プラナリアで瞳の再生を研究するための外科切除アッセイ
Summary
このプロトコルは、一貫して、周囲の組織を乱すことなく、プラナリア目（光学カップ）を切除する方法を示しています。インスリン注射針と注射器を使用して、一方または両方の目のどちらかは、目の再生、視覚的な再生の進化、および光誘起行動の神経基盤を調節するメカニズムの調査を容易にするために、アブレーションさせることができます。
Abstract
成体幹細胞と再生機構の研究では、プラナリア扁形動物は、in vivoモデル系の主食です。これは彼らの豊富な多能性幹細胞集団と、ほとんどの動物のために壊滅的だろう怪我した後、すべての細胞や組織の種類を再生する能力に大きな部分的に起因します。最近、プラナリアは、目の再生のためのモデルとして人気を得ています。 （2つの組織タイプから成る：色素細胞及び光受容体）全体の目を再生する能力は、視覚系の再生を制御する機構の切開を可能にします。眼アブレーションは、再生だけで眼の組織に大きく制限されていることが最も重要なものの眼特異的経路およびメカニズムを調べるため（例えば断頭又は穴パンチのような）他の技術を超えるいくつかの利点を有します。このビデオの記事の目的は、確実に脳を乱すまたは組織を囲むことなく、プラナリアの光学カップを削除する方法を実証することです。ワームや確立コロニーのメンテナンスの取り扱いも記載されています。この技術は、外科的にコールドプレート上に固定化されたプラナリアの眼杯をかき出すために31 G 5/16インチのインスリン針を使用します。この方法は、アプリケーションの広い範囲を可能にする、目が1〜2週間以内に再生すると、単一及び二重の両方の目の切除を包含する。特に、このアブレーション技術は、容易に再生機構とその進化、目の幹細胞およびそれらの維持、及びphototaxic行動反応とその神経基盤のより良い理解のために、薬理学的および遺伝的（RNA干渉）スクリーンと組み合わせることができます。
Introduction
プラナリアは、成体幹細胞媒介再生を研究するための強力なモデル生物です。これらの非寄生淡水扁形動物は、その中枢神経系および脳1を含む任意およびすべての不足している組織を、再生する能力を有しています。 （ インサイチュハイブリダイゼーション 、免疫組織化学、RNA干渉（RNAi）、およびトランスクリプトでは 、このような配列決定ゲノムなど）にまでさかのぼる過去10〜15年間プラナリア分野において1700年代2、技術の進歩などの検討は、この歴史的なモデル生物を更新しました。具体的には、プラナリアは最近、目の研究の3のための新たなモデルとして人気を得ています。
プラナリアは2つだけの組織タイプ、感光体の神経細胞と色素細胞との原型の目を持っています。これは、その目の幹細胞集団の特性を有効にし、同じ遺伝子の多くは、脊椎動物の眼ドを規制することを示しましたvelopmentはプラナリア4,5に保存されています。光学カップは視交叉を介して脳を背側に位置する感光体ニューロン及び半月黒色素細胞の白、無着色の樹状突起で構成され、目の神経支配されています。再生プロセス6を解明するためのモデルであることに加えて、プラナリア眼は光に対して視覚的機構7、行動反応の進化を研究に適している8、及び行動9の神経学的基礎（プラナリアは、負の走光性を表示します）。
断頭4、10以下のヘッド再生の一部として、ちょうど眼組織11の切除に続いて、12：プラナリアにおける眼の再生は、主に二つの主要な文脈で検討されています</SUP>。それは単純明快であるとして、目の再生のほとんどのプラナリアの研究では、断頭メソッドを使用しています。いくつかの研究はまた、単に目（部分断頭）15の後ろに切断術を行っているがこれまでで最も一般的なプラナリア眼の切除方法は、細かいガラス毛細管13、14とパンチ穴を経由してきました。しかし、これらの方法の全ては、潜在的に結果の解釈を複雑に、（例えば、脳、腸、およびnephridiaなど）だけで、目以外の多くの組織の喪失を伴います。ここに提示眼アブレーションプロトコルは、眼に対してより特異的であるデータが得られた（具体的には脳を除く）眼組織への切除を制限します。また、給紙を開始するために7~14日かかる断頭ワームとは異なり、眼アブレーションワームperformeする（RNAiは食物を介して送達される）RNAi実験を可能にする、切除12の24時間以内に送ります同時にdは。
目のアブレーションが正常に断頭よりも実行することは技術的に難しいですが、目の切除を含む現在の研究では、その手順の詳細な手順を含めていません。このビデオの記事の目標は、一貫して基本的な脳組織を乱すし、できるだけ少ない他の組織を除去することなく、プラナリアの光学カップを削除するために、研究者を有効にすることです。この方法は、単一及び二重の両方の目の切除のために使用され、研究の広い範囲に適用可能であることができます。最も再生アッセイのような、眼の切除は、薬理学的および遺伝的（のRNAi）スクリーニング、ならびに行動研究の両方との組合せに適しています。ここでは、プラナリアコロニー、および眼のアブレーション技術自体を維持し、ワームの取り扱い方法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この眼アブレーション技術は、脳組織を除くと眼組織に主に切除を制限することによって（例えば、ホールパンチなど）現行の方法を改善します。練習では、この技術は、経験の浅いが、良心的な学部の学生にmicrosurgeriesに経験した技術者から、ほとんどの人によって行うことができます。なお、この技術は、前免疫組織化学によって、または眼のマーカー<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ペルチェプレートについては、この抗アレスチン抗体のための機能的アッセイの支援のために眼アブレーション技術、テイラー・バークホルツ、マイケル・レビン、及び淳二Morokumaを完成するためのミッチェル・デオッカンド感謝したいです。この作品は、WSBにウェスタンミシガン大学からSFSAの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands | SS15-10 | "10 Gallon" box (net weight 3 lbs) |
| Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe | Kimberly-Clark | 34155 | 4.5 x 8.5 in |
| Whatman #2 filter paper | Sigma | WHA1002125 | Circles, 125 mm diameter, white |
| Easy Touch Insulin syringe (with needle) | Pet Health Market | 17175-04 | U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 x 15 mm |
| 60 mm Petri dish | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Inox, straight tip , 11 cm |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile |
| Parafilm M paraffin film | Brand | 701606 | 4 in x 125 ft roll |
| 12-well untreated tissue culture plate | VWR | 15705-059 | Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand |
| Plastic food containers (for colony) | Ziploc | Large rectangle | 2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16" |
| Planaria (Girardia tigrina) | Carolina Biological | 132954 | Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work. |
| Planaria (Schmidtea mediterranea) | n/a | n/a | S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals. |
| Brown paper towels | Grainger | 2U229 | 9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED |
| Wash bottle (for worm water), optional | VWR | 16650-275 | Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL |
| Anti-synapsin antibody, optional | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Supernatant |
| Anti-arrestin antibody, optional | n/a | n/a | Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University |
| Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional | Nalge Nunc International Corporation | 2324-0015 | 15 L, polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers |
| Custom Peltier plate, optional | Williams Machine, Foxboro, MA | n/a | Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University: Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2). The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate. |
| DC power source (for Peltier plate), optional | B & K Precision | 1665 | Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps. |
| Other common supplies | |||
| Gloves | |||
| Razor blade | |||
| Scissors | |||
| Dissecting scope with gooseneck lighting | |||
| Chopstick rests, optional |
References
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