Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח Published: May 3, 2016 doi: 10.3791/53799
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2,3,4
1Department of Pediatrics, Pediatric Research Center, University of Texas McGovern Medical School, 2Program in Genes & Development, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 3Program in Cell & Regulatory Biology, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 4Department of Genetics, University of Texas MD Anderson Cancer Center

Abstract

הכליה העוברית של Xenopus laevis (צפרדע), את כִּליַת רֵאשִׁית, מורכב נפרון יחיד, והוא יכול לשמש כמודל למחלת כליות. עוברי Xenopus הם גדולים, לפתח חיצונית, ניתן להשפיע בקלות על ידי microinjection או הליכים כירורגיים. בנוסף, מפות גורל הוקמו עבור עוברי Xenopus מוקדם. microinjection ממוקד לתוך blastomere הפרט כי בסופו של דבר יהיה להצמיח איבר או רקמה של עניין ניתן להשתמש כדי overexpress או להפיל ביטוי גנים באופן סלקטיבי בתוך האזור המוגבל הזאת, הפחתת השפעות משניות בשאר העובר המתפתח. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנצל מפות גורל Xenopus הוקמה כדי למקד את הכליה Xenopus פיתוח (להלן כִּליַת רֵאשִׁית), באמצעות microinjection לתוך blastomere ספציפיים של עוברים תאים 8 4 ו. הזרקה של קליעי נותבים שושלת מאפשרת אימות של המיקוד הספציפי של הזריקה.לאחר עוברים פתחו לשלב 38 - 40, כל הר immunostaining משמש כדי לחזות התפתחות pronephric, והתרומה ידי תאים ממוקדים אל כִּליַת רֵאשִׁית ניתן להעריך. באותה טכניקה ניתן להתאים למקד סוגי רקמות אחרות בנוסף כִּליַת רֵאשִׁית.

Introduction

הכליה העוברית Xenopus, את כִּליַת רֵאשִׁית, הוא מודל טוב ללימוד פיתוח כליות ומחלות. עובר לפתח חיצוני, הם גדולים, יכולים להיות מיוצרים בכמויות גדולות, והם מניפולציות בקלות באמצעות microinjection או הליכים כירורגיים. בנוסף, הגנים לפיקוח על בניית כליות אצל יונקים ודו-חיים הם משומר. כליות יונקות להתקדם דרך שלושה שלבים: כִּליַת רֵאשִׁית, הכליה, ו metanephros 1, בעוד דו חיים עובריים כִּליַת רֵאשִׁית ודו-חי בוגרים יש metanephros. יחידת הסינון הבסיסית של צורות כליות אלה היא נפרון, ושניהם יונקים ודו-חיים דורשים את אותה מפלי איתות ואירועים אינדוקטיביים לעבור nephrogenesis 2, 3. כִּליַת רֵאשִׁית Xenopus מכילה נפרון בודד מורכב הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules, וכן glomus (מקביל ל glomerulus היונק) 1, 4-6 (איור 1 Xenopus כִּליַת רֵאשִׁית הופך אותו מתאים כמודל פשוט לחקר הגנים המעורבים בתהליכי פיתוח כליות ומחלות.

מפות גורל התא הוקמו עבור עוברי Xenopus מוקדם, והם זמינים באופן חופשי באינטרנט ב Xenbase 7-11. כאן אנו מתארים טכניקה microinjection של קליעים נותבים השושלת למקד את כִּליַת רֵאשִׁית Xenopus פיתוח, אם כי באותה טכניקה ניתן להתאים למקד ברקמות אחרות כגון הלב או העיניים. קליעים נותבים השושלת הם תוויות (כולל צבעים חיוניים, dextrans שכותרתו fluorescently, אנזימים לגילוי histochemically, ו mRNA קידוד חלבוני ניאון) כי ניתן להזריק לתוך blastomere מוקדם, המאפשר הדמיה של הצאצאים של התא במהלך ההתפתחות. פרוטוקול זה מנצל mRNA MEM-RFP, קרום קידוד ממוקד חלבון פלואורסצנטי אדום 12, כמו נותב השושלת. טק microinjection הממוקדniques עבור בלסטומרים בודדים עוברים 4 ו 8 תאים המתואר כאן יכול להיות מנוצל להזרקה עם morpholinos להפיל ביטוי גנים, או עם RNA אקסוגני overexpress הגן של עניין. באמצעות הזרקה לתוך blastomere הגחון, הצמחי, בעיקר כִּליַת רֵאשִׁית של העובר תהיה ממוקדת, עוזבת את כִּליַת רֵאשִׁית הנגדית כביקורת התפתחותית. שיתוף ההזרקה נותב מוודאת כי blastomere הנכון הוזרק, ומופעים אשר רקמות בעובר נבעו blastomere המוזרק, אימות מיקוד של כִּליַת רֵאשִׁית. Immunostaining של כִּליַת רֵאשִׁית מאפשר הדמיה של מידת הצלחה של tubules pronephric היה ממוקד. תופעות התבטאות יתר ו מציאה אז יכול להיות הבקיע נגד הצד הנגדי של העובר, אשר משמש כביקורת התפתחותי, והוא יכול לשמש כדי לחשב את מדד pronephric 13. הזמינות של מפות גורל התא מאפשרת טכניקת microinjection ממוקדת זה כדי לשמש יעד רקמות othאה מאשר כִּליַת רֵאשִׁית, ואת שיתוף ההזרקה נותב ניאון מאפשר microinjection המתמקדת בכל רקמות להיות מאומתת לפני הניתוח.

במהלך microinjection העובר, טמפרטורה התפתחותי צריכה להיות מוסדרת בחוזקה, בהתחשב בכך את קצב התפתחות Xenopus תלוי מאוד עליו 14. עובר צריך להיות מודגרות בטמפרטורות קרירות (14 - 16 מעלות צלזיוס) במשך 4 ו זריקות 8 תאים כי זמן הפיתוח הוא האטה. בגיל 22 ° C, זמן הפיתוח מ -1 הבמה (תא 1) לביים 3 (4 תאים) הוא כ 2 שעות, תוך 16 ° C זמן הפיתוח לשלב 3 הוא כ 4 שעות. זה לוקח בערך 15 דקות לסיום מעובר 4 תאים לעובר 8 תאים (שלב 4) על 22 מעלות צלזיוס, אבל לוקח בערך 30 דקות על 16 מעלות צלזיוס. באופן דומה, על 22 מעלות צלזיוס, זה לוקח רק 30 דקות עבור עובר 8 תאים כדי להתקדם עובר 16 תאים (שלב 5). הפעם הוא עלה ל 45 דקות ב 16 מעלות צלזיוס. הrefore, כדאי להאט את קצב הפיתוח של עוברים כדי לאפשר מספיק זמן עבור זריקות בשלב 8 תאים לפני העוברים להתקדם לשלב 16 תאים. בנוסף, בטמפרטורות צמיחה יכולות להיות מווסתות כדי להאיץ או להאט התפתחות עוברית עד הכליות פתחו באופן מלא.

האפידרמיס של עובר ראשן שלבית Xenopus הוא יחסית שקוף, המאפשר הדמיה קלה של כִּליַת רֵאשִׁית בפיתוח בלי דיסקציה או סליקה של הרקמה 15. בשל השקיפות היחסית של עוברי Xenopus, הדמיה תא חי הוא גם אפשרי 16,17. כל הר immunostaining לדמיין את כִּליַת רֵאשִׁית אפשרי עם נוגדנים נקבע כי התווית הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי ו tubules חיבור של שלב 38 - 40 עוברים המאפשרים הערכת התפתחות pronephric ממוקד לאחר מניפולציה של ביטוי גנים העוברים Xenopus 18-20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הבא אושר על ידי האוניברסיטה למדעי בריאות מרכז טקסס המרכז של יוסטון ועדת צער בעלי חיים לרפואה בחיות מעבדה, אשר ממשמשת לטיפול המוסדי ועדת שימוש (# פרוטוקול: HSC-AWC-13-135).

זיהוי 1. בחירה של בלסטומרים עבור זריקות כליות במיקוד

  1. לפני יצירה עוברת, השתמש הטבלה הרגילה של Xenopus פיתוח 21 כדי להבין את הכיוון של חלוקות התא מוקדם בעובר. לחלופין, דיאגרמות גישה של השלבים ההתפתחותיים המוקדמים של Xenopus על Xenbase 11.
  2. גש מפות גורל תא Xenopus האינטראקטיביות על Xenbase 11 כדי לבחור את blastomere יהיה ממוקד עבור microinjection.
  3. שימו לב כי העובר תא בודד יש מוט החיה פיגמנט כהה וקוטב צמחי, שהוא לבן yolky. שימו לב קרום מגן, המכונה e vitellinenvelope, מכסה את העובר.
  4. שים לב כי המחשוף הראשון מתרחש בדרך כלל בין הצדדים על ימין ועל שמאל של העובר. תאים אלה לתרום באופן שווה שושלת pronephric.
  5. ראוי לציין, כי המחשוף השני מחלק את הגב ואת החצאים גחון של העובר, מה שמוביל העובר 4 תאים. התאים מגבים הם קטנים ויש להם פחות פיגמנט מאשר תאי הגחון (איור 2 א ו איור 3 א).
    1. זהה את בלסטומרים הגחון (V; התאים גדול, כהה) בצדדים שמאל וימין, אשר תורמים יותר לכליה פיתוח מאשר הגבי (D; קטן, תאים אור) בלסטומרים (איור 2 א).
    2. אם הזרקת לעובר 4 תאים, להזריק את blastomere הגחון השמאלי כדי למקד את הכליה שמאלה (איור 3 א וסעיף 3).
  6. המחשוף השלישי חוצה את הצדדים בעלי חיים צמחיים, וכתוצאה מכך עוברת שמונה תאים. בשלב זה, ישנם ארבעה בלסטומרים חיה [שמאלה וימינה גחון(V1) ו הגבי (D1)] וארבעה בלסטומרים צמחיים [שמאל וימין גחון (V2) ו הגבי (D2)] (האיור 2B ו איור 3B).
    1. אתר את בלסטומרים הגחון, צמחיים (V2). בלסטומרים אלה תורמים יותר לכליה לפתח כל תאים אחרים בשלב זה (התרשים 2B). כדי למקד את הכליה השמאלית של עובר 8 תאים, להזריק לתוך blastomere V2 שמאלה (איור 3 ב וסעיף 3).
  7. שים לב כי השסעים הרביעיים וחמישיים החוצים את בלסטומרים בעלי החיים צמחי. שני צאצאים נוצרים מכל blastomere, וכתוצאה מכך העובר 16 תאים. התאים קרויים קודם שלהם. לדוגמה, blastomere V2 משלב 8 תאים מוליד V2.1 והצאצאים V2.2 בשלב 16 תאים (איור 2 ג). תא V2.2 בשלב 16 התאים מספק את רוב תאי תורם הכליה המתפתחת.
  8. הערת הניגודים שישית ושביעיים לגרום אמברי 32 תאיםo. שוב, שני צאצאים נוצרים מכל blastomere, אשר נקראים הבאים קודם שלהם. לדוגמה, blastomere V2.2 משלב 16 תאים מוליד V2.2.1 ו V2.2.2 בשלב 32 תאים. קיימת מערכת שמות חלופית בשלב 32-התא שבו תאים מזוהים בארבע שורות A, B, C, ו- D (בבעלים צמחי), ואת בארבעה טורים כמו 1, 2, 3, ו -4 ( מן הגב אל גחון). לפיכך, blastomere V2.2.2, אשר תורמת את המירב על כִּליַת רֵאשִׁית בפיתוח, נקרא C3 תחת מערכת שמות חלופה זו (איור 2 ד).

2. הכנה עוברת

  1. הכן 50 מ"ל של תמיסת Dejelly (2% ציסטאין, NaOH ל- pH 8.0).
  2. לבודד שני האשכים של צפרדע זכר יחידה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 14. מניחים את האשכים בצלחת פטרי 60 מ"מ מלא 10 מ"ל פתרון האשכים אחסון (אצבעות שונה של 1x מארק [MMR; 0.1 M NaCl, KCl 2 מ"מ, 1 מ"מ MgSO 4, 2 מ"מ2 CaCl, 5 מ"מ HEPES pH 8, 0.1 mM EDTA] 12, 1% אלבומין בסרום שור, 50 מיקרוגרם / מ"ל gentamycin). אחסן את האשכים ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: אשכים יכולים להיות מאוחסנים במשך כ 7 - 10 ימים על 4 מעלות צלזיוס, אך יעילות הפריה תקטנה ככל האשכים שאוחסנו.
  3. סוחטים צפרדע נקבה להשיג ביצים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 14. אסוף את הביצים בתוך צלחת פטרי 100 מ"מ. יוצקים את המים העודפים.
  4. חותכים ¼ של אשך בזמן שהוא נמצא האשכים פתרון אחסון באמצעות מלקחיים סכין גילוח. מעביר את פיסת האשך בצלחת פטרי המכילה ביצים. התאם את הגודל של חלק testis בשימוש לחשבון בהתאם לגודל של האשכים, כמה זמן לאשכים אוחסנו, וכמה ביצים יש מופרה. באופן כללי להשתמש ¼ 1/3 של testis גזור טרי לדשן מצמד אחד ביצים.
  5. חותכים את החלק testis לחתיכות קטנות באמצעות מלקחיים סכין גילוח. להוסיף MMR 0.3x מספיק+ 30 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin כדי בצלחת פטרי כדי לכסות את הביצים. מערבולת MMR בצלחת לערבב.
  6. יש להמתין כ 30 דקות להפריה להתקיים בטמפרטורת החדר. ראוי לציין, כי בחצי הכדור החי (בצד פיגמנט של העובר) מיישבים על גבי העובר על הפריה יעילה. לאחר מכן, הוציאו את MMR מצלחת פטרי בעזרת פיפטה ההעברה. הוסף מספיק פתרון Dejelly כדי בצלחת כדי לכסות את העוברים.
  7. במהלך הדקות הקרובות, בעדינות מערבולת הצלחת לסירוגין. טלטול נמרץ של המנה בשלב זה עלול לגרום למומים ציר.   מעייל הג'לי על העוברי יתמוסס, ואת העוברי יהיה להתאסף במרכז הצלחת במהלך מתערבל. לאחר העוברים עוקבים בדאגה נוגעים זה בזה במרכז של המנה, להסיר את פתרון Dejelly עם טפטפת העברה. אל תשאירו עוברי פתרון Dejelly למשך זמן ארוך יותר מ -5 דקות, או העוברים עלולים להינזק.
  8. לשטוף את העוברים dejellied 3 - 5 פעמים ב 0.3xMMR + 30 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin ידי שפיכת או pipetting בזהירות את MMR ומילוי את המנה עם חדש MMR. אל תסיר את כל MMR מצלחת, או עוברים עלולים להינזק.
  9. הסר את כל ביצים מופרות או פיסות אשך מצלחת פטרי בעזרת פיפטה העברה.
  10. דגירה עוברת בין C 14 ו -22 מעלות.
    הערה: עוברים גדל בטמפרטורות נמוכות לפתח לאט יותר עוברים גדל בטמפרטורות גבוהות. עיתוי שלבי ההתפתחות ניתן למצוא באתר Xenbase 22.
    1. לחלל את התפתחותם, חצי מקומה של העוברים מן הפריה אחת בצלחת פטרי שומרים על 14 מעלות צלזיוס, ואת החצי השני של העוברים בצלחת פטרי שומר על 18 מעלות צלזיוס. זה מאפשר לשני סטים של זריקות לתוך 4 תאים או 8 תאים העוברים מן הפריה אחת.

3. הכנת פתרונות הזרקת Microinjection של עוברים

  1. הכן את פתרון ההזרקה המכיל 0.01ng / NL קרום הנכנס חלבון פלואורסצנטי אדום (MEM-RFP) mRNA 9 בעוד העוברים מתפתחים לשלב 4 תאים או 8 תאים. אחסן את הפתרון הזרקת על הקרח עד מוכנים להזריק.
  2. טען "צינור נימי זכוכית החלפה לתוך חולץ מחט, כאשר החלק העליון של צינור ההחלפה מיושר עם החלק העליון של המקרה מחולץ מחט. הגדר את הערך # 2 חום ל -800, ואת תמורת המשיכה 650. לחץ על" 7 למשוך "על מנת למשוך את המחט. זו תיצור 2 מחטים מתוך 7 יחיד" שפופרת זכוכית נימים.
  3. לקטום את קצה מחט משך עם זוג מלקחיים דומון.
    הערה: לאחר משיכת המחט, קצה אטום עצומות וצריך לחתוך פתוח. קרוב יותר חוד המחט שזה הוא חתך, קטן יותר, בקוטר קצה המחט יהיה. למרות הקוטר של הקצה לא ישפיע על עוצמת הזריקה עם מערכת microinjection משמשת כאן, טיפ עם קוטר גדול יותר יש יותר סיכוי לפגוע בעובר.
  4. להחליק את מ 'קולט icropipette על חלקו האחורי של המחט. לאחר מכן, להחליק את O-Ring חור גדול על גבו של המחט מאחורי קולט.
  5. מלא את המחט עם שמן מינרלים באמצעות מחט מד 27 מזרק, נזהר שלא לקבל בועות אוויר בתוך המחט.
  6. להחליק את המחט על הבוכנה של microinjector, ישיבת המחט לתוך החור הגדול של spacer הפלסטיק הלבן מותקן על הבוכנה. הבוכנה צריכה להיות O-Ring קטן קרובה לגוף של microinjector, ואחריו spacer הלבן, O-Ring הבור הגדול, קולט. Secure את המחט על ידי הידוק הקולט. משוך בעדינות על המחט לוודא כי הוא מאובטח כראוי.
  7. לחץ לחיצה ממושכת על כפתור "ריק" על תיבת הבקרה microinjector עד ישנם שני צפצופים.
  8. פיפטה 3 μl של פתרון הזרקה גבי פיסת Parafilm. הכנס את קצה המחט לתוך החרוז של פתרון הזרקה על Parafilm. לחץ לחיצה ממושכת על "למלא" כפתור על microiתיבת בקרת njector לצייר פתרון הזריקה לתוך המחט.
  9. למלא צלחת פטרי 60 מ"מ מצופה 500 מיקרון פוליאסטר רשת עם 5% Ficoll ב MMR 0.3x + 30 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin. בזהירות פיפטה 20 - 30 4 תאים או 8 תאים העוברים לתוך הצלחת.
  10. באמצעות לולאת שיער 14, לתפעל את העוברים כך blastomere להיות מוזרק מתמודד עם המחט. כדי למקד את הכליה עזבה, בשורה עוברת כך בלסטומרים הגחון השמאליים של עובר 4 תאים או בלסטומרים V2 שנשארו עובר 8 תאים להתמודד עם המחט.
  11. להזריק 10 nl של פתרון הזרקה לתוך blastomere נבחרים כל העובר בצלחת.
    הערה: הרשת בתחתית צלחת פטרי מייצבת את העוברים ומונעת מהם מתגלגלים, ומאפשר להם להיות מוזרק ללא שימוש בלולאת שיער לייצוב.
  12. העברת מוזרק עוברים לתוך הבארות של צלחת תרבות מולאו עם 5% Ficoll ב MMR 0.3x + 30 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin. דגירה העוברת המוזרקs ב 16 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר בלסטומרים מוזרקים לרפא.
  13. מעבירים את העוברים נרפא לתוך בארות צלחת תרבות חדשה מולאו עם gentamycin 0.3x MMR + 30 מ"ג / מ"ל ​​על ידי שלב 9 (לפני gastrulation).
  14. דגירה עוברת בגיל 14 - C ° 22 עד העוברים מגיעים לשלב 38 - 40 21.

קיבוע 4. Immunostaining של עוברים

  1. הכן 50 מ"ל של מגבים / EGTA / סולפט מגנזיום / מאגר פורמלדהיד [MEMFA: 100 מ"מ מגבים (pH 7.4), 2 מ"מ EGTA, 1 מ"מ MgSO 4, 3.7% (v / v) פורמלדהיד].
  2. בעזרת פיפטה העברה, לשים 10 - 20 בשלב 38 - 40 העוברים בתוך בקבוקון זכוכית. הוסף 10 μl 5% benzocaine באתנול 100% כדי בקבוקון הבקבוקון להפוך לערבב. חכה 10 דקות כדי להרדים את העוברים.
  3. הסר את MMR מבקבוקון באמצעות פיפטה מזכוכית. אם עיבוד בקבוקונים מרובות בעת ובעונה אחת, צלוחיות ניתן זקוף בצלחת תרבית תאים 24 גם.
  4. עם מקטרת זכוכיתטטי, למלא את הבקבוקון עם MEMFA. מניחים את הצנצנת על פלטפורמת נדנדה תלת ממדי עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את MEMFA מבקבוקון באמצעות פיפטה מזכוכית. מלאו את הבקבוקון עם 100% מתנול. מניחים את הצנצנת על פלטפורמת נדנדה תלת ממדי עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת, ולאחסן את העוברים לילה מתנול 100% ב -20 ° C.
  6. הכן 1x בופר פוספט-שור סרום אלבומין-טריטון (PBT): PBS 1x, 2 מ"ג / חלבון בסרום שור מ"ל, 0.1% Triton X-100.
  7. הכן את הפתרון נוגדן ראשוני: 1x PBT עם 10% נסיוב עז עם דילול 1: 5 של חד שבטיים העכבר 4A6 נוגדן (לתייג את הקרומים של tubules ביניים, דיסטלי וחיבור 20), 01:30 דילול של נוגדן חד שבטי העכבר 3G8 (כדי לומן תווית של tubules הפרוקסימלי 20), ו דילול 1: 250 של נוגדן RFP ארנב polyclonal (לתייג נותב MEM-RFP). חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  8. הכן את secondaפתרון נוגדנים ר"י: 1x PBT עם 10% נסיוב עז, 1: 500 Alexa 488 עז אנטי עכבר IgG (ריכוז המניות 2 מ"ג / מ"ל; לתווית 4A6 ו 3G8), ו -1: 500 Alexa 555 עיזים IgG נגד ארנב (מלאי ריכוז 2 מ"ג / מ"ל; לתייג נותב MEM-RFP). חנות ב 4 ° C, כיסוי הצינור בנייר כדי להגן מפני אור.
  9. לחלופין, לאסוף את נוגדנים ראשוניים ומשניים לאחר צביעה, ולשמור על 4 מעלות צלזיוס לשימוש חוזר בניסויים עתידיים. אם הנוגדן הוא להינצל לשימוש חוזר, להוסיף אזיד הנתרן 0.01%.
  10. Immunostain את העוברים באמצעות פרוטוקולים הוקמו 18.

ויזואליזציה 5. עוברים והניתוח של רקמות Pronephric ממוקדות

  1. מסך את העוברים immunostained לאמת כי blastomere הנכון הוזרק על ידי הצגת הקרינה של נותב תחת סטראו פלורסנט ב 1X (כדי להציג העובר כולו) 5X (כדי להציג כליות) הגדלה. עובר מקום בצלחת זכוכית רב גם עם אנחנוLLS מלא 1x PBT בעזרת פיפטה העברת עם קצה לחתוך. לתפעל את העוברים עם לולאת שיער. השתמש רק עוברים אשר יש בהווה נותב מוזרק שיתוף ב כִּליַת רֵאשִׁית בצד השמאלי של העובר (איור 3 ג, ו 'ו איור 4C, F) עבור ביטוי יתר גנים או ניתוח מציאה.
  2. לחלופין, לנקות את העוברים נקה של מאריי (2 חלקים בנזיל בנזואט: 1 חלק בנזיל אלכוהול) על ידי הצבת את העוברים בתוך צנצנת זכוכית וממלאים את הבקבוקון עם נקה של מאריי. דמיינו את העוברים באמצעות צלחת גם זכוכית.
    הערה: נקה של מאריי הוא ממיס אורגני, וצריך לטפל בהם בזהירות. יש להשתמש בכפפות, ורק להשתמש צלוחיות זכוכית ו טפטפות עם נקה של מאריי.
  3. עוברים חנות ב 4 מעלות צלזיוס 1x PBT במשך 2 - 3 שבועות. עבור אחסון לטווח ארוך של עוברים, ליבש את העוברים על ידי שטיפה פעמיים מתנול 100% בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. אחסן את העוברים ב -20 ° C. מתנול 100%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Microinjections של 4 ו-תאים 8 עוברי Xenopus עם mRNA MEM-RFP להראות רמות שונות של מיקוד אל כִּליַת רֵאשִׁית. איור 4 מראה הבמה 40 עוברים עם דפוסי ביטוי mRNA MEM-RFP הנכון. עובר הוזרקו ב blastomere הגחון השמאלי (איור 4 א), מיון עבור דפוס הביטוי ההולם של mRNA MEM-RFP. בנוסף להביע MEM-RFP ב הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules של הכליה, עוברים מוזרק כראוי צפויים להראות הקרינה באפידרמיס של הראש, חדק, והזנב. הם צריכים גם להראות הקרינה otocyst, בלוטת מלט, proctodeum, ו somites (איור 4C). התפלגות הקרינה MEM-RFP בכליות של 8 עוברים מוזרק כראוי נקבע עם סטראו ניאון (איור 4 ב). עוברים עם רמות גבוהות של ביטוי MEM-RFP באפידרמיס כיזיהוי חסומים של אזורי כליות דורג כמו "האפיל". ביטוי MEM-RFP זוהה הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules של כל העוברים שלא דורגו כמו האפילו. Stereoscope (איור 4D-F) ומיקרוסקופים confocal (איור 4G-I) שימשו כדי לאמת את רקמת שיתוף לוקליזציה של MEM-RFP וכליות immunostained עם 3G8 ו 4A6. הדמית Confocal אומתה לוקליזציה השיתוף של RFP MEM עם הפרוקסימלי, ביניים, מבנים צינוריים וחיבור של הכליה, המציין כי microinjection של RFP MEM לתוך blastomere גחון השמאל כראוי מטרות הכליה.

עוברים מוזרק עם MEM-RFP mRNA בשלב 8 תאים (איור 5 א) להראות בטווח צר של הרקמות מוצגות הקרינה, המציין כי זריקות 8 תאים לצמצם את פוטנציאל השפעות משניות לכליה. כמו עובר מוזרקים בשלב 4 תאים, embryos מוזרק קרינת צג 8 תאי השלב הפרוקסימלי, ביניים, מבנים צינוריים וחיבור של הכליה, כמו גם את somites ו proctodeum (איור 5 ג-ו). בניגוד עוברים מוזרק בשלב 4 תאים, בלוטת מלט otocyst לא מסומנים עם-RFP MEM. מתוך 10 עוברים ממוקד כראוי, עובר אחד הראה MEM-RFP כמעט כל tubules הפרוקסימלי, ו -3 הראה MEM-RFP כמעט כל tubules ביניים הדיסטלי של הכליה (איור 5). צינוריות חיבור של 7 עוברים תויגו חלקית עם-RFP MEM. בנוסף, הכליות של עוברים מוזרקים בשלב 8 התאים היו יותר קלות לדמיין, ורק אחד נכבש על כמו האפיל. שיתוף לוקליזציה של MEM-RFP ונוגדני תיוג הכליה (3G8 ו 4A6) נקבעה באמצעות סטראו (איור 5D-F), ואומתה באמצעות מיקרוסקופ confocal (איור 5G-I). הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules של הכליה תויג עם-RFP MEM בעוברים מוזרקים בשלב 8 תאים, הוכחה כי ממוקד הזרקת blastomere V2 תוויות הכליה תוך הפגנת קרינה ברקמות פחות מ עוברי מוזרק blastomere גחון השמאל על-התא 4 שלב.

assay זה עושה שימוש מתויג fluorescently mRNA כמו נותב כדי לציין אילו רקמות הותקפו על ידי microinjection. חשוב להקרין עוברים לוקליזציה נותב עקבית לפני הניתוח, וכל העוברים כי לא להציג את דפוס והפצה נותב הצפוי אמור להיות מושלך. איור 6 מציג דוגמה של העובר בשלב 40 כי היה ממוקד באופן שגוי עם MEM-RFP mRNA ב בשלב 4 תאים. ביטוי mRNA MEM-RFP ממוקם בצד ימין של העובר במקום בצד שמאל (איור 6 א). בנוסף, רוב ביטוי mRNA הוא בעור של המטען התחתון והזנב, עםביטוי קטן somites. אין ביטוי mRNA נתפס הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי ו tubules חיבור (איור 6), המאשר מיקוד לא תקין של הכליות. לכן, העובר הזה לא אמור לשמש לניתוח.

איור 1
איור 1:. כליה העוברית Xenopus תרשים של הכליה של עובר Xenopus שלב 35, מראה את הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי, וחיבור tubules. בהתבסס על Raciti et al. (2008) 6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: Xenopuהים עוברי גורל מפות. מפות גורל זיהוי ולתת שם בלסטומרים שתורמים כִּליַת רֵאשִׁית מתפתחת. א) מפת הגורל של עובר 4 תאים. B) גורל המפה של עובר 8 תאים. C) מפת הגורל של עובר 16 תאים. D) מפת הגורל של עובר 32 תאים. בלסטומרים של עובר 32 תאים מסומנים גם באמצעות מערכת שמות blastomere חלופית. מפות גורל מבוססות על מודים (1987) 8, 9 ו מודי קליין (1990) 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. Scheme הזרקת למיקוד Xenopus כִּליַת רֵאשִׁית החיצים האדומים מציינים את התא להזריק. א) בעלי חיים ונופי גחון של עובר 4 תאים מראים זריקה של b גחון השמאלlastomere למקד את כִּליַת רֵאשִׁית עזב. החיצים האדומים מציינים את blastomere הגחון עזב. B) בעלי חיים ונופים הגחון של העובר 8 תאים מראה זריקה של blastomere V2 עזב למקד את כִּליַת רֵאשִׁית שמאל. החיצים האדומים מציינים את blastomere V2 עזב. א.ב.) תמונות של עוברים לקחו על סטריאוסקופ בהגדלת 4X. הזריקות מבוססות על גורל Xenopus מפות שפותחו על ידי מודים (1987) 8, 9 ו מודי קליין (1990) 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. דוגמאות של עוברים הממוקדים בשלב 4 תאים בשלב immunostained 40 עוברי Xenopus מראים הזרקה ממוקדת כִּליַת רֵאשִׁית השמאל בשלב 4 תאים באמצעות MEM-RFP mRNA כמו נותב. תוויות MEM-RFPקרום תא אדום. א) הזרקת מראה סכמטי של mRNA MEM-RFP לתוך blastomere הגחון השמאלי של עובר 4 תאים. לוקליזציה B) רקמות של קרינת MEM-RFP בכליות של עוברים מוזרקים כראוי. ג) שלב 40 עובר מוזרק עם-RFP MEM ב blastomere גחון השמאל בשלב 4 תאים. לוקליזציה MEM-RFP מוצגת באדום, ואילו הכליות מסומנות ירוקות. הגדלת 1X. כליות D) מוכתמות 3G8 לתייג לומן של tubules הפרוקסימלי, ו 4A6 לתייג את ממברנות תאי tubules ביניים, דיסטלי וחיבור. הגדלת 5X. E) גדלה של האזור על הכליות מראות לוקליזציה MEM-RFP. הגדלת 5X. F) מוזג תמונה המציגה שיתוף לוקליזציה של נותב MEM-RFP עם הכליות. הגדלת 5X. CF) תמונות של עוברים שצולמו במצלמת DP71 אולימפוס על סטריאוסקופ. G) תמונת Confocal של הכליה של עובר שני מוכתם 3G8 ו 4A6. H) לוקליזציה של RFP MEM בכליות הרקמה שמסביב. I) מוזג תמונת shoשיתוף לוקליזציה כנף של MEM-RFP, 3G8, ו 4A6 בכליות. GI) תמונות Confocal באמצעות הקרנה מקסימלית 20X הגדלה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. דוגמאות של עוברים הממוקדים בשלב 8 תאים בשלב immunostained 40 עוברי Xenopus מראים הזרקה ממוקדת כִּליַת רֵאשִׁית השמאל בשלב 8 תאים באמצעות MEM-RFP mRNA כמו נותב. MEM-RFP תוויות קרום התא אדום. א) הזרקת מראה סכמטי של MEM-RFP mRNA לתוך blastomere V2 שנשאר עובר 8 תאים. לוקליזציה B) רקמות של קרינת MEM-RFP בכליות של עוברים מוזרקים כראוי. ג) שלב 40 העובר מוזרק עם-RFP MEM ב blastomere V2 שמאל בשלב 8 תאים. לוקליזציה MEM-RFP מוצגת באדום, ואילו הכליות מסומנות ירוקות. הגדלת 1X. כליות D) מוכתמות 3G8 לתייג לומן של tubules הפרוקסימלי, ו 4A6 לתייג את ממברנות תאי tubules ביניים, דיסטלי וחיבור. הגדלת 5X. E) גדלה של האזור על הכליות מראות לוקליזציה MEM-RFP. הגדלת 5X. F) מוזג תמונה המציגה שיתוף לוקליזציה של נותב MEM-RFP עם הכליות. הגדלת 5X. CF) תמונות של עוברים שצולמו במצלמת DP71 אולימפוס על סטריאוסקופ. G) תמונת Confocal של הכליה של עובר שני מוכתם 3G8 ו 4A6. H) לוקליזציה של RFP MEM בכליות הרקמה שמסביב. I) מוזגה תמונה המציגה שיתוף לוקליזציה של MEM-RFP, 3G8, ו 4A6 בכליות. GI) תמונות Confocal צולמו באמצעות הקרנה מקסימלית 20X הגדלה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ב-page = "1"> איור 6
איור 6: דוגמה של העובר ממוקד שגוי בשלב 4 תאים העובר immunostained שלב 40 Xenopus מראה מיקוד שגוי של כִּליַת רֵאשִׁית שמאל בשלב 4 תאים באמצעות MEM-RFP mRNA כמו נותב.. MEM-RFP תוויות קרום התא אדום. א) שלב 40 עובר מראה הפצה תקינה של-RFP MEM מעיד על הזריקה לתוך blastomere השגוי. בנוסף לזה שיש להם הפצה נותב שגויה המציין זריקה לתוך blastomere השגוי, עובר זה הוזרק בצד ימין. הגדלת 1X. B) התמונה הממוזגת של הכליה מראה חוסר שיתוף לוקליזציה של MEM-RFP עם נוגדנים תיוג הכליה (3G8, 4A6). הגדלת 5X. א.ב.) תמונות של עובר לקח על סטריאוסקופ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מיקוד כִּליַת רֵאשִׁית לפתח עוברי Xenopus מסתמכת על זיהוי הזרקת blastomere הנכון. הזרקה של blastomere V2 של עוברים 8 תאים מטרות כִּליַת רֵאשִׁית שמאל 18. זה משאיר את כִּליַת רֵאשִׁית התקינה הנגדית כמו שליטה פנימית. אם morpholino מציאה או ביטוי יתר RNA משמש המשנה את ההתפתחות בכליה, כִּליַת רֵאשִׁית התקינה הנגדית יכולה לשמש כדי להשוות את ההשפעות של מציאת גן או ביטוי יתר על כִּליַת רֵאשִׁית השמאל. במקרה זה, בקרות נאותות כגון morpholino שליטה תואמת או מבנה RNA שלילי דומיננטי אמורות לשמש בנוסף הבקרה הפנימית הנגדית כדי לנתח את התוצאות של שינויים בביטוי גנים. בשל השקיפות היחסית של העובר Xenopus, פגמים בכליות ניתן לכמת באמצעות טכניקות מרובות. לדוגמא, מציאת גן או ביטוי יתר ניתן לכמת פשוט על ידי חישוב מדד pronephric של עוברתimmunostained עם נוגדן 3G8 13, אשר משווה את הפיתוח של tubules הפרוקסימלי בצדדים המוזרקים ובקרה של העובר. בנוסף ללימוד פיתוח pronephric, טכניקה זו ניתן להתאים בקלות למקד ברקמות אחרות על ידי בחירת blastomere הנכונה להזרים באמצעות גורל הוקם מפות 7-10. בנוסף למיקוד סוגי רקמות אחרים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד פיתוח כליות בשלבים שונים. פרוטוקול זה נראה בשלב 40 עוברים מוכתמים נוגדני 3G8 ו 4A6, אשר לזהות רקמות כליה מובחנות. עוברים צעירים יכול להיות immunostained עם נוגדנים כליות שונות, או נתון הכלאה באתרו 5, 6, 20. לדוגמה, הנוגדן Lim1 יכול לזהות את כִּליַת רֵאשִׁית בפיתוח 21, 22. כמו כן, lim1, pax8, תעתיקי β hnf1- יכול להיות זוהה עם ב מוצא כלאה באתרו בשלב 12.5 22-24 בהמשך סמנים הכלאה באתרו יכול לשמש כדי לזהות אזורים שונים של הכליה בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר. לדוגמה, בדיקות שנועדו לזהות ביטוי nphs1, clckb, slc5a1, ו atp1a1 ב glomus, מבנים צינוריים וחיבור, tubules הפרוקסימלי, ואת כליות כולו, בהתאמה, תוארו 25, 5, 26, 27. הערכת הכליה מעבר בין שלבים מרובים באמצעות נוגדנים שונים או בניתוח באתרו יאפשר הבנה טובה יותר של איך משנה טיפול פיתוח כליות.

היבט קריטי אחד פרוטוקול זה הוא הבחירה זיהוי נכון של blastomere להיות מוזרק. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד למקד כִּליַת רֵאשִׁית ידי הזרקת blastomere V2 השמאלי של עובר 8 תאים או blastomere הגחון השמאלי של עובר 4 תאים. אם blastomere השגוי מוזרק, את כִּליַת רֵאשִׁית לא להיות ממוקדת כראוי. לכן,הוא קריטי כדי להתוודע מטוסי פיתוח תא מחשוף של עוברי Xenopus מוקדם לפני microinjection 28, 29. מחשוף עובר לא תמיד פועל לפי תרשימי שלב ההתפתחותי הוקמו, כך כדאי להזריק עובר יחיד שבה שסעי התא מוקדם להסתכל "נורמלי" ואת blastomere הנכונה ניתן לזהות בקלות. זה יקטין את מספר העוברים, כי כבר ממוקדים כראוי. בנוסף, חשוב גם עבור בלסטומרים של העובר להיות מחולק לחלוטין בזמן ההזרקה. לדוגמא, אם המחשוף בין בלסטומרים V1 ו- V2 של עובר 8 תאים אינו שלם לפני microinjection, נותב עלולים להתפשט לתוך V1 וכן V2. זה היה מפחית את יעילות המיקוד של microinjection, ואת העובר וכתוצאה מכך עשוי להראות הפצה נותב שנראה דומה יותר לזה של עובר מוזרק בשלב 4 תאים ולא בשלב 8 תאים.

חלק קריטי אחר של פרוטוקול זה הוא אימות כי כִּליַת רֵאשִׁית היה ממוקדת כראוי על ידי microinjection. זה חייב להיעשות לפני ניתוח התפתחות pronephric, כי עוברי כי לא היה לי כִּליַת רֵאשִׁית ממוקד כראוי עלול להטות את הנתונים המתקבלים. כדי לוודא מיקוד הולם, לנתח את ההתפלגות נותב בכל עובר מוזרק. המוזרק (משמאל) לצד העובר צריך להציג את הרוב המכריע של נותב הניאון. במידה ושלט (מימין) לצד העובר מראה כמות הקרינה משמעותית, אז עובר זה אמור להיות מושלך. אם זה מתרחש, blastomere השגוי הוזרק, או blastomere מוזרק טרם סיים בקע לפני הזריקה. שנית, קרינה בצד (משמאל) המוזרק של העובר חייבת למקד כִּליַת רֵאשִׁית כראוי. אם העובר היה מוזרק בשלב 8 תאים, את somites הגב ועל הגחון, צלחת לרוחב, במעי האחורי, proctodeum, העור של תא המטען הרכס העצבי בתא המטען צפויים להראות שפעתorescence בנוסף כִּליַת רֵאשִׁית 6, 29. בנוסף לרקמות רשומות הזריקה 8 תאים, עוברים מוזרק בשלב 4 תאים צריך פריסה רחבה של נותב ניאון בעור somites וכן למיקוד של בלוטת מלט, otocyst, העדשה placode חוש הריח. אם העובר אינו מציג את מיקוד רקמות הנכון, זה אמור להיות מושלך לפני הניתוח (איור 5).

הזריקות הממוקדות המתואר בפרוטוקול זה לספק אמצעי מניפולצית ביטוי גנים ברקמות רצויות. הגבלה של טכניקה זו היא כי למרות זריקות אלה ממוקדות, הם אינם משפיעים על כליות פיתוח בלבד. 4 ו-תאים 8 הזריקות המתוארים בטכניקה זו ממוקדות יותר זריקות נעשו בשלב התא הבודד, שבו ביטוי גנים ישתנה בעובר כולו, וזריקות נעשו בשלב שני תאים, שבו מחצית מציג עובר מפורש גן שינהיוֹן. הם אינם, עם זאת, למקד רק ברקמה אחת. למרות זריקות ב בלסטומרים הגחון של העוברים 4 תאים ואת בלסטומרים V2 של 8 תאים העוברים לשנות ביטוי גנים כִּליַת רֵאשִׁית, הם גם לשנות ביטוי גנים ברקמות אחרות. רקמות שנפגעו אחרות כוללות את העור, somites, מעיים, ואת רכס עצבי. לכן, חשוב להבין שלמרות 4- וזריקות 8 תאים ממוקדות יותר אחת או שני תא זריקות, הם ימשיכו לשנות ביטוי גנים ברקמות מרובות. בנוסף הזרקה עוברת בשלבי 4 ו 8 תאים, זריקות יכולות להתבצע גם בבית 2, 16, ושלבי 32 התאים. עוברים מוזרק בשלב 2 תאים יהיה מגוון רחב יותר של רקמות שנפגעו שאינם עוברים מוזרק בשלבים מאוחרים יותר. אמנם יותר מאתגר מבחינה טכנית, עובר מוזרקים בשלבי 16 ו -32 תאים יהיה בטווח צר של רקמות המושפעות מ עובר מוזרקים בשלבי 4 ו 8 התאים.

עקב השושלת MEM-RFPr משמש פרוטוקול זה כדי לאמת מיקוד הולם לאחר microinjection. MEM-RFP mRNA תוויות קרום תא לאחר שהתאים תרגם חלבון מן RNA המוזרק. ריכוז נותב השושלת MEM-RFP להשתמש בפרוטוקול זה (0.1 ננוגרם של MEM-RFP mRNA הזרקת 10 nl) צריך להיות שונה לפי הצורך לתת דין וחשבון על מוות העובר הרצוי עוצמת הקרינה נותב. בנוסף שינוי כמות נותב השושלת מוזרק, נותב באים ממשפחות שונות, כגון-dextran rhodamine, נקודות קוונטיות, או β-galactosidase לגילוי histochemically, ניתן להשתמש במקום-RFP MEM. קליעים נותבים השושלת להיות יותר לדלל את התאים מתחלקים, גרימת רמות הקרינה פוחתת ככל העובר מתפתח. יישום נוסף של שיטה זו הוא לשתף להזריק RNA אקסוגניים או morpholino עם נותב השושלת כדי overexpress או להפיל את הביטוי של הגן של עניין. נותב השושלת משמש לאימות מיקוד נכון של כִּליַת רֵאשִׁית, אבל לאכדי לציין היכן RNA או morpholino אקסוגניים מוזרק שיתוף לוקליזציה בעובר. רנ"א morpholinos אקסוגניים לא יכול להתפשט דרך blastomere מוזרק באותו קצב כמו נותב שיתוף מוזרק, וכתוצאה מכך לגרום לתאי הבת שיש נותב אבל לא את הרנ"א אקסוגניים או morpholino הנוכחי 30. למעשה, יש לנו ציינו כי שני מבני RNA שונים מוזרקים לתוך תא בודד לא תמיד שיתוף בתרגום (נתונים שלא פורסמו). לכן, הנוכחות של נותב בתא אינו מצביע בהכרח כי RNA או morpholino אקסוגניים מוזרק שיתוף תמיד נוכח בתא זה.

פרוטוקול זה מפרט נוהל מיקוד microinjection אל בלסטומרים כי להצמיח כִּליַת רֵאשִׁית לפתח עוברי Xenopus. התבטאות גנים היא מניפולציה לעתים קרובות בעוברים Xenopus באמצעות הזרקת morpholinos או RNA אקסוגניים, אשר שניהם יכולים למנוע חריגות התפתחותי מוקדם כי אם מוזרק אחת אושני תאי עוברים. עובר מוזרק על מציאת התערוכה הבמה תא הבודדה או ביטוי יתר בכל התאים של העובר המתפתח. אם הגן הוא הכרחי עבור תהליכים התפתחותיים מוקדם נכונים, עובר לא יכול לפתח כִּליַת רֵאשִׁית. זריקות ביצע בשלבים מאוחרים יותר, כגון זריקות 8 תאים המפורטים כאן, יכול לגרום עוברים שעוברים gastrulation ופיתוח pronephric הסופי 18. לכן, הזריקות הממוקדות דנו כאן יכולות להתגבר על פגמי gastrulation נגרמים על ידי שינוי של הביטוי של גנים מסוימים, המאפשרים את העובר להתקדם דרך פיתוח pronephric. בעתיד, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי למקד בונת CRISPR כדי בלסטומרים רצויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק NIDDK (K01DK092320) ומימון אתחול מתוך מחלקת ילדים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת טקסס מקגוורן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Fisher S271-3
Potassium chloride Fisher P217-500
Magnesium sulfate  Fisher M63-500
Calcium chloride Fisher C79-500
HEPES Fisher BP310-500
EDTA Fisher S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/ml Amresco E737-20ML
L-Cysteine, 99%+ Acros Organics 52-90-4
Ficoll Fisher BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875712
Mini Fridge II Boekel 260009 Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W. Invitrogen D1817 Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water Corning 46-000-CI
7" Drummond replacement tubes Drummond 3-000-203-G/XL Microinjection needles.
Needle puller Sutter Instruments P-30
Fine forceps Dumont 11252-30 For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II Drummond 3-000-204 Microinjector.
Mineral oil, heavy Fisher CAS 8042-47-5 Oil for needles.
27 G Monoject hypodermic needle Covidien 8881200508 For loading mineral oil into microinjection needle.
5 ml Luer-Lok syringe BD 309646 For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875713A
800 micron Polyester mesh Small Parts CMY-0800-C
Transfer pipets Fisher 13-711-7M For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate Nest Biotechnology
MOPS Fisher BP308-500
EGTA Acros Organics 67-42-5
Formaldehyde Fisher BP531-500
15 mm x 45 mm Screw thread vial Fisher 03-339-25B For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell Culture plate Nest Biotechnology
Benzocaine Spectrum BE130
Ethanol Fisher BP2818-4
Methanol Fisher A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder Fisher BP661-50
Bovine serum albumen Fisher BP1600-100
Triton X-100 Fisher BP151-500
3D Mini rocker, model 135 Denville Scientific 57281
Goat serum, New Zealand origin Invitrogen 16210064
Sodium azide Fisher S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody European Xenopus Resource Centre Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody European Xenopus Resource Centre Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit MBL PM005 Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Secondary antibody to label kidney tubules.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG Life Technologies A21428 Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 Cavity spot plate Corning 7220-85
Benzyl benzoate Fisher 105862500 Optional - for clearing embryos
Benzyl alcohol Fisher A396-500 Optional - for clearing embryos

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
  2. Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
  3. Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
  4. Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  5. Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
  6. Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).
  7. Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
  8. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
  9. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  10. Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
  11. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
  12. Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
  13. Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  15. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
  16. Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
  17. Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
  18. Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
  19. Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. Development of the Xenopus pronephric system. Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).
  20. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
  21. Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
  22. Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
  23. Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  24. Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
  25. Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
  26. Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
  27. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
  28. Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
  29. Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
  30. Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 111, כליות כִּליַת רֵאשִׁית הזרקה ממוקדת microinjection מפת הגורל נותבה שושלת בביולוגיה התפתחותית
טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DeLay, B. D., Krneta-Stankic, V.,… More

DeLay, B. D., Krneta-Stankic, V., Miller, R. K. Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney. J. Vis. Exp. (111), e53799, doi:10.3791/53799 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter