Abstract
Den embryonala njure av Xenopus laevis (groda), de pronephros, består av en enda nefronet, och kan användas som en modell för njursjukdom. Xenopus embryon är stora, utveckla externt, och kan lätt manipuleras genom mikroinjektion eller kirurgiska ingrepp. Dessutom har ödet kartor etablerats för tidiga Xenopus embryon. Riktade mikroinjektion i den individuella blastomere som så småningom kommer att ge upphov till ett organ eller vävnad av intresse kan användas för att selektivt överuttrycker eller riva genuttryck inom detta begränsade område, minskar sekundära effekter i resten av det växande embryot. I detta protokoll, beskriver vi hur man använder etablerade Xenopus öde kartor för att rikta utvecklings Xenopus njure (de pronephros), genom mikroinjektion i specifik blastomer av embryon 4- och 8-cells. Injektion av linjespår tillåter kontroll av särskild inriktning på injektionen.Efter embryon har utvecklats till steg 38-40, hela montering immunfärgning används för att visualisera pronephric utveckling, och kan bedömas bidraget från målceller till pronephros. Samma teknik kan anpassas för att rikta andra vävnadstyper utöver de pronephros.
Introduction
Xenopus embryonjur, de pronephros, är en bra modell för att studera njur utveckling och sjukdom. Embryona utvecklas externt, är stora i storlek, kan produceras i stort antal, och kan lätt manipuleras genom mikroinjektion eller kirurgiska förfaranden. Dessutom är de gener som reglerar njurutveckling hos däggdjur och amfibier konserverade. Däggdjurs njurar framsteg genom tre stadier: de pronephros, mesonephros och metanefros 1, medan embryonala groddjur har en pronephros och vuxna amfibier har en metanefros. Den grundläggande filtreringsenhet av dessa njurformer är nefronet, och båda däggdjur och amfibier kräver samma signaleringskaskader och induktiva händelser genomgå nephrogenesis 2, 3. Xenopus pronephros innehåller en enda nefronet består av proximal, mellan-, distala och anslutande tubuli, och en glomus (analogt med däggdjurs glomerulus) 1, 4-6 (figur 1 Xenopus pronephros gör den lämplig som en enkel modell för studier av gener som är involverade i njur utvecklings- och sjukdomsprocesser.
Cell öde kartor har fastställts för början av Xenopus embryon, och är fritt tillgängliga online på Xenbase 7-11. Här beskriver vi en teknik för mikroinjektion av linjespårämnen att rikta utvecklings Xenopus pronephros, även om samma teknik kan anpassas för att rikta andra vävnader såsom hjärtat eller ögon. Härstamning spår är etiketter (inklusive vitala färgämnen, fluorescerande dextraner, histokemiskt detekterbara enzymer, och mRNA som kodar fluorescerande proteiner) som kan injiceras i ett tidigt blastomere, vilket gör visualisering av avkomman av denna cell under utveckling. Detta protokoll använder MEM-RFP mRNA, som kodar för membran riktade röd fluorescerande protein 12, som en härstamning spårämne. Den riktade mikroinjektion techker för enskilda blastomeres i embryon 4- och 8-cells som beskrivs här kan användas för injektion med morpholinos att slå ner genuttryck, eller med exogen RNA att överuttrycker en gen av intresse. Genom att injicera in i ventrala, vegetabiliskt blastomere, i första hand pronephros av embryot kommer att riktas, lämnar kontra pronephros som en utvecklingskontroll. Samtidig injektion av ett spår verifierar att rätt blastomere injicerades, och visar vilka vävnader i embryot uppstod från det injicerade blastomere, kontrollera inriktning av pronephros. Immunfärgning av pronephros möjliggör visualisering av hur väl pronephric tubuli har riktats. Överuttryck och knockdown effekter kan sedan scored mot kontralaterala sidan av embryot, som tjänar som en utvecklingskontroll, och kan användas för att beräkna den pronephric index 13. Tillgängligheten av cellernas öde kartor medger denna riktad mikroinjektion teknik som skall användas för att målsöka vävnader other än pronephros, samt co-injektion av ett fluorescerande spårämne tillåter riktad mikroinjektion till varje vävnad som ska kontrolleras före analys.
Under embryomikroinjektion, bör utvecklings temperatur regleras tätt, med tanke på att graden av Xenopus utveckling är i hög grad beroende på det 14. Embryon bör inkuberas vid kallare temperaturer (14-16 ° C) i stället för 4- och 8-cellinjektioner eftersom utvecklingstiden är långsammare. Vid 22 ° C, utvecklingstid från steg 1 (en cell) till steg 3 (4 celler) är cirka 2 timmar, medan vid 16 ° C utvecklingstiden till steg 3 är cirka fyra timmar. Det tar ca 15 minuter för att gå från ett 4-cells embryo till en 8-cell (stadium 4) embryo vid 22 ° C, men tar cirka 30 minuter vid 16 ° C. På liknande sätt, vid 22 ° C, tar det bara 30 minuter för en 8-cell embryo att utvecklas till en 16-cell-embryot (etapp 5). Denna tid ökas till 45 minuter vid 16 ° C. Derefore, är det användbart att sakta ned utvecklingen hastigheten av embryona för att möjliggöra tillräckligt med tid för injektioner på 8-cellstadiet innan embryona vidare till 16-cellstadiet. Dessutom kan tillväxttemperaturer moduleras för att påskynda eller fördembryoutveckling tills njuren har fullt utvecklad.
Epidermis hos grodyngel skede Xenopus embryon är relativt öppen, vilket möjliggör enkel avbildning av utvecklings pronephros utan dissektion eller röjning av vävnaden 15. På grund av den relativa öppenheten i Xenopus embryon, är levande cell imaging också möjligt 16,17. Hela montering immunfärgning att visualisera pronephros är möjligt med etablerade antikroppar som märka den proximala, mellanliggande, distala och anslutande kanalerna i steg 38 - 40 embryon som möjliggör bedömning av pronephric utveckling efter riktad manipulation av genuttryck i Xenopus embryon 18-20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll har godkänts av University of Texas Health Science Center i Houston Centrum för försöksdjursmedicin djurskyddskommittén, som fungerar som institutionsstyrelse och användning kommittén (protokoll #: HSC-AWC-13-135).
1. Identifiering och val av blastomerer för njure inriktade Injektioner
- Före generera embryon, använder Normal Table of Xenopus Development 21 att förstå orienteringen av de tidiga celldelningar i embryot. Alternativt åtkomstscheman i början av utvecklingsstadier av Xenopus på Xenbase 11.
- Tillgång till interaktiva Xenopus cell öde kartor på Xenbase 11 att välja vilken blastomer kommer att riktas för mikroinjektion.
- Observera att en enda cell embryo har en mörkt pigmenterad djur pol och en vegetativa polen, som är vit och yolky. Observera att en skyddande membran, som kallas vitelline envelope, täcker embryot.
- Lägg märke till att den första klyvning sker typiskt mellan de vänstra och högra sidorna av embryot. Dessa celler bidrar lika mycket till pronephric härstamning.
- Observera att det andra klyvnings uppdelar dorsala och ventrala halvor av embryot, vilket leder till en 4-cell embryo. De dorsala celler är mindre och har mindre pigment än de ventrala cellerna (Figur 2A och figur 3A).
- Identifiera ventrala blastomerer (V, de stora, mörka celler) på vänster och höger sida, som bidrar mer till att utveckla njur än rygg (D, små, lätta celler) blastomeres (Figur 2A).
- Om injektion i en 4-cells embryo, injicera den vänstra ventrala blastomere att rikta den vänstra njuren (Figur 3A och avsnitt 3).
- Den tredje klyvning bisects djur- och vegetabiliska sidor, vilket resulterar i en åtta-cell embryo. På denna punkt finns det fyra djur blastomerer [vänster och höger ventrala(V1) och rygg (D1)] och fyra vegetabiliskt blastomeres [vänster och höger ventrala (V2) och rygg (D2)] (Figur 2B och figur 3B).
- Lokalisera ventrala, vegetabiliska blastomeres (V2). Dessa blastomeres bidra mer till att utveckla njur andra celler i detta skede (Figur 2B). Att rikta den vänstra njuren av en 8-cells embryo, injicera i vänster V2 blastomere (figur 3B och avsnitt 3).
- Lägg märke till att de fjärde och femte spjälkningar tudelar de animaliska och vegetabiliska blastomerer. Två avkomma genereras från varje blastomere, resulterar i en 16-cell embryo. Cellerna är uppkallade efter sin föregångare. Till exempel, V2 blastomer från 8-cellstadiet ger upphov till V2.1 och V2.2 avkomma vid 16-cellstadiet (Figur 2C). Den V2.2 cellen vid 16-cellstadiet står för de flesta av cellerna som bidrar till att utveckla njur.
- Notera den sjätte och sjunde spjälkningar resulterar i en 32-cells embryo. Återigen, är två avkomma genereras från varje blastomere, som namnges efter deras föregångare. Till exempel, den V2.2 blastomer från 16-cellstadiet ger upphov till V2.2.1 och V2.2.2 vid 32-cellstadiet. Det finns en alternativ namngivningssystemet vid 32-cellstadiet, i vilken celler identifieras i fyra rader såsom A, B, C och D (från djur till vegetabiliskt), och i fyra kolumner som 1, 2, 3, och 4 ( från rygg till ventrala). Således V2.2.2 blastomere, som bidrar mest till utvecklings pronephros, kallas C3 enligt denna alternativa namngivningssystem (figur 2D).
2. Beredning av embryon
- Förbered 50 ml Dejelly Solution (2% cystein, NaOH till pH 8,0).
- Isolera båda testiklarna från en enda manlig groda enligt standardprotokoll 14. Placera testiklarna i en 60 mm petriskål fylld med 10 ml Testiklar lagringslösning (1 x Marc Modified Ringers [MMR; 0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA] 12, 1% bovint serumalbumin, 50 | ig / ml gentamycin). Lagra testiklarna vid 4 ° C.
Obs: Testiklar kan lagras i ungefär 7-10 dagar vid 4 ° C, men gödsling effektivitet kommer att minska längre testiklarna har lagrats. - Pressa en kvinnlig groda att få ägg enligt standardprotokoll 14. Samla in ägg i en 100 mm petriskål. Häll bort överflödigt vatten.
- Skär av en fjärdedel av en testikel, medan det är i Testiklar lagringslösning med hjälp av pincett och ett rakblad. Överför bit testikel till petriskål med ägg. Justera storleken på testiklarna del som används för att redogöra för storleken på testis, hur länge testiklarna har lagrats, och hur många ägg är att befruktas. Generellt använder ¼ till 1/3 av en nyligen dissekeras testiklarna att befrukta en koppling av ägg.
- Skär testis delen i små bitar med hjälp av pincett och ett rakblad. Tillsätt tillräckligt 0.3x MMR+ 30 mg / ml gentamycin till petriskål för att täcka äggen. Snurra MMR i skålen för att blanda.
- Vänta cirka 30 minuter för befruktning kan äga rum vid rumstemperatur. Notera att djuret halvklotet (den pigmenterade sidan av embryot) kommer att sitta på toppen av embryot vid effektiv befruktning. Ta sedan bort MMR från petriskål med en pipett. Tillsätt tillräckligt Dejelly Lösning till skålen för att täcka de embryon.
- Under de närmaste minuterna, snurra försiktigt skålen intermittent. Kraftig skakning av skålen vid denna tid kan orsaka axelskador. Den gelé pälsen på embryon löser, och embryona kommer samlas i mitten av skålen under virvlande. När embryona är nära i kontakt med varandra i mitten av skålen, ta bort Dejelly Solution med en överföringspipett. Lämna inte embryon i Dejelly lösning för längre än 5 minuter, eller embryon kan skadas.
- Tvätta dejellied embryon 3 - 5 gånger i 0.3xMMR + 30 mg / ml gentamycin genom att försiktigt hälla eller pipettering av MMR och fyllning av skålen med nya MMR. Ta inte bort alla MMR från skålen, eller embryon kan skadas.
- Ta bort eventuella obefruktade ägg eller bitar av testikel från petriskål med en pipett.
- Inkubera embryon mellan 14 och 22 ° C.
Obs: Embryon odlas vid lägre temperaturer utvecklas långsammare än embryon odlas vid högre temperaturer. Tidpunkt för utvecklingsstadier kan hittas på Xenbase 22.- Till rymden ut deras utveckling, plats hälften av embryon från en enda befruktning i en petriskål som hölls vid 14 ° C, och den andra hälften av embryona i en petriskål som hölls vid 18 ° C. Detta gör det möjligt för två uppsättningar av injektioner i 4-cell- eller 8-cellembryon från en enda befruktning.
3. Beredning av injektionslösningar och mikroinjektion av embryon
- Förbered injektionslösning innehållande 0,01ng / nl membranbundet rött fluorescerande protein (MEM-RFP) mRNA 9 medan embryona utvecklas till 4-cell eller 8-cellstadiet. Förvara injektionslösningen på is tills redo att injicera.
- Ladda en 7 "ersättnings glaskapillärrör in en nål avdragare, med toppen av ersättningsröret i linje med toppen av nålen avdragare fallet. Inställt värde värme # 2-800, och dragvärdet till 650. Tryck på" pull "-knappen för att dra nålen. Detta kommer att skapa 2 nålar från en enda 7" glaskapillärrör.
- Klippa bort spetsen på en drog nål med ett par Dumont pincett.
Obs: Efter att dra nålen är spetsen förseglad och måste skäras upp. Ju närmare den punkt av nålen att den skärs, den mindre diametern nålspetsen kommer att bli. Även om diametern hos spetsen inte kommer att påverka injektionsvolym med mikroinjektion system som används här, är mer sannolikt att skada embryot en spets med en större diameter. - Slip micropipette hylsan på baksidan av nålen. Därefter glider det stora hålet O-ring på baksidan av nålen bakom spännhylsan.
- Fyll nålen med mineralolja med hjälp av en 27 gauge injektionsnål, som är noga med att inte få luftbubblor i nålen.
- Slip nålen på kolven microinjector, sitt nålen i det stora hålet i den vita plastdistansen installerad på kolven. Kolven bör ha en liten O-ring som är närmast kroppen av microinjector, följt av den vita spacer, stort hål O-ring, och spännhylsan. Säkra nålen genom att dra åt hylsan. Dra försiktigt på nålen för att säkerställa att det sitter fast ordentligt.
- Tryck och håll "tom" -knappen på microinjector kontrollboxen tills det finns två pip.
- Pipettera 3 | il av injektionslösning på en bit Parafilm. Sätt spetsen på nålen i sträng av injektionslösningen på Parafilm. Tryck och håll "fylla" -knappen på microinjector kontrollboxen för att rita injektionslösningen in i nålen.
- Fylla en 60 mm petriskål fodrad med 500 mikron polyester mesh med 5% Ficoll i 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycin. Försiktigt pipettera 20 - 30 4-celler eller 8-cells embryon i skålen.
- Med hjälp av en hår slinga 14, manipulera embryon så att blastomere ska injiceras är vänd mot nålen. Att rikta den vänstra njuren, rada upp embryon så att den vänstra ventrala blastomerer av embryon 4-cell eller vänster V2 blastomerer av embryon 8-cells inför nålen.
- Injicera 10 nl av injektionslösning i den valda blastomer av varje embryo i skålen.
Obs: Mask vid botten av petriskålen stabiliserar embryona och hindrar dem från att rulla, så att de kan injiceras utan användning av ett hår slinga för stabilisering. - Överföring injicerade embryon i brunnar i en odlingsplatta som har fyllts med 5% Ficoll i 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycin. Inkubera den injicerade embryots vid 16 ° C i åtminstone en timme för att tillåta de injicerade blastomerer att läka.
- Överför läkta embryon i brunnar i en ny odlingsplatta som har fyllts med 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycin för steg 9 (före gastrulation).
- Inkubera embryon vid 14-22 ° C tills embryona når stadium 38-40 21.
4. Fixering och immunfärgning av embryon
- Förbered 50 ml MOPS / EGTA / Magnesiumsulfat / Formaldehyd Buffer [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4, 3,7% (vol / vol) formaldehyd].
- Med hjälp av en överföringspipett, satte 10-20 etapp 38 - 40 embryon i en glasflaska. Tillsätt 10 pl 5% bensokain i 100% etanol till flaskan och invertera flaskan för att blanda. Vänta 10 min för att söva embryona.
- Avlägsna MMR från flaskan med hjälp av en glaspipett. Om bearbetning av flera medicinflaskor samtidigt, kan flaskorna att hållas upprätt i en 24-brunnars cellodlingsplatta.
- Med ett glasrörtte, fylla flaskan med MEMFA. Placera flaskan på en tre-dimensionell gungande plattform under 1 timme vid rumstemperatur.
- Avlägsna MEMFA från flaskan med hjälp av en glaspipett. Fylla flaskan med 100% metanol. Placera flaskan på en tre-dimensionell gungande plattform under 10 min vid rumstemperatur. Upprepa detta tvättsteg en gång till, och lagra embryon i 100% metanol över natt vid -20 ° C.
- Förbereda 1x Fosfatbuffrad saltlösning-bovint serumalbumin-Triton (PBT): 1 x PBS, 2 mg / ml bovint serumalbumin, 0,1% Triton X-100.
- Förbered den primära antikroppen lösning: 1x PBT med 10% getserum med en 1: 5 spädning av mus monoklonal 4A6 antikropp (för att märka membranen i de mellanliggande, distala och anslutande kanalerna 20), en 1:30 spädning av mus-monoklonal antikropp 3G8 (för att etikett lumen hos de proximala tubuli 20), och en 1: 250 spädning av kanin-polyklonal RFP-antikropp (för att märka den MEM-RFP spårämne). Lagra vid 4 ° C.
- Förbered secondary antikroppslösning: 1x PBT med 10% getserum, 1: 500 Alexa 488 get-anti-mus-IgG (förrådskoncentration 2 mg / ml, för att etiketten 4A6 och 3G8), och 1: 500 Alexa 555 get-anti-kanin-IgG (lager koncentration 2 mg / ml, för att märka MEM-RFP spårämne). Lagra vid 4 ° C, till att täcka röret i folie skydda mot ljus.
- Alternativt, samla de primära och sekundära antikroppar efter färgning, och spara vid 4 ° C för återanvändning i framtida experiment. Om antikroppen skall sparas för återanvändning, tillsätt 0,01% natriumazid.
- Immunostain embryon med hjälp av etablerade protokoll 18.
5. Visualisering av embryon och analys av riktade pronephric Tissue
- Sikta de immun embryon för att kontrollera att rätt blastomere injicerades genom att titta på fluorescens av spårämnet under ett fluorescerande stereomikroskop vid 1X (för att visa hela embryo) och 5X (för att visa njure) förstoring. Place embryon i en med flera brunnar glasplatta med den vills fyllda med 1x PBT med hjälp av en pipett med spetsen avskuren. Manipulera embryon med ett hår slinga. Använd endast embryon som har sam-injicerade spårämnet närvarande i pronephros på den vänstra sidan av embryot (figur 3C, F och fig 4C, F) för genen överuttryck eller knockdown-analys.
- Alternativt rensar embryona i Murray s Clear (2 delar bensylbensoat: en del bensylalkohol) genom att placera embryona i en glasflaska och fylla flaskan med Murrays Clear. Visualisera embryona med hjälp av en glas brunnar.
Obs: Murrays Clear är ett organiskt lösningsmedel, och bör hanteras med försiktighet. Använd handskar och bara använda glasflaskor och pipetter med Murrays Clear. - Lagra embryon vid 4 ° C i 1x PBT i 2 - 3 veckor. För långtidsförvaring av embryon, dehydrera embryona genom tvättning två gånger i 100% metanol vid rumstemperatur under 10 min. Lagra embryon vid -20 ° C i 100% metanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microinjections av 4- och 8-cells Xenopus embryon med MEM-RFP mRNA visar olika inriktning till pronephros. Figur 4 visar scen 40 embryon med rätt MEM-RFP mRNA uttrycksmönster. Embryon injicerades i den vänstra ventrala blastomer (Figur 4A), och sorteras för korrekt uttrycksmönstret av MEM-RFP mRNA. Förutom att uttrycka MEM-RFP i den proximala, mellanliggande, distala och anslutande kanalerna i njuren, är ordentligt injicerade embryon förväntas visa fluorescens i epidermis av huvudet, bålen och svans. De bör också visa fluorescens i otocyst, cement körtel, proctodeum och somites (Figur 4C). Fördelningen av MEM-RFP fluorescens i njurarna hos 8 ordentligt injicerade embryon bestämdes med en fluorescerande stereomikroskop (figur 4B). Embryon med höga nivåer av MEM-RFP uttryck i epidermis somblocke detektion av njur regioner bedömdes som "tilltäppt". MEM-RFP uttryck detekterades i den proximala, mellanliggande, distala och anslutande kanalerna i alla embryon som inte bedömdes som tilltäppt. Stereo (Figur 4D-F) och konfokala mikroskop (Figur 4G-I) användes för att kontrollera samlokaliseringen av MEM-RFP och njurvävnad immun med 3G8 och 4A6. Konfokal avbildning verifierade samlokaliseringen av MEM-RFP med den proximala, mellanliggande, distala och anslut tubuli i njuren, vilket tyder på att mikroinjektion av MEM-RFP in i den vänstra ventrala blastomer riktar njuren korrekt.
Embryon som injicerats med MEM-RFP-mRNA vid 8-cellstadiet (figur 5A) visar ett smalare spektrum av vävnader som uppvisar fluorescens, vilket indikerar att 8-cell injektioner minska potentialen för sekundära effekter till njuren. Som embryon injiceras vid 4-cellstadiet, EMBRyos injiceras vid 8-cellstadiet show fluorescens i den proximala, mellanliggande, distala och anslut tubuli i njuren, liksom somites och proctodeum (Figur 5C-F). Till skillnad från embryon injiceras vid 4-cellstadiet, är cementkörteln och otocyst inte märkt med MEM-RFP. Av 10 korrekt riktade embryon, ett embryo visade MEM-RFP i nästan alla de proximala tubuli, och 3 visade MEM-RFP i nästan alla de mellanliggande och distala tubuli i njuren (figur 5B). Förbindelse tubuli av 7 embryon delvis märkt med MEM-RFP. Dessutom njurarna hos embryon som injicerats vid 8-cellstadiet var lättare att visualisera, och endast ett poängsattes som ockluderas. Samlokalisering av MEM-RFP och antikroppar märkning njuren (3G8 och 4A6) bestämdes med användning av ett stereomikroskop (figur 5D-F), och verifieras med en konfokalmikroskop (Figur 5G-I). Den proximala, mellanliggande, distala och ansluta tubules i njuren märktes med MEM-RFP i embryon som injicerats vid 8-cellstadiet, vilket visar att riktade injektion av V2 blastomere etiketter njuren medan du visar fluorescens i färre vävnader än embryon injiceras i den vänstra ventrala blastomere vid 4-cell skede.
Denna analys använder sig av en fluorescensmärkta mRNA som spårämne för att indikera vilka vävnader var riktade genom mikroinjektion. Det är viktigt att undersöka embryon för konsekvent spår lokalisering före analys och eventuella embryon som att inte visa den förväntade spårfördelningsmönstret ska kasseras. Figur 6 visar ett exempel på en scen 40 embryo som felaktigt riktades med MEM-RFP mRNA vid den 4-cellstadiet. MEM-RFP-mRNA-expression är belägen på den högra sidan av embryot i stället för den vänstra sidan (Figur 6A). Dessutom är de flesta av de mRNA-expression i huden på nedre delen av bålen och svans, medlite uttryck i somites. Ingen mRNA-uttryck ses i den proximala, mellanliggande, distala och anslutande kanalerna (Figur 6B), vilket bekräftar felaktig inriktning av njuren. Därför bör detta embryo inte användas för analys.
Figur 1:. Xenopus embryonala njur Diagram över njuren av ett steg 35 Xenopus embryo, visar den proximala, mellanliggande, distal, och anslutande kanalerna. Baserat på Raciti et al. (2008) 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Xenopus Embryonala Fate Maps. kartor Fate identifiera och namnge blastomerer som bidrar till utvecklings pronephros. A) Fate karta över en 4-cells embryo. B) Fate karta över en 8-cells embryo. C) Ödet karta över en 16-cell embryo. D) Ödet karta över en 32-cell embryo. Blastomerer av 32-cells embryo också märks med ett alternativt blastomere namngivningssystem. Fate kartor baserade på Moody (1987) 8, 9 och Moody och Kline (1990) 7. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Injection System för inriktning Xenopus Pronephros Röda pilar indikerar cellen att injicera. A) djur och ventrala vyer av en 4-cells embryo visar injektion av den vänstra ventrala blastomere att rikta vänster pronephros. Röda pilar indikerar den vänstra ventrala blastomere. B) Djur och ventrala utsikt över en 8-cells embryo visar injektion av den vänstra V2 blastomere att rikta vänster pronephros. Röda pilar indikerar vänster V2 blastomere. AB) Bilder av embryon som tagits på en stereoskop på 4X förstoring. Injektioner baserade på Xenopus öde kartor utvecklats av Moody (1987) 8, 9 och Moody och Kline (1990) 7. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Exempel på embryon riktade vid 4-cellstadiet immun stadium 40 Xenopus embryon visar riktad injektion till vänster pronephros vid 4-cellstadiet med hjälp av MEM-RFP-mRNA som ett spårämne. MEM-RFP etikettercellmembran rött. A) Schematisk visning injektion av MEM-RFP-mRNA in i den vänstra ventrala blastomer av ett 4-cells embryo. B) Tissue lokalisering av MEM-RFP fluorescens i njurarna hos ordentligt injicerade embryon. C) Steg 40 embryo injicerades med MEM-RFP i den vänstra ventrala blastomer vid 4-cellstadiet. MEM-RFP lokalisering visas i rött, medan njuren är märkt grönt. 1X förstoring. D) Njure färgades med 3G8 för att märka lumen i de proximala tubuli, och 4A6 för att märka membranen hos celler i de mellanliggande, distala och anslut tubuli. 5X förstoring. E) Utvidgningen av regionen under njuren visar MEM-RFP lokalisering. 5X förstoring. F) Sammanslagen bild som visar samlokalisering av MEM-RFP spår med njurarna. 5X förstoring. CF) Bilder av embryon tagna med en Olympus DP71 kamera på en stereoskop. G) Confocal bild av njurarna hos en andra embryo färgas med 3G8 och 4A6. H) Lokalisering av MEM-RFP i njure och omgivande vävnad. I) Sammanslagen bild shovinge samlokalisering av MEM-RFP, 3G8 och 4A6 i njuren. GI) Confocal bilder med hjälp av maximal projektion på 20X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Exempel på embryon riktade vid 8-cellstadiet immun stadium 40 Xenopus embryon visar riktad injektion till vänster pronephros vid 8-cellstadiet med hjälp av MEM-RFP-mRNA som ett spårämne. MEM-RFP etiketter cellmembranen rött. A) Schematisk visar injektion av MEM-RFP mRNA till vänster V2 blastomer av en 8-cells embryo. B) Tissue lokalisering av MEM-RFP fluorescens i njurarna hos ordentligt injicerade embryon. C) Steg 40 embryo injicerades med MEM-RFP i vänster V2 blastomer vid 8-cellstadiet. MEM-RFP lokalisering visasi rött, medan njuren är märkt grönt. 1X förstoring. D) Njure färgades med 3G8 för att märka lumen i de proximala tubuli, och 4A6 för att märka membranen hos celler i de mellanliggande, distala och anslut tubuli. 5X förstoring. E) Utvidgningen av regionen under njuren visar MEM-RFP lokalisering. 5X förstoring. F) Sammanslagen bild som visar samlokalisering av MEM-RFP spår med njurarna. 5X förstoring. CF) Bilder av embryon tagna med en Olympus DP71 kamera på en stereoskop. G) Confocal bild av njurarna hos en andra embryo färgas med 3G8 och 4A6. H) Lokalisering av MEM-RFP i njure och omgivande vävnad. I) Sammanslagen bild som visar samlokalisering av MEM-RFP, 3G8 och 4A6 i njuren. GI) Confocal bilder som tagits med maximal projektion på 20X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Exempel på embryo riktade felaktigt vid 4-cellstadiet immun stadium 40 Xenopus embryo visar felaktig inriktning av de vänstra pronephros vid 4-cellstadiet med hjälp av MEM-RFP-mRNA som ett spårämne.. MEM-RFP etiketter cellmembranen rött. A) Steg 40 embryo visar felaktig fördelning av MEM-RFP som indikerar injektion i felaktiga blastomere. Förutom att ha felaktig spårämnesfördelning indikerar injektion i den felaktiga blastomer, var detta embryo injicerades på höger sida. 1X förstoring. B) Sammanslagen bild av njurarna visar en brist på samlokalisering av MEM-RFP med antikroppar märkning njuren (3G8, 4A6). 5X förstoring. AB) Bilder av embryo tas på en stereoskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Targeting pronephros att utveckla Xenopus embryon bygger på att identifiera och injicera rätt blastomere. Injektion av V2 blastomere av embryon 8-cells riktar vänster pronephros 18. Detta lämnar kontra rätt pronephros som en intern kontroll. Om morfolino knockdown eller RNA överuttryck används för att ändra njure utveckling, kan de kontralaterala högra pronephros användas för att jämföra effekterna av genen knockdown eller överuttryck på vänster pronephros. I detta fall bör ordentliga kontroller såsom en omaka kontroll morfolino eller dominant negativ RNA-konstruktion användas utöver den kontralaterala intern kontroll för att analysera resultaten av förändringar i genuttryck. På grund av den relativa öppenheten i Xenopus embryon, kan njurskador lätt kvantifieras med hjälp av flera tekniker. Till exempel kan genen knockdown eller överexpression vara att helt enkelt kvantifieras genom beräkning av pronephric index av embryonimmunostained med antikropp 3G8 13, som jämför utvecklingen av de proximala tubuli på den injicerade och kontroll sidorna av embryot. Förutom att studera pronephric utveckling, kan denna teknik lätt anpassas för att rikta andra vävnader genom att välja rätt blastomere att injicera med en etablerad öde kartor 7-10. Förutom att rikta andra vävnadstyper, kan detta protokoll också användas för att studera njurutveckling i olika skeden. Detta protokoll tittade på scenen 40 embryon färgade med antikroppar 3G8 och 4A6, som detekterar differentierad njurvävnaden. Yngre embryon kunde immunfärgades med olika njur antikroppar, eller utsattes för in situ-hybridisering 5, 6, 20. Till exempel kan antikroppen LIM1 detektera utvecklings pronephros 21, 22. På samma sätt LIM1 kan pax8 och hnf1- p-transkript vara detekteras med in situ hybridisering börjar på scenen 12,5 22-24 in situ hybridisering markörer kan användas för att detektera olika regioner av njuren vid senare utvecklingsstadier. Till exempel, prober utformade för att detektera uttryck av nphs1, clckb, slc5a1 och atp1a1 i glomus, distala och anslutning av tubuli, proximala tubuli, och hela njuren, respektive, har beskrivits 25, 5, 26, 27. Uppskatta njuren över flera steg med olika antikroppar eller in situ analys skulle möjliggöra en bättre förståelse för hur en behandling förändrar njure utveckling.
En viktig aspekt av detta protokoll är rätt val och identifiering av blastomere som ska injiceras. I detta protokoll, beskriver vi hur man rikta pronephros genom att injicera vänster V2 blastomer av embryon 8-cell eller vänster ventrala blastomer av embryon 4-cell. Om fel blastomere injiceras de pronephros kommer inte vara korrekt riktade. Därför är detär avgörande för att bekanta sig med utveckling och cellklyvningsplan tidiga Xenopus embryon före mikroinjektion 28, inte 29. Embryo klyvning inte alltid följa de etablerade utvecklingsstadiet diagram, så det är bra att injicera embryon där de tidiga cell klyftor ser "normal" och korrekt blastomere lätt kan identifieras. Detta kommer att minska antalet embryon som har felaktigt inriktade. Dessutom är det också viktigt för blastomererna av embryot att vara helt uppdelad vid tidpunkten för injektion. Till exempel om klyvningen mellan blastomerer V1 och V2 av en 8-cell embryo inte är fullständig innan mikroinjektion, kan spårämnet spridas in V1 samt V2. Detta skulle minska den målsökande effektiviteten i mikroinjektion, och den resulterande embryot kan visa spårfördelning som ser mer liknar den hos ett embryo injiceras vid 4-cellstadiet i stället för 8-cellstadiet.
Enannan viktig del av detta protokoll är kontroll av att pronephros var ordentligt riktade genom mikroinjektion. Detta måste göras innan analysera pronephric utveckling, eftersom embryon som inte har haft pronephros korrekt riktade kan skeva den resulterande datamängden. Att verifiera inriktning analysera spår utdelning i respektive injicerade embryo. Den injicerade (vänster) sida av embryot ska visa den stora majoriteten av det fluorescerande spårämne. Om kontrollen (höger) sida av embryot visar en avsevärd mängd av fluorescens, då detta embryo ska kasseras. Om detta inträffar, var antingen fel blastomere injiceras eller injicerade blastomere hade inte avslutat klyvs före injektion. För det andra måste fluorescens på den injicerade (vänster) sida av embryot korrekt rikta pronephros. Om embryot injicerades vid 8-cellstadiet, rygg och ventrala somites, lateral platta, hindgut, proctodeum, huden på bålen och neurala crest i bagageluckan förväntas visa influensaorescence förutom pronephros 6, 29. Utöver de vävnader som anges för den 8-cells injektion embryon injiceras vid 4-cellstadiet bör ha större spridning av det fluorescerande spårämnet i huden och somites samt inriktning av cement körtel, otocyst, lins och lukt placode. Om embryot inte visas korrekt vävnad inriktning, ska den kasseras före analys (Figur 5).
De riktade injektioner som beskrivs i detta protokoll ger ett medel för att manipulera genuttryck i en önskad vävnad. En begränsning med denna teknik är att även om dessa injektioner är riktade, det påverkar inte bara den utveckla njure. 4- och 8-cells injektioner som beskrivs i denna teknik är mer inriktade än injektioner görs vid enkelcellstadiet, där genuttryck kommer att ändras i hela embryot, och injektioner görs vid två-cellstadiet, där hälften av embryo visar förändrad gen uttryckJon. De har dock inte bara rikta en vävnad. Även injektioner i de ventrala blastomerer av embryon 4-cellen och V2 blastomerer av embryon 8-cell förändra genexpression i de pronephros, de också förändra genexpression i andra vävnader. Andra drabbade vävnaderna inkluderar huden, somites, tarm, och neural crest. Därför är det viktigt att förstå att även 4- och 8-cells injektioner är mer riktad än en- eller två-cell injektioner, kommer de fortfarande ändra genuttryck i flera vävnader. Förutom att injicera embryon vid 4- och 8-cellstadier, kan injektionerna även genomföras vid 2-, 16-, och 32-cellstadier. Embryon som injicerats vid 2-cellstadiet kommer att ha ett bredare spektrum av vävnader som berörs än embryon som injicerats i senare skeden. Även om mer tekniskt utmanande, kommer embryon injiceras vid 16- och 32-cellsteg har en snävare intervall av vävnader drabbade än embryon injiceras vid 4- och 8-cells steg.
MEM-RFP härstamning spårr används i detta protokoll för att verifiera inriktning efter mikroinjektion. MEM-RFP mRNA etiketter cellmembranen efter cellerna har översatt protein från den injicerade RNA. Koncentrationen av MEM-RFP härstamning spårämne som används i detta protokoll (0,1 ng MEM-RFP mRNA i en 10 nl injektion) bör ändras efter behov för att redogöra för embryo död och önskad intensitet spår fluorescens. Förutom modifiering av mängden härstamning spårämne injiceras, en annan härstamning spårämne, såsom rodamin-dextran, kvantprickar, eller histokemiskt detekterbara β-galaktosidas, kan användas i stället för MEM-RFP. Härstamning spårämnen blir mer utspädd när cellerna delar, vilket gör att nivåerna av fluorescens för att minska när embryot utvecklas. En ytterligare tillämpning av denna teknik är att samarbeta injicera en exogen RNA eller morfolino med härstamning spår att överuttrycker eller slå ner uttrycket av en gen av intresse. Härstamning spårämne används för att verifiera korrekt inriktning av de pronephros, men inteatt ange var co-injicerade exogena RNA eller morfolino lokaliserar i embryot. Exogent RNA och morpholinos kan inte sprida sig genom den injicerade blastomer i samma takt som co-injicerade spårämne, vilket kan resultera i dotterceller som har spårämnet men inte den exogena RNA eller morfolino närvarande 30. I själva verket har vi observerat att två olika RNA-konstruktioner som injiceras i en enda cell inte alltid samlokalisering (opublicerade data). Därför betyder närvaron av spårämnet i en cell inte nödvändigtvis tyda på att co-injiceras exogent RNA eller morfolino är alltid närvarande i den cellen.
Detta protokoll detaljer en procedur för att rikta mikroinjektion till blastomerer som ger upphov till pronephros att utveckla Xenopus embryon. Genuttryck ofta manipuleras i Xenopus embryon genom injektion av morpholinos eller exogena RNA, som båda kan förhindra orsakar tidiga utvecklingsanomalier om produkten injiceras i en- ellerembryon två-cell. Embryon som injicerats vid den enda cellstadiet uppvisar knockdown eller överuttryck i alla celler i det utvecklande embryot. Om genen är nödvändig för korrekt tidiga utvecklingsprocesser, kan embryot inte utveckla en pronephros. Injektioner utförs i ett senare skede, såsom 8-cellinjektioner beskrivs här, kan resultera i embryon som genomgår gastrulation och eventuell pronephric utveckling 18. Därför kan de målinriktade injektioner diskuteras här övervinna gastrulation fel orsakade av förändring av uttrycket av vissa gener, vilket gör att embryot att gå igenom pronephric utveckling. I framtiden kan detta protokoll också användas för att rikta crispr konstruktioner till önskade blastomerer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en National Institutes of Health NIDDK bidrag (K01DK092320) och start finansiering från Department of Pediatrics vid University of Texas McGovern Medical School.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27 G Monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 ml Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell Culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label kidney tubules. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 Cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional - for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional - for clearing embryos |
References
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
- Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
- Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
- Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
- Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
- Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
- Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
- Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
- Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
- Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R.
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
- Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
- Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
- Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
- Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
- Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
- Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).
