Summary
यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे लगातार आसपास के ऊतकों को परेशान किए बिना planarian आँखें (ऑप्टिक कप) उत्पाद शुल्क के लिए। एक इंसुलिन सुई और सिरिंज, या तो एक का उपयोग करना या दोनों आँखों तंत्र आंख उत्थान, दृश्य उत्थान के विकास, और प्रकाश प्रेरित व्यवहार के तंत्रिका आधार को विनियमित करने की जांच की सुविधा के लिए ablated जा सकता है।
Abstract
वयस्क स्टेम सेल और पुनर्योजी तंत्र के अध्ययन में, planarian चपटे कृमि विवो मॉडल प्रणाली में एक प्रधान है। यह उनकी प्रचुर मात्रा में स्टेम सेल आबादी और चोटों कि ज्यादातर जानवरों के लिए घातक हो सकता है के बाद सभी सेल और ऊतक प्रकार पुनर्जीवित करने की क्षमता के लिए बड़े हिस्से में कारण है। हाल ही में, planarians आंख उत्थान के लिए एक मॉडल के रूप में लोकप्रियता हासिल की है। उनके (दो ऊतक प्रकार के शामिल: रंगद्रव्य कोशिकाओं और फोटोरिसेप्टर) पूरे आंख पुनर्जीवित करने की क्षमता तंत्र दृश्य प्रणाली उत्थान को विनियमित करने के विच्छेदन के लिए अनुमति देता है। नेत्र पृथक आंख को विशिष्ट रास्ते और तंत्र, जिनमें से सबसे महत्वपूर्ण है कि उत्थान काफी हद तक अकेले आंख ऊतकों तक ही सीमित है की जांच के लिए (जैसे कि कत्ल या छेद पंच के रूप में) अन्य तकनीकों पर कई फायदे हैं। इस वीडियो लेख के उद्देश्य मज़बूती से मस्तिष्क को परेशान करने या ऊतकों आसपास के बिना planarian ऑप्टिक कप को निकालने का तरीका प्रदर्शित करने के लिए है।कीड़े और एक स्थापित कॉलोनी के रखरखाव की हैंडलिंग भी वर्णन किया गया है। इस तकनीक को एक 31 जी, 5/16-inch इंसुलिन सुई का उपयोग करता है शल्य चिकित्सा द्वारा एक ठंडा थाली पर स्थिर planarians की ऑप्टिक कप से बाहर निकालना है। इस विधि दोनों सिंगल और डबल आंख पृथक शामिल हैं, 1-2 सप्ताह में पुनः आँखों से आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से, इस पृथक तकनीक आसानी से पुनर्योजी तंत्र और उनके विकास, आंख स्टेम कोशिकाओं और उनके रखरखाव, और phototaxic व्यवहार प्रतिक्रियाओं और उनके मस्तिष्क संबंधी आधार का एक बेहतर समझ के लिए औषधीय और आनुवंशिक (आरएनए हस्तक्षेप) स्क्रीन के साथ जोड़ा जा सकता है।
Introduction
Planarians वयस्क स्टेम सेल की मध्यस्थता उत्थान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव हैं। इन गैर-परजीवी मीठे पानी चपटे कृमि उनके केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और मस्तिष्क 1 सहित किसी भी और सभी लापता ऊतकों, पुनर्जीवित करने की क्षमता होती है। (स्वस्थानी संकरण, इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई), और transcriptomics में इस तरह के एक अनुक्रम जीनोम के रूप में,) रूप में वापस दूर 1700 के दशक 2, तकनीकी पिछले 10-15 वर्षों के दौरान planarian क्षेत्र के क्षेत्र में प्रगति के रूप में अध्ययन इस ऐतिहासिक मॉडल जीव को अद्यतन किया है । विशेष रूप से, planarians हाल ही में आंख अनुसंधान 3 के लिए एक उभरती हुई मॉडल के रूप में लोकप्रियता हासिल की है।
Planarians केवल दो ऊतक प्रकार, फोटोरिसेप्टर न्यूरॉन्स और वर्णक कोशिकाओं के साथ prototypic आँखें है; यह अपने आंख स्टेम कोशिका आबादी के लक्षण वर्णन सक्षम और प्रदर्शन एक ही जीन के कई को विनियमित कि हड्डीवाला आंख डे हैvelopment planarians 4, 5 में संरक्षित कर रहे हैं। ऑप्टिक कप पृष्ठीय रूप में स्थित हैं और अर्द्ध चंद्र काले रंग की कोशिकाओं फोटोरिसेप्टर न्यूरॉन्स की सफेद, unpigmented डेन्ड्राइट और के शामिल, और आँखें एक ऑप्टिक व्यत्यासिका के माध्यम से मस्तिष्क के अंदर आना। पुनर्योजी प्रक्रियाओं का वर्णन 6 के लिए एक मॉडल होने के अलावा, planarian आंख अच्छी तरह से दृश्य तंत्र 7 के विकास के अध्ययन के लिए अनुकूल है, व्यवहार प्रतिक्रियाओं प्रकाश में 8, और व्यवहार 9 के तंत्रिका विज्ञान के आधार पर (planarians नकारात्मक phototaxis दिखाते हैं)।
Planarians में नेत्र उत्थान काफी हद तक दो मुख्य संदर्भों में अध्ययन किया गया है: सिर उत्थान के हिस्से के रूप में निम्नलिखित कत्ल 4, 10, और सिर्फ आंख ऊतकों 11 के छांटना के बाद, 12 13, 14 के साथ छेद पंच के माध्यम से किया गया है हालांकि कुछ अध्ययनों भी सिर्फ आँखों (आंशिक कत्ल) 15 के पीछे अंगविच्छेद जैसी शल्यक्रियाओं प्रदर्शन किया है। हालांकि, इन सभी विधियों कई सिर्फ आंख के अलावा अन्य (जैसे मस्तिष्क, आंतों, और nephridia के रूप में) के ऊतकों के नुकसान शामिल, संभावित परिणामों का विश्लेषण उलझी। आंख पृथक यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल आंख ऊतकों (विशेष रूप से मस्तिष्क को छोड़कर), डेटा में जिसके परिणामस्वरूप है कि आंखों के लिए अधिक विशिष्ट हैं करने के लिए काटना प्रतिबंधित करता है। साथ ही, उसका सिर धड से कीड़े कि 7-14 दिन लग खिला शुरू करने के विपरीत, आंख ablated कीड़े पृथक 12 के 24 घंटे के भीतर फीड होगा, आरएनएआई प्रयोगों (जहां आरएनएआई भोजन के माध्यम से वितरित किया जाता है) की अनुमति के performe जा करने के लिएसमवर्ती डी।
हालांकि आंख पृथक तकनीकी रूप से कठिन सफलतापूर्वक कत्ल से प्रदर्शन करने के लिए है, वर्तमान आंख छांटना शामिल पढ़ाई उनकी प्रक्रियाओं पर विस्तृत निर्देश शामिल नहीं किया है। इस वीडियो लेख के लक्ष्य को लगातार अंतर्निहित मस्तिष्क के ऊतकों को परेशान करने और संभव के रूप में कुछ अन्य ऊतकों को हटाने के बिना planarian ऑप्टिक कप दूर करने के लिए शोधकर्ताओं सक्षम बनाना है। इस विधि दोनों सिंगल और डबल आंख पृथक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता और जांच की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू है। सबसे उत्थान assays की तरह, आंख पृथक अच्छी तरह से दोनों औषधीय और आनुवंशिक (आरएनएआई) स्क्रीन, साथ ही व्यवहार अध्ययन के साथ संयोजन के लिए उपयुक्त है। यहाँ हम कीड़े की हैंडलिंग के लिए तरीके का वर्णन है, एक planarian कॉलोनी को बनाए रखने, और आंख पृथक तकनीक ही।
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Protocol
1. पशु संस्कृति और हैंडलिंग
नोट: यह प्रोटोकॉल Schmidtea मेडिटेरेनिया, एक अनुक्रम जीनोम 16, 17 है जो सामान्यतः उत्थान अनुसंधान के लिए प्रयोग किया जाता है के साथ एक द्विगुणित planarian प्रजातियों का उपयोग करता है। हालांकि, इस तरह के परख Girardia tigrina और Girardia dorotocephala (जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं) के रूप में अन्य प्रजातियों के साथ समान रूप से सफल है।
- "कीड़ा पानी" ultrapure (या फ़िल्टर विआयनीकृत) पानी में 0.5 ग्राम / एल समुद्र लवण से बना में कीड़े बनाए रखें। बाँझ polypropylene या कांच के कंटेनर का प्रयोग कीड़ा पानी धारण करने के लिए। देखें अनुपूरक फ़ाइल 1 कीड़ा पानी तैयारी पर जानकारी के लिए।
नोट: कभी साबुन के रूप में कंटेनर (या अन्य आपूर्ति) साफ करने के लिए साबुन का प्रयोग कीड़े लिए विषाक्त है; बजाय 70% इथेनॉल से पोंछ और हवा शुष्क करने की अनुमति। <ol> - दस्ताने पहनें planaria के साथ काम करते हुए उन्हें प्रदूषण से बचाने के लिए।
नोट: कीड़े पर्यावरण विषाक्त पदार्थों और रसायनों, साबुन, ब्लीच, शैम्पू, कंडीशनर, और हाथ लोशन सहित प्रति बहुत संवेदनशील हैं।
नोट: कालोनियों प्रति कीड़ा लीटर पानी कीड़े नहीं 500-1,000 से ज्यादा नहीं होनी चाहिए। प्रयोगों के लिए, पूरी तरह से जगह में पलकों छोड़ के बाद से हवा का प्रवाह इन व्यंजनों में बनाया गया है।
नोट: लिवर कोई हार्मोन या एंटीबायोटिक दवाओं को शामिल करना चाहिए और अच्छा होगा यदि पहले से जमे हुए नहीं किया जा। अपकेंद्रित्र प्यूरी ठंड से पहले (या खिलाने से पहले) हवा को हटाने और अस्थायी से भोजन को रोकने के लिए। खाद्य कंटेनर के तल पर नहीं उतरना चाहिए। प्यूरी की 1 एमएल 500-1,000 कीड़े के लिए पर्याप्त है।
- उन्हें चूसने से पहले कीड़ा पानी की एक छोटी राशि के साथ Backload pipettes।
- बल्कि कीड़ा से भी कीड़ा चारों ओर पानी ले जाने के लिए, उन्हें विंदुक के साथ स्पर्श करके कोमल शरीर कीड़े फाड़ रोकने में मदद करने की कोशिश करो।
- जब तक कीड़े स्थानांतरित करने या पानी की जगह शामिल किया गया प्रयोगात्मक व्यंजन रखें।
2. तैयारी
- प्रयोगों से पहले कीड़े कम से कम एक सप्ताह खिला बंद करो।
- कीड़े कि कर दिया गया है ≥1 सप्ताह के लिए तंग आ गया और लंबाई में कम से कम 5-7 मिमी हैं नहीं किया गया का चयन करें। एक पेट्री डिश 2/3 कीड़ा पानी से भरा करने के लिए कीड़े हस्तांतरण, और पकवान के नीचे एक मापक को स्लाइड द्वारा कीड़ा लंबाई की पुष्टि करें। उपाय wORMS जबकि पूरी तरह से बढ़ा और घूम रहा है।
नोट: एक ओर जहां छोटे (5-7 मिमी) कीड़े जब बाद में इम्यूनोफ्लोरेसेंस और स्वस्थानी संकरण विश्लेषण में, बड़ा कीड़े (8-10 मिमी) प्रदर्शन कर काम करने के लिए आसान के साथ कर रहे हैं बेहतर काम - खासकर जब काटकर अलग करना सीख। - सुनिश्चित करें कि कीड़े, पूरे undamaged, और हाल ही में पुनः नहीं हैं।
नोट: सामान्य कीड़े की तुलना में पुनः जेनरेट करने कीड़े सिर और / या पूंछ क्षेत्र में बहुत हल्का (या कोई) वर्णक होगा। - तो कीड़े पर आरएनएआई या औषधीय उपचार प्रदर्शन, इस बिंदु पर ऐसा करते हैं। तो कीड़े उपचार (आरएनएआई के लिए के रूप में) के हिस्से के रूप तंग आ चुके थे, तो चरण 2.2 जारी रखने से पहले इंतजार कम से कम 7 दिन पिछले खिला के बाद।
- कीड़े कि कर दिया गया है ≥1 सप्ताह के लिए तंग आ गया और लंबाई में कम से कम 5-7 मिमी हैं नहीं किया गया का चयन करें। एक पेट्री डिश 2/3 कीड़ा पानी से भरा करने के लिए कीड़े हस्तांतरण, और पकवान के नीचे एक मापक को स्लाइड द्वारा कीड़ा लंबाई की पुष्टि करें। उपाय wORMS जबकि पूरी तरह से बढ़ा और घूम रहा है।
- साफ 70% इथेनॉल के साथ काम करने की जगह और विदारक माइक्रोस्कोप आधार है और यह पूरी तरह से सूखने दें। चयनित कीड़े के पकवान गुंजाइश के बाईं ओर रखें। दायरे के दाईं ओर, के साथ एक 1 से 5/16-inch इंसुलिन सुई # 5 संदंश की एक जोड़ी, एक 31 जी जगहएमएल सिरिंज, और एक साफ हस्तांतरण पिपेट।
- सुनिश्चित करें कि उपकरणों बेंच (दूषित पदार्थों को पेश सकता है) छूने से रखा जाता है। (जैसे एक chopstick बाकी के रूप में) एक कठोर आइटम का उपयोग संदंश, सुई, और विंदुक साफ रखने के लिए। वैकल्पिक रूप से, एक ताजा ब्राउन (सख़्त) कागज तौलिया के शीर्ष पर जगह उपकरणों।
नोट: के रूप में वे दाएं हाथ के व्यक्तियों से संबंधित ये और बाद में निर्देश लिखे गए हैं। बाएं हाथ के व्यक्तियों दाएँ / बाएँ विपरीत दिशा-निर्देश चाहिए।
- सुनिश्चित करें कि उपकरणों बेंच (दूषित पदार्थों को पेश सकता है) छूने से रखा जाता है। (जैसे एक chopstick बाकी के रूप में) एक कठोर आइटम का उपयोग संदंश, सुई, और विंदुक साफ रखने के लिए। वैकल्पिक रूप से, एक ताजा ब्राउन (सख़्त) कागज तौलिया के शीर्ष पर जगह उपकरणों।
- काम करने की जगह के आगे, फाहा-मुक्त ऊतक वाइप का डिब्बा, ताजा कीड़ा पानी का एक स्रोत है, और कुछ अतिरिक्त हस्तांतरण pipettes (बेंच शीर्ष से संरक्षित) जगह। वितरण में आसानी के लिए एक प्लास्टिक की बोतल धोने में रखें कीड़ा पानी। इसके अलावा ablated जानवरों इकट्ठा करने के लिए गुंजाइश के अधिकार के लिए एक लेबल 12-अच्छी तरह से थाली (या 100 म पेट्रि डिश) जगह।
- एक कस्टम निर्मित पेल्टियर प्लेट का उपयोग कर कीड़े स्थिर हैं, तो टी में अवसाद में पेल्टियर थाली की स्थितिवह विदारक माइक्रोस्कोप के आधार और डीसी शक्ति स्रोत पर आउटपुट को समायोजित जब तक पेल्टियर प्लेट के काम की सतह पर्याप्त शांत है (आमतौर पर ~ 5 वी) .Alternatively, एक ठंडा प्लेट एक 100 म पेट्रि डिश भरने से साढ़े पानी के साथ भरा और कम से कम 24 घंटे के लिए फ्रीज। ढक्कन त्यागें और चीर-फाड़ दायरे के आधार पर 100 मिमी पकवान के नीचे रखें, फिर बर्फ (चित्रा 1 ए) की सतह पर सीधे एक 60 म पेट्रि डिश के ढक्कन जगह उल्टा।
- पानी के बाद 100 मिमी डिश में जम गया है, एक बर्फ की "ज्वालामुखी" थाली के बीच में दिखाई कर सकते हैं। यदि ऐसा होता है, बर्फ फ्लैट स्क्रैप करने, सतह से किसी भी अनियमितताओं को दूर करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
नोट: सर्जरी के दौरान बर्फ, पिघला देगा और अधिक कठिन ablations बना रही है। अग्रिम में कई बर्फ व्यंजन तैयार है, और जैसे ही 60 मिमी पकवान के ढक्कन चल शुरू होता है परख के दौरान लोगों के पिघलने के लिए जमे हुए लोगों की जगह।
- पानी के बाद 100 मिमी डिश में जम गया है, एक बर्फ की "ज्वालामुखी" थाली के बीच में दिखाई कर सकते हैं। यदि ऐसा होता है, बर्फ फ्लैट स्क्रैप करने, सतह से किसी भी अनियमितताओं को दूर करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
- तैयार करेंसर्जरी सतह। प्लास्टिक तेल फिल्म के एक 5 सेमी x 10 सेमी टुकड़ा काट (4 सेमी 2 अगर पेट्री डिश ठंड प्लेट का प्रयोग करके) और स्थिरीकरण डिवाइस के केंद्र पर रखें। एक फाहा-मुक्त ऊतक गुना एक वर्ग लगभग 2 सेमी 2 में पोंछ और फिल्म के शीर्ष पर रखें। सफेद फिल्टर पेपर 1.5-2 सेमी 2 का एक टुकड़ा कट और पोंछ के शीर्ष पर रखें। चित्रा 1 बी-1E देखें।
- पकड़ो मुड़ा हुआ एक दस्ताने उंगली से जगह में पोंछ, और कीड़ा पानी का उपयोग हल्के से सुनिश्चित करने के लिए कि यह मुड़ा रहता पोंछ गीला करने के लिए। रोल करने फ्लैट पोंछ एक हस्तांतरण पिपेट के किनारे का प्रयोग करें।
नोट: शीत तापमान बढ़ने से कीड़े रखने के लिए मदद करता है। कार्य "सूखी" भी स्थिरीकरण में मदद करता है। ऊतक कीड़े पूरी तरह से बाहर सुखाने के लिए (जो घातक है) की अनुमति के बिना फिल्टर पेपर के माध्यम से पानी बाती कृत्यों पोंछ, सर्जरी के दौरान कीड़ा नम रखते हुए।
- पकड़ो मुड़ा हुआ एक दस्ताने उंगली से जगह में पोंछ, और कीड़ा पानी का उपयोग हल्के से सुनिश्चित करने के लिए कि यह मुड़ा रहता पोंछ गीला करने के लिए। रोल करने फ्लैट पोंछ एक हस्तांतरण पिपेट के किनारे का प्रयोग करें।
3. सर्जिकल एबलेशन
- पर रखने के लिए एक हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग करेंफिल्टर पेपर पर ई कीड़ा पृष्ठीय पक्ष अप। पर प्रकाश स्रोत मुड़ें और Goosenecks प्रत्यक्ष ताकि प्रकाश कीड़ा पर केंद्रित है। ताकि आंखों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं (पूरे कीड़ा ध्यान में रखते हुए होने की जरूरत नहीं है) चीर-फाड़ गुंजाइश फोकस और आवर्धन समायोजित करें; 5X आवर्धन एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। सही करने के लिए तेल फिल्म कोणीय 30-40 डिग्री घूर्णन ताकि सिर (माइक्रोस्कोप के सामने की ओर) शोधकर्ता की ओर इशारा किया है, द्वारा कीड़ा दिशा में रखें।
- अतिरिक्त कीड़ा आंदोलन को रोकने के लिए चमकदार रोशनी के उपयोग से बचें। Planarians नकारात्मक phototaxis को प्रदर्शित करने और चमकदार रोशनी से बचने के लिए प्रयास करेंगे।
- कीड़ा ऊपर की ओर (ग्रसनी दिखाई खोलने के साथ) वेंट्रल पक्ष स्थिति में है, तो संदंश की सुस्त पक्ष का उपयोग धीरे कीड़ा पृष्ठीय पक्ष अप (आंखों से दिखाई के साथ) का स्थान। संदंश की तेज टिप के साथ पशु आ कोमल ऊतकों के माध्यम से फाड़ जब जानवर का स्थान बदलने की संभावना को कम करने के लिए से बचें।
- दाहिने हाथ में एक ताजा सुई / सिरिंज पकड़ो जैसे कि यह एक कलम (अंगूठे और तर्जनी के बीच) थे। पेल्टियर प्लेट (या पेट्री डिश ठंड प्लेट) के खिलाफ छोड़ दिया अंगूठे को संभालो, और एक आधार है जिस पर सिरिंज के निचले भाग आराम होगा (चित्रा 2 ए) के रूप में छोड़ दिया अंगूठे का उपयोग करें। माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखो, और यह सुनिश्चित करें सुई के बेवल दृश्यमान है।
नोट: सुई बहुत तेज कर रहे हैं। जब उनमें से निपटने सतर्क रहें। लेटेक्स या nitrile दस्ताने पहने हुए कुछ सुरक्षा प्रदान कर सकते हैं।- मदद सुई / सिरिंज प्रक्रिया के दौरान स्थिर रखें और हाथ मिलाते हुए से बचने के लिए छोड़ दिया अंगूठे का प्रयोग करें।
- सर्जरी सतह स्थिर पकड़ मदद करने के लिए छोड़ दिया अंगूठे और बाईं तर्जनी (सर्जरी सतह पर तर्जनी के साथ) के साथ के बारे में 40 डिग्री के कोण बनाओ।
- साथ मेंसुई ऊपर की ओर का सामना करना पड़ (एक चम्मच की तरह) की बेवल, आंख (चित्रा 2 बी) के समकोण पर सुई की स्थिति। सुई की नोक का प्रयोग धीरे ऊतक आँख की ऑप्टिक कप (सफेद, unpigmented क्षेत्र) overlying की पतली परत घुसना करने के लिए, दाईं से बाईं ओर scooping। बहुत धीरे किसी भी रंजित ऑप्टिक कप के भीतर स्थित ऊतकों, देखभाल करने के तल पंचर या ऑप्टिक कप की सीमाओं को नष्ट नहीं।
- कीड़ा प्रक्रिया के दौरान किसी भी बिंदु पर> 1-2 मिनट के लिए फिल्टर पेपर पर किया गया है, तो कीड़ा rehydrate करने के लिए कीड़ा पानी की एक बूंद जोड़ें।
ध्यान दें: निर्जलीकरण फाड़ चोटों के कृमि की संवेदनशीलता में वृद्धि होगी।
- कीड़ा प्रक्रिया के दौरान किसी भी बिंदु पर> 1-2 मिनट के लिए फिल्टर पेपर पर किया गया है, तो कीड़ा rehydrate करने के लिए कीड़ा पानी की एक बूंद जोड़ें।
- काला रंजित ऊतकों (रंगद्रव्य कोशिकाओं) के सभी जब तक दोहराएँ कदम 3.3, साथ ही ऑप्टिक कप (फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के द्रुमाश्मों) की सफेद ऊतकों के सभी के रूप में हटा दिया जाता है। ध्यान से एक ऊतक पोंछ के साथ पोंछते द्वारा सुई के अंत में फंस excised ऊतकों निकालें। तो डबल आंख Ablaमोर्चे, वांछित है इस बिंदु पर दूसरी आंख काटकर अलग करना।
नोट: चोट से बचने के लिए, सुई एक साफ ऊतक के साथ सुई लोभी अंगूठे और तर्जनी के साथ आयोजित वाइप, तो दूसरी ओर का उपयोग कर के माध्यम से अंगूठे और तर्जनी से दूर पोंछ सुई खींचने के लिए से साफ किया जा सकता। वैकल्पिक रूप से, सुई एक गीला ऊतक पोंछ की सतह पर पोंछा और सफाई के लिए जांच की जा सकती। - समाप्त होने पर, ताजा कीड़ा युक्त पानी एक लेबल पकवान को कीड़ा स्थानांतरित करने के लिए एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें। समूह डेटा का विश्लेषण करते हैं, तो एक भी 100 म पेट्रि डिश में 20 कीड़े अप करने के लिए जगह। एक ही व्यक्ति में उत्थान पर नज़र रखने के लिए समय के साथ करते हैं, तो एक 12 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में 1 कीड़ा जगह। एक बार सभी कीड़े स्थानांतरित कर रहे हैं, बर्तन / कुओं से सभी कीड़ा पानी को हटाने और अधिक ताजा कीड़ा पानी के साथ की जगह कीड़े कुल्ला।
- फिल्टर से कीड़े निकालने के लिए, कीड़ा पानी की एक छोटी राशि के साथ विंदुक backload और कृमि पर पानी को छोड़ दें। यह टी लिफ्ट चाहिएवह फिल्टर पेपर बंद कीड़ा, तुरंत हस्तांतरण के लिए पिपेट में चूसा किया जाना है।
- ~ 20 डिग्री सेल्सियस (कमरे के तापमान) में प्रयोगों प्रकाश से संरक्षित सेते हैं और पुनर्योजी प्रक्रिया का पालन करें।
नोट: कीड़े एक तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर एक निरंतर तापमान बनाए रखने के लिए भंडारित किया जा सकता है, लेकिन इस सख्ती से आवश्यक नहीं है। अधिकांश कमरे के तापमान केवल 5 डिग्री सेल्सियस, जो कीड़ा के पुनर्जीवित करने की क्षमता को प्रभावित नहीं करेगा के हिसाब से बदलती। - अगर वांछित, इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री के लिए कीड़े (आंकड़े 3-4 देखें) और / या स्वस्थानी संकरण जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण में ठीक। विभिन्न निर्धारण के तरीकों planarian इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री 18, 19, 20 के लिए और स्वस्थानी संकरण 21, 22, 23 प्रोटोकॉल में मौजूद हैं।
- जब प्रयोगों निष्कर्ष निकाला जाता है, sacrifice पकवान से कीड़ा पानी को हटाने और 70% इथेनॉल के साथ की जगह कीड़े रहते हैं। 3-5 मिनट के लिए कीड़े सेते हैं, कीड़े के लिए जाँच lyse और भूरा चालू करने के लिए।
- एक बार बलिदान सामान्य अपशिष्ट धारा में गैर इलाज किया कीड़े रखें। पर्यावरण, विशेष रूप से गैर देशी प्रजातियों के रूप में रहते हैं कीड़े को शुरू करने से बचें।
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Representative Results
पहले 1-2 घंटे के बाद सर्जरी के लिए, जानवरों बरकरार कीड़े (हालांकि वे अभी भी आ जाएगा) की तुलना में कमी आई आंदोलन प्रदर्शन कर सकते हैं। अगर वांछित, कीड़े सर्जरी के 24 घंटे के भीतर (उदाहरण के लिए, आरएनएआई खिला के लिए) खाएंगे। जब समय के साथ एक ही व्यक्ति में आंख उत्थान के बाद, दोनों सर्जरी (बरकरार) से पहले और 1 घंटे के बाद पृथक (hPa) पर प्रत्येक कीड़ा की एक तस्वीर लेने के लिए सुनिश्चित करें। द्वारा 4 दिनों के बाद पृथक (डीपीए) पुनः रंगद्रव्य कोशिकाओं दिखाई देना चाहिए, और 14 डीपीए पूरे आंख पूरी तरह से पुनर्जीवित होगा (चित्रा 3 ए बी) द्वारा। यह फोटोरिसेप्टर न्यूरॉन्स और मस्तिष्क (चित्रा -3 सी) के लिए उनके विन्यास, साथ ही दृश्य प्रणाली (चित्रा 4 ए-सी) के कार्यात्मक वसूली भी शामिल है। सफल ablations मस्तिष्क (चित्रा 4D-ई) की अंतर्निहित ऊतकों को परेशान नहीं करेगा, न ही जानवर (चित्रा 5 ए) को अन्य चोटों परिचय। असफल ablationsवाले अत्यंत बड़े छांटना दो आँखें (चित्रा 5 ब) से जोड़ता है, पशु (चित्रा 5C) के पार्श्व मार्जिन को आँसू, और / या घाव साइटों कि उदर एपिडर्मिस (चित्रा 5D) के माध्यम से प्रहार: के साथ जानवरों शामिल हैं। इसके अलावा, असफल ablations पूरे ऑप्टिक कप का अधूरा हटाने, दोनों सफेद unpigmented ऊतकों और काले रंग की कोशिकाओं (चित्रा 5E-एफ) के शामिल शामिल हैं।
चित्र 1: सर्जरी तैयारी। (ए) ठंड प्लेट निर्माण का आरेख, एक 100 म पेट्रि डिश के नीचे (बर्फ से भरा) और एक 60 म पेट्रि डिश (बर्फ की सतह पर उल्टा रखा) के ढक्कन का। (बी) सर्जरी सतह का आरेख, (ऊपर से नीचे) सफेद फिल्टर पेपर, एक नम मुड़ा ऊतक पोंछ, के ढेर और तेल फिल्म के एक टुकड़े से बना।(सी) सर्जरी की स्थापना (दाएं हाथ के लिए)। एक: चीर-फाड़ गुंजाइश, बी: gooseneck प्रकाश, सी: सर्जरी सतह, डी: पेल्टियर थाली, ई: 5-7 मिमी कीड़े की पृथक के लिए तैयार पकवान, एफ: कीड़ा पानी की बोतल धोने, जी: chopstick बाकी पकड़े साफ हस्तांतरण पिपेट, एच: chopstick बाकी पकड़े सुई / सिरिंज, मैं: chopstick बाकी पकड़े संदंश, जम्मू: अतिरिक्त हस्तांतरण pipettes के कंटेनर। (डी) कस्टम पेल्टियर थाली विन्यास। (ई) पेट्री डिश ठंड प्लेट विन्यास। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: पृथक दौरान हाथ और सुई / सिरिंज की स्थिति। (ए) हाथों की नियुक्ति (दाएं हाथ के लिए)। ध्यान दें कि छोड़ दिया अंगूठे सिरिंज का समर्थन करने के लिए किया जाता है (आयोजितदाहिने हाथ में) आंदोलन को कम करने। (बी) कीड़ा की आंख के संबंध में सुई की नियुक्ति। ध्यान दें कि सुई के beveled सतह ऊपर की ओर का सामना करना पड़ता। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: ablated planarian आँखों को पुनर्जीवित। Schmidtea मेडिटेरेनिया की आकारिकी planarians निम्नलिखित (ए) डबल आंख पृथक और (बी) एक आंख पृथक आँखों regrowing। (सी) Immunohistochemistry फोटोरिसेप्टर न्यूरॉन्स (विरोधी arrestin) एकल नेत्र पृथक निम्नलिखित के उत्थान दिखा। बरकरार कीड़े सर्जरी से पहले दिखाए जाते हैं, और पुन: बनाता दिन 4 और 14 पृथक के बाद कम से दिखाए जाते हैं। एक भी आंख ablations के लिए, बाईं आंख थाblated और दाईं आंख के लिए एक आंतरिक (रिहाई) नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। लाल तीर: ablated आँखें। स्केल सलाखों = 100 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: दृश्य प्रणाली के कार्यात्मक वसूली पृथक के बाद। (ए - सी) कार्यात्मक परख planarian फोटोफोबिया परीक्षण करने के लिए। (ए) अक्षुण्ण कीड़े इस तरह के एक हरे रंग की लेजर सूचक से एक स्थान के रूप में प्रकाश के क्षेत्रों, के माध्यम से यात्रा करने से बचें। (बी) के 24 घंटे के बाद पृथक में, "अंधा" डबल आंख ablated कीड़े प्रकाश स्पॉट के माध्यम से यात्रा। (सी) 7 दिन के बाद पृथक में डबल आंख ablated कीड़े प्रकाश परिहार ठीक करने के लिए पर्याप्त रूप से दृश्य प्रणाली पुनर्जीवित किया है। पीला तीर: असामान्य व्यवहारअल प्रतिक्रिया। (डी - ई) आँखों का पृथक ऑप्टिक कप के ऊतकों तक ही सीमित है, और अंतर्निहित मस्तिष्क के ऊतकों को परेशान नहीं करता है। (डी) मस्तिष्क वास्तुकला (विरोधी synapsin) दिखा Immunohistochemistry 1 घंटे के बाद पृथक करने के लिए पृथक से पहले से अपरिवर्तित है। (ई) hematoxylin और eosin (एच एंड ई) एक अनुप्रस्थ क्षति दिखा खंड में 1 घंटे के बाद पृथक पर धुंधला काफी हद तक ablated ऑप्टिक कप के स्थल तक सीमित है। (काले रंग कोशिकाओं के साथ) सही आंख आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। लाल तीर: ablated आँखें। स्केल सलाखों = (एसी) 1 मिमी में 1 मिमी, में 100 सुक्ष्ममापी (DE)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: सफल और असफल ablations की पहचान। (ए) सफल सिंगल और डबल आंख ablations (5 मिनट के बाद पृथक पर) घाव है कि मूल ऑप्टिक कप के आकार में मोटे तौर पर इसी तरह की हैं। (बी - ई) असफल ablations: (बी) बहुत ज्यादा ऊतक निकाल दिया जाता है या घाव दो आँखें, (सी) घाव स्थल आँसू जोड़ता है और मार्जिन तक फैली, (डी) घाव बहुत गहरा है और से के माध्यम से pokes उदर (डी ') की ओर, और (ई - एफ) के पृष्ठीय (डी) ऑप्टिक कप ऊतकों के सभी नहीं निकाल दिए जाते हैं, दोनों आकृति विज्ञान (ई) कल्पना और फोटोरिसेप्टर न्यूरॉन्स (एफ) के विरोधी arrestin धुंधला द्वारा। पीला तीर: धर्मपथ से हटनेवाला ablations। पीला हलकों: पृथक साइट। स्केल सलाखों = 100 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यह आंख पृथक तकनीक मस्तिष्क के ऊतकों को छोड़कर और आंख के ऊतकों को मुख्य रूप से छांटना सीमित करके (जैसे छेद पंच के रूप में) वर्तमान तरीकों पर बेहतर बनाता है। अभ्यास के साथ, इस तकनीक, सबसे अधिक व्यक्तियों द्वारा किया जा सकता तकनीशियनों अनुभवहीन लेकिन ईमानदार स्नातक छात्रों के लिए microsurgeries में अनुभवी से। यह अनुशंसित है कि इस तकनीक प्रयोगों में ablations का उपयोग कर, सहित (जब संभव हो) इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री द्वारा या आंख मार्कर (रों) 4, 5, 13 के लिए स्वस्थानी संकरण में सभी आंख ऊतकों को पूरी तरह निकाला की पुष्टि करने से पहले कई बार अभ्यास किया जा। इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम के ऊतकों से बाहर स्कूपिंग है। यह महत्वपूर्ण है या तो बहुत अधिक या बहुत कम ऊतक को निकालना ही नहीं। यह सुई के साथ भी गहरा scooping नहीं, कृमि के उदर पक्ष के माध्यम से मर्मज्ञ से बचने के लिए से बचा जा सकता। nee की नोकdle केवल 0.4 के बारे में मिमी गहरी डाला जाना चाहिए, और सुई के beveled भाग जाना कभी नहीं करना चाहिए आंख के माध्यम से सभी तरह। विशेष देखभाल की दो आंखों के बीच नाजुक ऊतकों (हर आंख की काली रंजित क्षेत्र की औसत दर्जे किनारे हर आंख की सीमाओं का प्रतिनिधित्व करता है) को नुकसान नहीं करने के लिए लिया जाना चाहिए। आंख और कृमि के बाहर का मार्जिन के बीच नुकसान भी बचा जाना चाहिए। छोटे कीड़े अधिक चीर या अनजाने में घायल होने की संभावना है, इसलिए बड़े कीड़े (विशेष रूप से अभ्यास के लिए) के उपयोग की सिफारिश की है। इस तकनीक का मुख्य सीमाएं हैं कि यह अपेक्षाकृत समय गहन (और उच्च throughput स्क्रीन के लिए उपयुक्त नहीं) है, और यह परिणाम की सटीकता सुनिश्चित करने का अभ्यास में एक प्रारंभिक निवेश की आवश्यकता है। हालाँकि, व्यवहार के साथ 10 आँखों ~ 15 मिनट में ablated जा सकता है।
समस्या निवारण के लिए एक प्रमुख क्षेत्र प्रक्रिया के दौरान planarians अभी भी ध्यान में रखते हुए है। दो मुख्य कारण कीड़े पर्याप्त स्थिर ablations प्रदर्शन करने के लिए नहीं कर रहे हैं(क) बहुत अधिक पानी और (ख) ठंडे तापमान के नुकसान कर रहे हैं। (ए) अतिरिक्त planarian पानी कि सर्जरी की सतह पर ताल करते हुए स्थानांतरित कीड़े कीड़े के लिए कदम और सर्जरी को मुश्किल करने की अनुमति देगा। सर्जरी सतह (फाहा-मुक्त ऊतक पोंछ और फिल्टर पेपर) केवल नम रहना चाहिए। प्रक्रिया पोंछ कीड़ा पानी के साथ संतृप्त हो जाता दौरान किसी भी समय, यह या तो प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए, तो या एक हस्तांतरण पिपेट धीरे ऊतक से अतिरिक्त तरल पदार्थ को निकालने के लिए मिटा इस्तेमाल किया जा सकता (हमेशा पोंछ और नहीं फिल्टर पेपर से आकर्षित)। ऊतक वाइप भी सर्जरी की सतह पर अतिरिक्त पानी पूलिंग निकालने के लिए किया जा सकता है। इस प्रक्रिया को कीड़े की संख्या ablated जा रहा है पर निर्भर करता है, कई बार दोहराया जा करना पड़ सकता है। (बी) पेट्री डिश ठंड प्लेट की स्थापना का उपयोग कर रहे हैं, तो जैसे ही बर्फ पिघलने शुरू होता है और 60 म पेट्रि डिश ढक्कन फ्लोट करने के लिए शुरू होता है ठंड प्लेट बदलना याद रखें। यह दोनों एक स्थिर सर्जरी सतह और एक उचित रूप से ठंड सतह सुनिश्चित करेगा। वैकल्पिक रूप से, पेल्टियर प्लेट का उपयोग कर यदिसेट अप, ध्यान रखें कि उपयोग की ज 45 मिनट 1 के बाद, बाहरी छल्ले में गर्मी केंद्र में ठंड प्लेट पर काबू पाने जाएगा और सभी ठंडा खो जाएगा हो। यदि ऐसा होता है, बंद यह ablations शुरू करने से पहले कमरे के तापमान में आने के लिए अनुमति देने के लिए 5-10 मिनट के लिए पेल्टियर प्लेट बदल जाते हैं।
समस्या निवारण का एक अन्य क्षेत्र पकवान और सर्जरी सतह और फिर से वापस बीच कीड़ा स्थानांतरण के दौरान है। ablated कीड़े फिल्टर पेपर से दूर करने के लिए कड़ी मेहनत कर रहे हैं, फिल्टर पेपर के शीर्ष पर तरल पूल तक कीड़ा पर कीड़ा पानी की एक बूंद जगह। कीड़े बाद हमेशा की तरह हस्तांतरण पिपेट में चूसा जा सकता है। यदि समस्या जारी रहती है, इसके उदर पक्ष पर कीड़ा flipping पहले (संदंश की सुस्त पक्ष का प्रयोग करके) का प्रयास करें। एक कीड़ा हस्तांतरण विंदुक के अंदर फंस गया हो जाता है, यह आम तौर पर एक संकेत है कि बहुत अधिक पानी में लिया गया है (कीड़े के बारे में एक इंच आगे की तुलना में कोई हस्तांतरण पिपेट में तैयार किया जाना चाहिए) है। एक कीड़ा एक हस्तांतरण पिपेट में फंस निकालने के लिए, कीड़ा वाट के 1-2 एमएल तैयारएर पिपेट में है, ताकि कीड़ा पानी के साथ कवर किया जाता है। मजबूती से पिपेट की ओर झटका जब तक कीड़ा पिपेट की दीवार से अलग हो जाता है और चल रहा है।
सुई सुस्त हो जाता है, तो एक नई सुई / सिरिंज के साथ बदलें। इसे का उपयोग ≥30 आँखों काटकर अलग करना के बाद सुई की जगह पर विचार करें। एक ऊतक के साथ पोंछते द्वारा उच्छेदन ऊतकों के अत्यधिक हटाने भी सुस्त सुई कर सकते हैं, ablations और अधिक कठिन बना रही है मिटा सकते हैं। यदि उच्छेदन ऊतकों प्रक्रिया (यहां तक कि कई जानवरों के पार) के दौरान सुई के beveled भाग के भीतर रहने के यह ठीक है। हमेशा जब भिन्न स्थिति का कीड़े के बीच (जैसे wildtype बनाम आरएनएआई कीड़े) को बदलने के एक ताजा सुई / सिरिंज का उपयोग, साथ ही जब नई पृथक सत्र शुरू (यानी अलग अलग दिनों पर)।
इस शल्य आंख पृथक तकनीक planarians में प्रकाश प्रेरित व्यवहार (और उनके आनुवंशिक और तंत्रिका संबंधी आधार) की जांच के लिए एक सशक्त साधन है, विशेष रूप सेजब औषधीय उपचार या आरएनए हस्तक्षेप के साथ संयुक्त। नेत्र पृथक भी एक बड़ा साधन है जिसके द्वारा तंत्र विवो में अंतर्जात planarian आंख उत्थान (और आंख स्टेम सेल रखरखाव और भेदभाव) को विनियमित स्पष्ट करना है। सबसे रीढ़ आंख ऊतकों को पुनर्जीवित करने के बहुत ही सीमित क्षमता, कैसे समझ planarians उनकी आँखों को पुनर्जीवित करने के भविष्य के उपचारों में अनुवाद के लिए संभव तंत्र की पहचान करने में महत्वपूर्ण होगा सक्षम हैं के रूप में।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
, पेल्टियर प्लेटों के बारे में जानकारी के लिए विरोधी arrestin एंटीबॉडी के लिए माइकल लेविन, और Junji Morokuma लेखकों कार्यात्मक परख के साथ सहायता के लिए इस आंख पृथक तकनीक, टेलर बर्खहोल्ज़ को परिपूर्ण के लिए मिशेल डेओचैंड धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम के पश्चिमी मिशिगन विश्वविद्यालय WSB करने से एक SFSA अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands | SS15-10 | "10 Gallon" box (net weight 3 lbs) |
| Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe | Kimberly-Clark | 34155 | 4.5 x 8.5 in |
| Whatman #2 filter paper | Sigma | WHA1002125 | Circles, 125 mm diameter, white |
| Easy Touch Insulin syringe (with needle) | Pet Health Market | 17175-04 | U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm x 15 mm |
| 60 mm Petri dish | VWR | 25384-092 | 60 mm x 15 mm |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Inox, straight tip , 11 cm |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile |
| Parafilm M paraffin film | Brand | 701606 | 4 in x 125 ft roll |
| 12-well untreated tissue culture plate | VWR | 15705-059 | Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand |
| Plastic food containers (for colony) | Ziploc | Large rectangle | 2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16" |
| Planaria (Girardia tigrina) | Carolina Biological | 132954 | Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work. |
| Planaria (Schmidtea mediterranea) | n/a | n/a | S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals. |
| Brown paper towels | Grainger | 2U229 | 9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED |
| Wash bottle (for worm water), optional | VWR | 16650-275 | Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL |
| Anti-synapsin antibody, optional | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Supernatant |
| Anti-arrestin antibody, optional | n/a | n/a | Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University |
| Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional | Nalge Nunc International Corporation | 2324-0015 | 15 L, polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers |
| Custom Peltier plate, optional | Williams Machine, Foxboro, MA | n/a | Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University: Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2). The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate. |
| DC power source (for Peltier plate), optional | B & K Precision | 1665 | Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps. |
| Other common supplies | |||
| Gloves | |||
| Razor blade | |||
| Scissors | |||
| Dissecting scope with gooseneck lighting | |||
| Chopstick rests, optional |
References
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