرنا 9 في حين أن الأجنة تتطور إلى مرحلة 4 خلايا أو 8 خلايا. تخزين حل الحقن على الجليد حتى جاهزة للحقن.
- تحميل "الأنابيب الشعرية استبدال الزجاج في مجتذب إبرة، مع الجزء العلوي من الأنبوب استبدال تتماشى مع الجزء العلوي من حالة إبرة مجتذب. تعيين الحرارة # 2 القيمة إلى 800، وقيمة سحب إلى 650. اضغط على" 7 سحب "زر لسحب الإبرة. هذا سيخلق 2 الإبر من واحد 7" أنبوب زجاجي الشعرية.
- قص قبالة غيض من إبرة سحب مع زوج من ملقط دومون.
ملاحظة: بعد سحب الإبرة، وختم طرف مغلقة ويجب قطع مفتوحة. كلما اقتربنا من نقطة الإبرة التي قطع عليه، وأصغر من قطر ورأس الإبرة يكون. على الرغم من أن قطر طرف لن يؤثر على حجم الحقن مع نظام حقن مكروي المستخدمة هنا، وهي غيض التي يبلغ قطرها أكبر من المرجح أن تضر الجنين. - زلة مicropipette كوليت على الجزء الخلفي من الإبرة. المقبل، زلة كبيرة حفرة يا الدائري على الجزء الخلفي من الإبرة وراء كوليت.
- شغل الإبرة مع الزيوت المعدنية يستخدم قياس 27 إبرة تحت الجلد، والحرص على عدم الحصول على فقاعات الهواء في الإبرة.
- زلة الإبرة على المكبس من microinjector، جلوس الإبرة في ثقب كبير من هل بلاستيكية بيضاء مثبتة على المكبس. يجب أن يكون الغطاس صغيرة يا الدائري أقرب إلى الجسم من microinjector، يليه فاصل الأبيض، كبيرة حفرة يا الدائري، وكوليت. تأمين إبرة من خلال تشديد كوليت. برفق على الإبرة للتأكد من أن يتم تأمينها بشكل صحيح.
- اضغط مع الاستمرار على زر "فارغة" في السيطرة على المربع microinjector حتى هناك نوعان من الأصوات.
- ماصة 3 ميكرولتر من محلول الحقن على قطعة من بارافيلم. إدراج غيض من الإبرة في حبة من محلول الحقن على بارافيلم. اضغط مع الاستمرار على "ملء" الموجود على microiمربع التحكم njector لرسم حل حقن الإبرة.
- ملء طبق 60 ملم بيتري اصطف مع 500 ميكرون البوليستر شبكة مع 5٪ Ficoll في 0.3x MMR + 30 ملغ / مل الجنتاميسين. ماصة بعناية 20-30 أبريل خلية أو 8 خلايا الأجنة في طبق.
- باستخدام حلقة الشعر 14، والتلاعب في الأجنة بحيث قسيم أرومي ليتم حقنه تواجه الإبرة. لاستهداف الكلية اليسرى، يصطف الأجنة بحيث عن Blastomeres بطني اليسرى من الأجنة 4 خلايا أو اليسار عن Blastomeres V2 الأجنة 8 خلايا تواجه الإبرة.
- ضخ 10 NL حل الحقن في قسيم أرومي مختارة من كل جنين في الطبق.
ملاحظة: شبكة في الجزء السفلي من طبق بيتري تستقر الأجنة وتمنعهم من المتداول، والسماح لهم ليتم حقنه دون استخدام حلقة الشعر لتحقيق الاستقرار. - نقل حقن الأجنة في آبار لوحة الثقافة التي تم شغلها مع 5٪ Ficoll في 0.3x MMR + 30 ملغ / مل الجنتاميسين. احتضان الجنين حقنالصورة في 16 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح للعن Blastomeres حقن للشفاء.
- نقل الأجنة تلتئم في آبار لوحة الثقافة الجديدة التي تم شغلها مع 0.3x MMR + 30 ملغ / مل الجنتاميسين من المرحلة 9 (قبل تكون المعيدة).
- احتضان الأجنة في 14-22 درجة مئوية حتى الأجنة تصل إلى مرحلة 38-40 21.
4. التثبيت والمناعية من الأجنة
- تجهيز 50 مل من كبريتات اجتماعات الأطراف / EGTA / المغنيسيوم / الفورمالديهايد العازلة [MEMFA: 100 ملي اجتماعات الأطراف (7.4 درجة الحموضة)، 2 ملي EGTA، 1 ملي MgSO 4، 3.7٪ (ت / ت) الفورمالديهايد].
- باستخدام ماصة نقل، ووضع 10-20 مرحلة 38-40 الأجنة في قارورة زجاجية. إضافة 10 ميكرولتر 5٪ بنزوكاين في الإيثانول بنسبة 100٪ إلى القارورة وقلب قارورة لخلط. انتظر 10 دقيقة لتخدير الأجنة.
- إزالة معدل وفيات الأمهات من القارورة باستخدام ماصة الزجاج. إذا تجهيز قوارير متعددة في نفس الوقت، ويمكن عقد قارورة تستقيم في 24-جيدا لوحة الثقافة الخلية.
- مع أنابيب زجاجيةتتي، وملء قارورة مع MEMFA. ضع القارورة على منصة هزاز ثلاثية الأبعاد لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة MEMFA من القارورة باستخدام ماصة الزجاج. ملء قارورة مع الميثانول بنسبة 100٪. ضع القارورة على منصة هزاز ثلاثية الأبعاد لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة غسل واحد مزيد من الوقت، وتخزين الأجنة في الميثانول بنسبة 100٪ بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
- إعداد 1X الفوسفات مخزنة المالحة-الأبقار مصل الزلال-تريتون (PBT): برنامج تلفزيوني 1X، 2 ملغ / مل زلال المصل البقري، 0.1٪ تريتون X-100.
- إعداد حل الأجسام المضادة الأولية ما يلي: 1X PBT مع 10٪ مصل الماعز مع 1: 5 التخفيف من وحيدة النسيلة الماوس 4A6 الأجسام المضادة (لتسمية أغشية المتوسطة، القاصي وربط الأنابيب 20)، وتخفيف 1:30 من الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة 3G8 (لمعة تسمية الأنابيب القريبة 20)، والتخفيف 1: 250 الأرنب بولكلونل طلب تقديم العروض الأجسام المضادة (لتسمية التتبع MEM-RFP). تخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد SECONDAحل راي الأجسام المضادة هي: 1X PBT مع 10٪ مصل الماعز، 1: 500 اليكسا 488 الماعز المضادة للماوس مفتش (تركيز الأوراق المالية 2 ملغ / مل؛ والتسمية 4A6 و3G8)، و 1: 500 اليكسا 555 الماعز المضادة للأرنب مفتش (الأسهم تركيز 2 ملغ / مل؛ لتسمية التتبع MEM-RFP). مخزن في 4 درجات مئوية، وتغطي أنبوب في احباط للحماية من الضوء.
- بدلا من ذلك، وجمع الأجسام المضادة الأولية والثانوية بعد التلوين، وحفظ في 4 درجات مئوية لإعادة استخدامها في التجارب المستقبلية. إذا كانت الأجسام المضادة ليتم حفظها لإعادة استخدامها، إضافة 0.01٪ أزيد الصوديوم.
- Immunostain الأجنة باستخدام البروتوكولات المعمول بها (18).
5. التصور من الأجنة وتحليل المستهدفة الأنسجة سليفة الكلوة
- فحص الأجنة immunostained للتحقق من أن قسيم أرومي الصحيح تم حقن عن طريق عرض مضان من التتبع تحت مجهر تشريحي الفلورسنت في 1X (لمشاهدة الجنين كله) و5X (لعرض الكلى) التكبير. مكان الأجنة في لوحة من الزجاج متعددة بشكل جيد مع أنناقطع LLS مليئة 1X PBT باستخدام ماصة نقل مع بلاغ. معالجة الأجنة مع حلقة الشعر. استخدام الأجنة فقط التي لديها حقن شارك التتبع موجودة في سليفة الكلوة على الجانب الأيسر من الجنين (الشكل 3C، F والشكل 4C، F) ل overexpression الجينات أو تحليل ضربة قاضية.
- بدلا من ذلك، قم بإلغاء تحديد الأجنة في مسح موراي (2 أجزاء بنزوات البنزيل: 1 جزء البنزيل الكحول) عن طريق وضع الأجنة في قارورة زجاجية وملء قارورة واضح مع موراي. تصور أجنة باستخدام لوحة الزجاج جيدا.
ملاحظة: واضح موراي هو المذيبات العضوية، وينبغي التعامل معها بحذر. ارتداء قفازات، وإلا استخدام قوارير الزجاج والماصات واضح مع موراي. - تخزين الأجنة عند 4 درجات مئوية في 1X PBT ل2-3 أسابيع. للتخزين على المدى الطويل من الأجنة، يذوى الأجنة عن طريق غسل مرتين في الميثانول بنسبة 100٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تخزين الأجنة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في الميثانول بنسبة 100٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إبر دقيقة جدا من 4- و8 خلايا الأجنة القيطم مع MEM-طلب تقديم العروض مرنا تظهر مستويات مختلفة من استهداف للسليفة الكلوة. ويبين الشكل 4 المرحلة 40 الأجنة مع MEM-طلب تقديم العروض أنماط التعبير مرنا الصحيحة. تم حقن الأجنة في قسيم أرومي البطني الأيسر (الشكل 4A)، وفرزها عن نمط التعبير السليم للMEM-طلب تقديم العروض مرنا. بالإضافة إلى التعبير عن MEM-طلب تقديم العروض في القريبة والمتوسطة، القاصي وربط الأنابيب في الكلى، من المتوقع أن تظهر مضان في البشرة من الرأس، والجذع، وذيل حقن الأجنة بشكل صحيح. وينبغي أيضا أن تظهر مضان في الكيسة السمعية، غدة الاسمنت، المشرج، والقطع البدنية النمطية (الشكل 4C). تقرر توزيع مضان MEM-طلب تقديم العروض في الكلى من 8 حقن الأجنة بشكل صحيح مع مجهر تشريحي فلوري (الشكل 4B). الأجنة مع مستويات عالية من التعبير MEM-طلب تقديم العروض في البشرة التيمنعت الكشف عن مناطق الكلى وسجل باسم "المغطي". تم الكشف عن التعبير MEM-طلب تقديم العروض في الداني، الأنابيب وسيطة، القاصي وربط جميع الأجنة التي لم يحرز كما المغطي. واستخدمت المجسام (الشكل 4D-F) والمجاهر مبائر (الشكل 4G-I) للتحقق من شارك في توطين MEM-طلب تقديم العروض ونسيج الكلى immunostained مع 3G8 و4A6. التصوير متحد البؤر التحقق من شارك في توطين MEM-طلب تقديم العروض مع القريبة والمتوسطة، الأنابيب البعيدة وربط في الكلى، مشيرا إلى أن Microinjection من MEM-طلب تقديم العروض في قسيم أرومي البطني الأيسر يستهدف الكلى بشكل صحيح.
حقن الأجنة مع MEM-طلب تقديم العروض مرنا في مرحلة 8 خلايا (الشكل 5A) تظهر مدى أضيق من الأنسجة التي تظهر مضان، مشيرا إلى أن الحقن 8 خلايا تقلل من احتمالات الآثار الثانوية إلى الكلية. مثل حقن الأجنة في 4 خلايا المرحلة، EMBRحقن يوس في 8 خلايا عرض مسرحي مضان في القريبة والمتوسطة، الأنابيب البعيدة وربط في الكلى، وكذلك و somites والمشرج (الشكل 5C-F). وخلافا لحقن الأجنة في مرحلة 4 خلايا، وليس المسمى الغدة الاسمنت والكيسة السمعية مع MEM-طلب تقديم العروض. من أصل 10 الأجنة المستهدفة بشكل صحيح، وأظهر جنين واحد MEM-طلب تقديم العروض في كل ما يقرب من الأنابيب القريبة، و 3 أظهرت MEM-طلب تقديم العروض في كل ما يقرب من الأنابيب المتوسطة والبعيدة من الكلى (الشكل 5B). الأنابيب التي تربط من 7 الأجنة وصفت جزئيا مع MEM-طلب تقديم العروض. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الكلى من حقن الأجنة في مرحلة 8 خلايا أسهل للتصور، وسجل واحد فقط كما المغطي. تم تحديد شارك في توطين MEM-طلب تقديم العروض والأجسام المضادة وصفها الكلى (3G8 و4A6) باستخدام مجهر تشريحي (الشكل 5D-F)، والتحقق منها باستخدام مجهر متحد البؤر (الشكل 5G-I). والداني، وسيطة، القاصي وربط تووصفت bules في الكلى مع MEM-طلب تقديم العروض في حقن الأجنة في مرحلة 8 خلايا، مما يدل على أن تستهدف حقن قسيم أرومي V2 تسميات الكلى أثناء عرض مضان في أقل أنسجة من الأجنة المحقونة في قسيم أرومي البطني الأيسر في خلية 4 المسرح.
هذا الاختبار يجعل من استخدام الموسومة fluorescently مرنا كما التتبع والتي تشير إلى الأنسجة استهدفت حقن مكروي. من المهم فحص الاجنة لتوطين التتبع ثابت قبل التحليل، ويجب التخلص من أي الأجنة التي ليست عرض نمط توزيع التتبع المتوقع. ويبين الشكل 6 مثالا على الجنين المرحلة 40 التي كانت مستهدفة بشكل غير صحيح مع MEM-طلب تقديم العروض مرنا في المرحلة 4 خلايا. يقع التعبير مرنا MEM-طلب تقديم العروض على الجانب الأيمن من الجنين بدلا من الجانب الأيسر (الشكل 6A). وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم التعبير مرنا في الجلد من أسفل الجذع والذيل، معيذكر التعبير في و somites. وينظر إلى أي التعبير مرنا في القريبة والمتوسطة، القاصي وربط الأنابيب (الشكل 6B)، مؤكدا استهداف غير لائق في الكلى. ولذلك، لا ينبغي أن تستخدم هذا الجنين لتحليلها.
الشكل 1: القيطم الجنينية الكلى مخطط من الكلى لمرحلة 35 القيطم الجنين، والتي تبين القريبة والمتوسطة، البعيدة، وربط الأنابيب. وبناء على راسيتي وآخرون. (2008) 6. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: Xenopuالصورة خرائط مصير الجنينية. خرائط مصير تحديد وتسمية عن Blastomeres التي تساهم في سليفة الكلوة النامية. أ) خريطة مصير الجنين 4 خلايا. ب) خريطة مصير الجنين 8 خلايا. خريطة C) مصير الجنين 16 خلية. خريطة D) مصير الجنين 32 خلية. وصفت عن Blastomeres الجنين 32 خلية أيضا باستخدام نظام قسيم أرومي تسمية بديل. خرائط مصير استنادا موديز (1987) 8 و 9 و مودي وكلاين (1990) (7). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: برنامج حقن لاستهداف القيطم سليفة الكلوة السهام الحمراء تشير الخلية لحقن. أ) الحيوان والآراء البطنية من جنين 4 خلايا تظهر حقن ب بطني اليسرىlastomere لاستهداف سليفة الكلوة نقاط. وتشير السهام الحمراء قسيم أرومي بطني نقاط. ب) الحيوان والآراء البطنية للجنين 8 خلايا تظهر حقن قسيم أرومي V2 غادر لاستهداف سليفة الكلوة اليسرى. وتشير السهام الحمراء V2 قسيم أرومي نقاط. AB) صور الأجنة التي اتخذت بشأن المجسام في 4X التكبير. حقن بناء على مصير القيطم خرائط وضعت من قبل موديز (1987) 8 و 9 و مودي وكلاين (1990) (7). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: أمثلة من الأجنة المستهدفة في المرحلة 4 خلايا المرحلة Immunostained 40 الأجنة القيطم تظهر حقن تستهدف سليفة الكلوة اليسرى في مرحلة 4 خلايا باستخدام MEM-طلب تقديم العروض مرنا كما التتبع. تسميات MEM-طلب تقديم العروضأغشية الخلايا الحمراء. أ) تخطيطي حقن تبين من MEM-طلب تقديم العروض مرنا في قسيم أرومي البطني الأيسر من جنين 4 خلايا. ب) توطين الأنسجة من مضان MEM-طلب تقديم العروض في الكلى من الأجنة المحقونة بشكل صحيح. C) المرحلة 40 الجنين حقن مع MEM-طلب تقديم العروض في قسيم أرومي البطني الأيسر في مرحلة 4 خلايا. يظهر التعريب MEM-طلب تقديم العروض باللون الأحمر، في حين وصفت الكلى الأخضر. 1X التكبير. D) الكلى ملطخة 3G8 لتسمية تجويف الأنابيب القريبة، و4A6 لتسمية أغشية الخلايا في الأنابيب المتوسطة، القاصي والاتصال. 5X التكبير. E) توسيع المنطقة على مدى الكلى تظهر MEM-طلب تقديم العروض التعريب. 5X التكبير. F) مدموجة صورة تظهر شارك في توطين التتبع MEM-طلب تقديم العروض مع الكلى. 5X التكبير. CF) صور الأجنة التي تم التقاطها باستخدام كاميرا أوليمبوس DP71 على المجسام. G) صورة متحد البؤر الكلى من الجنين الثاني ملطخة 3G8 و4A6. H) توطين MEM-طلب تقديم العروض في الكلى والأنسجة المحيطة بها. I) مدموجة صورة شوالجناح المشارك توطين MEM-طلب تقديم العروض، 3G8، و4A6 في الكلى. GI) صور متحد البؤر باستخدام أقصى الإسقاط في 20X التكبير. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: أمثلة من الأجنة المستهدفة في المرحلة 8 خلايا المرحلة Immunostained 40 الأجنة القيطم تظهر حقن تستهدف سليفة الكلوة اليسرى في مرحلة 8 خلايا باستخدام MEM-طلب تقديم العروض مرنا كما التتبع. MEM-طلب تقديم العروض تسميات أغشية الخلايا الحمراء. أ) حقن تبين تخطيطي MEM-طلب تقديم العروض مرنا في قسيم أرومي V2 تبقى من الجنين 8 خلايا. ب) توطين الأنسجة من مضان MEM-طلب تقديم العروض في الكلى من الأجنة المحقونة بشكل صحيح. C) المرحلة 40 الجنين حقن مع MEM-طلب تقديم العروض في قسيم أرومي V2 الأيسر في مرحلة 8 خلايا. ويرد MEM-طلب تقديم العروض التعريب باللون الأحمر، في حين وصفت الكلى الأخضر. 1X التكبير. D) الكلى ملطخة 3G8 لتسمية تجويف الأنابيب القريبة، و4A6 لتسمية أغشية الخلايا في الأنابيب المتوسطة، القاصي والاتصال. 5X التكبير. E) توسيع المنطقة على مدى الكلى تظهر MEM-طلب تقديم العروض التعريب. 5X التكبير. F) مدموجة صورة تظهر شارك في توطين التتبع MEM-طلب تقديم العروض مع الكلى. 5X التكبير. CF) صور الأجنة التي تم التقاطها باستخدام كاميرا أوليمبوس DP71 على المجسام. G) صورة متحد البؤر الكلى من الجنين الثاني ملطخة 3G8 و4A6. H) توطين MEM-طلب تقديم العروض في الكلى والأنسجة المحيطة بها. I) مدموجة صورة تظهر شارك في توطين MEM-طلب تقديم العروض، 3G8، و4A6 في الكلى. GI) صور متحد البؤر التي يتم التقاطها باستخدام أقصى الإسقاط في 20X التكبير. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
في الصفحة = "1"> 
الشكل 6: مثال على الجنين المستهدفة بشكل غير صحيح في مرحلة 4 خلايا Immunostained المرحلة 40 القيطم الجنين يظهر استهداف غير صحيح من سليفة الكلوة اليسرى في مرحلة 4 خلايا باستخدام MEM-طلب تقديم العروض مرنا كما التتبع. MEM-طلب تقديم العروض تسميات أغشية الخلايا الحمراء. أ) المرحلة 40 الجنين تظهر التوزيع غير لائق من MEM-طلب تقديم العروض يدل على الحقن في قسيم أرومي غير صحيح. بالإضافة إلى وجود توزيع التتبع غير صحيح مشيرا إلى الحقن في قسيم أرومي غير صحيح، تم حقن هذا الجنين على الجانب الأيمن. 1X التكبير. ب) صورة مدموجة في الكلى مما يدل على عدم وجود المشارك توطين MEM-طلب تقديم العروض مع الأجسام المضادة وصفها الكلى (3G8، 4A6). 5X التكبير. AB) صور الجنين المتخذة بشأن المجسام. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استهداف سليفة الكلوة تطوير الأجنة القيطم تعتمد على تحديد وحقن قسيم أرومي الصحيح. حقن قسيم أرومي V2 الأجنة 8 خلايا يستهدف سليفة الكلوة اليسرى (18). هذا يترك سليفة الكلوة اليمنى المقابل باعتبارها الرقابة الداخلية. إذا morpholino ضربة قاضية أو يستخدم overexpression RNA لتغيير وضع الكلى، وسليفة الكلوة اليمنى المقابل يمكن استخدامها لمقارنة آثار ضربة قاضية الجينات أو overexpression على سليفة الكلوة اليسرى. في هذه الحالة، والضوابط المناسبة مثل morpholino السيطرة متطابقة أو المهيمن بناء RNA سلبي ينبغي أن تستخدم بالإضافة إلى الرقابة الداخلية المقابل لتحليل نتائج التغيرات في التعبير الجيني. نظرا لشفافية النسبية للجنين القيطم، عيوب الكلى يمكن قياسها بسهولة باستخدام تقنيات متعددة. على سبيل المثال، ضربة قاضية الجينات أو overexpression يمكن كميا ببساطة عن طريق حساب مؤشر سليفة الكلوة الأجنةimmunostained مع الأجسام المضادة 3G8 13، الذي يقارن بين وضع الأنابيب القريبة على الجانبين حقن والسيطرة على الجنين. بالإضافة إلى دراسة تطوير سليفة الكلوة، هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة لاستهداف الأنسجة الأخرى عن طريق تحديد قسيم أرومي السليم لحقن باستخدام مصير أنشئت خرائط 7-10. وبالإضافة إلى استهداف أنواع الأنسجة الأخرى، ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لدراسة تطوير الكلى في مراحل مختلفة. بدا هذا البروتوكول في المرحلة 40 الأجنة ملطخة الأجسام المضادة 3G8 و4A6، الذي كشف عن نسيج الكلى متباينة. يمكن immunostained الأجنة الأصغر سنا مع الأجسام المضادة الكلى المختلفة، أو تعرض لفي الموقع التهجين 5 و 6 و 20. على سبيل المثال، يمكن للأجسام المضادة Lim1 كشف عن سليفة الكلوة تطوير 21 و 22. وبالمثل، lim1، pax8، والنصوص β hnf1- يمكن أن يكون الكشف عن وفي الموقع التهجين انطلاق في مرحلة 12.5 22-24 في وقت لاحق علامات التهجين الموضعي يمكن أن تستخدم لكشف مناطق مختلفة من الكلى في مراحل النمو اللاحقة. على سبيل المثال، تحقيقات مصممة للكشف عن التعبير عن nphs1، clckb، slc5a1، وatp1a1 في الكبة، القاصي وربط الأنابيب، الأنابيب القريبة، والكلى بأكمله، على التوالي، وقد وصفت 25، 5، 26، 27. تقييم الكلى عبر مراحل متعددة باستخدام الأجسام المضادة المختلفة أو تحليل الوضع الطبيعي في أن تسمح لفهم أفضل لكيفية يغير علاج تنمية الكلى.
واحد جانبا مهما من هذا البروتوكول هو الاختيار الصحيح والتعرف على قسيم أرومي ليتم حقنه. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية استهداف سليفة الكلوة عن طريق حقن قسيم أرومي V2 الأيسر من الأجنة 8 خلايا أو قسيم أرومي البطني الأيسر من الأجنة 4 خلايا. إذا تم حقن قسيم أرومي غير صحيح، وسليفة الكلوة لن تكون موجهة بشكل صحيح. وبالتالي، فإنهأمر بالغ الأهمية للتعرف على الطائرات تنمية والانقسام الخلوي من أجنة القيطم المبكرة قبل حقن مكروي 28 و 29. انقسام الجنين لا تتبع دائما المنشأة المخططات مرحلة التطوير، لذلك فإنه من المفيد أن فقط حقن الأجنة التي الانشقاقات الخلية الأولى تبدو "طبيعية" وقسيم أرومي السليم يمكن التعرف عليها بسهولة. هذا سيقلل من عدد الأجنة التي تم استهدافها بشكل غير صحيح. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم أيضا لعن Blastomeres الجنين تقسم تماما في ذلك الوقت من الحقن. على سبيل المثال، إذا كان الانقسام بين عن Blastomeres V1 و V2 للجنين 8 خلايا ليست كاملة قبل حقن مكروي، قد ينتشر التتبع في V1 وكذلك V2. هذا من شأنه أن يقلل من كفاءة استهداف حقن مكروي، والجنين الناتج قد تظهر توزيع التتبع التي تبدو أكثر مماثلة لتلك التي من الجنين حقن في مرحلة 4 خلايا بدلا من مرحلة 8 خلايا.
لجزء هام آخر من هذا البروتوكول هو التحقق من أن سليفة الكلوة كان مستهدفا بشكل صحيح عن طريق حقن مكروي. يجب أن يتم ذلك قبل تحليل تطور سليفة الكلوة، لأن الأجنة التي لم يكن لها وسليفة الكلوة المستهدفة بشكل صحيح قد تحرف مجموعة البيانات الناتجة عن ذلك. للتحقق من استهداف السليم، وتحليل توزيع التتبع في كل جنين حقن. وحقن (يسار) جانب من الجنين يجب أن يعرض على الغالبية العظمى من التتبع الفلورسنت. وإذا كان الجانب السيطرة (يمين) من جنين يظهر قدرا كبيرا من مضان، ثم هذا الجنين يجب التخلص. إذا حدث هذا، تم حقن إما قسيم أرومي غير صحيحة، أو قسيم أرومي حقن لم تستكمل المشقوق قبل الحقن. ثانيا، مضان على (يسار) الجانب حقن الجنين يجب أن تستهدف سليفة الكلوة بشكل صحيح. إذا تم حقن الجنين في مرحلة 8 خلايا، وظهري وبطني القطع البدنية النمطية، لوحة الجانبية، المعى المؤخر، المشرج، من المتوقع أن تظهر انفلونزا الجلد من الجذع وقمة العصبية في جذعorescence بالإضافة إلى سليفة الكلوة 6، 29. وبالإضافة إلى الأنسجة المدرجة لحقن 8 خلايا، حقن الأجنة في مرحلة 4 خلايا ينبغي أن يكون التوزيع على نطاق أوسع من التتبع الفلورسنت في الجلد والقطع البدنية النمطية وكذلك استهداف غدة الاسمنت، الكيسة السمعية، عدسة واللوحاء حاسة الشم. إذا لم يكن الجنين عرض استهداف النسيج السليم، فإنه يجب التخلص منها قبل التحليل (الشكل 5).
الحقن المستهدفة الموصوفة في هذا البروتوكول توفر وسيلة لمعالجة التعبير الجيني في الأنسجة المطلوب. وجود قيود على هذا الأسلوب هو أنه على الرغم من استهداف هذه الحقن، فإنها لا تؤثر فقط على الكلى النامية. و4- و8 خلايا الحقن وصفها في هذه التقنية هي أكثر استهدافا من حقن به في مرحلة وحيدة الخلية، حيث سيتم تغيير التعبير الجيني في الجنين بأكمله، وحقن القيام به في مرحلة خلية اثنين، حيث نصف يعرض الجنين تغيير صريحة الجينأيون. لم يفعلوا ذلك، ومع ذلك، استهداف الأنسجة واحد فقط. على الرغم من أن الحقن في بطني عن Blastomeres الأجنة 4 خلايا وعن Blastomeres V2 الأجنة 8 خلايا تغير التعبير الجيني في سليفة الكلوة، كما أنها تغير التعبير الجيني في الأنسجة الأخرى. وتشمل الأنسجة المتضررة الأخرى الجلد، والقطع البدنية النمطية، القناة الهضمية، وقمة العصبية. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم أنه على الرغم من الحقن 4- و8 خلايا أكثر استهدافا من واحد أو خلية حقنتين، فإنها لا تزال تغير التعبير الجيني في أنسجة متعددة. بالإضافة إلى حقن الأجنة في 4- و8 خلايا مراحل، والحقن، ويمكن أيضا أن يؤديها في المراحل 2-، 16-، و 32 خلية. وحقن الأجنة في مرحلة 2-خلية لديها مجموعة واسعة من الأنسجة المتضررة من حقن الأجنة في مراحل لاحقة. على الرغم من أن أكثر تحديا من الناحية التقنية، وحقن الأجنة في 16- و 32 خلية مراحل لديها مجموعة أضيق من الأنسجة المتضررة من حقن الأجنة في المراحل 4- و8 خلايا.
وMEM-طلب تقديم العروض نسب ضئيلةيستخدم (ص) في هذا البروتوكول للتحقق من الاستهداف الصحيح بعد حقن مكروي. MEM-طلب تقديم العروض مرنا تسميات أغشية الخلايا بعد الخلايا ترجمت البروتين من الحمض النووي الريبي حقن. ينبغي تعديل تركيز MEM-طلب تقديم العروض النسب التتبع المستخدمة في هذا البروتوكول (0.1 نانوغرام من MEM-طلب تقديم العروض مرنا في حقن نيكولا لانغ 10) حسب الحاجة لحساب موت الجنين والمطلوب شدة مضان التتبع. بالإضافة إلى تعديل كمية من التتبع نسب حقن، نسب التتبع مختلفة، مثل رودامين-ديكستران، النقاط الكمومية، أو اكتشاف الكيميائيه النسيجيه β غالاكتوزيداز، يمكن أن تستخدم بدلا من MEM-طلب تقديم العروض. تصبح استشفاف النسب أكثر المخففة كما تنقسم الخلايا، مما تسبب في مستويات مضان في الانخفاض كلما تطور الجنين. طلب إضافي من هذه التقنية هو أن تشارك في حقن لRNA خارجي أو morpholino مع التتبع نسب إلى بإفراط أو هدم تعبير عن الجينات في المصالح. يتم استخدام التتبع النسب للتحقق من الاستهداف الصحيح للسليفة الكلوة، ولكن ليسللإشارة حيث حقن شارك RNA خارجي أو morpholino يموضع في الجنين. قد لا تنتشر RNA خارجي وmorpholinos من خلال قسيم أرومي حقن في نفس معدل التتبع حقن المشترك، ما قد يؤدي في الخلايا الوليدة التي لها التتبع ولكن ليس الحمض النووي الريبي خارجي أو الحاضر morpholino 30. في الواقع، لاحظنا أن اثنين من بنيات RNA مختلفة حقنها في خلية واحدة لا دائما المشارك المعربة (بيانات غير منشورة). وبالتالي، وجود التتبع في زنزانة لا يعني بالضرورة أن الحمض النووي الريبي خارجي حقن المشارك أو morpholino هو الحاضر دائما في تلك الخلية.
تفاصيل هذا البروتوكول إجراء لاستهداف حقن مكروي لعن Blastomeres التي تؤدي إلى سليفة الكلوة تطوير الأجنة القيطم. وغالبا ما تتلاعب التعبير الجيني في الأجنة القيطم من خلال حقن morpholinos أو RNA خارجي، وكلاهما يمكن أن تمنع قضية الشذوذ التنموية في وقت مبكر إذا حقنت في واحد أوالأجنة خلايا اثنين. حقن الأجنة في مرحلة واحدة الخلية ضربة قاضية المعرض أو overexpression في كل من خلايا الجنين النامي. إذا كان الجين ضروري لعمليات التنمية المبكرة المناسبة، قد يكون الجنين عدم وضع سليفة الكلوة. حقن أجريت في مراحل لاحقة، مثل حقن 8 خلايا مفصلة هنا، يمكن أن يؤدي إلى الأجنة التي تخضع لتكون المعيدة والتنمية سليفة الكلوة في نهاية المطاف 18. لذلك، يمكن حقن المستهدفة مناقشتها هنا التغلب على العيوب تكون المعيدة الناجمة عن تغيير في التعبير عن بعض الجينات، مما يسمح للجنين أن تقدم من خلال تطوير سليفة الكلوة. في المستقبل، يمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لاستهداف البنى كريسبر لعن Blastomeres المطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة NIDDK (K01DK092320) وتمويل بدء التشغيل من قسم طب الأطفال في جامعة تكساس مدرسة ماكغفرن الطبية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27 G Monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 ml Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell Culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label kidney tubules. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 Cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional - for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional - for clearing embryos |
References
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
- Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
- Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
- Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
- Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
- Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
- Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
- Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
- Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
- Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R.
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
- Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
- Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
- Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
- Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
- Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
- Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).
