Summary
خلال العدوى، الليستريه المستوحدة قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغ لاستعمار الدماغ. في هذا البروتوكول، ونحن لشرح كيفية تقييم الاستعمار الجرثومي للأجهزة بعد إصابة فئران. ويرد إجراء لأداء الجهاز كله نضح لتصميم محددة من أرقام البكتيرية في حمة الدماغ.
Abstract
الليستريه المستوحدة من مسببات الأمراض بكتيرية داخل الخلايا التي كثيرا ما يرتبط بالعدوى المنقولة عن طريق الأغذية. قدرة لام الليستريه على عبور حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) المتعلقة بأنها يمكن أن تؤدي إلى التهاب السحايا والتهاب الدماغ مهددة للحياة. بي بي بي يحمي المكروية الدماغ من مختلف نواتج الأيض السامة ومسببات الأمراض الميكروبية الموجودة في الدم بعد الإصابة، ويدعم ذلك التوازن في الدماغ. أن الآليات التي لام الليستريه موجودة في مجرى الدم عبر BBB التسبب في الدماغ العدوى ليست مفهومة فهما كاملا وهناك أيضا الافتقار إلى نظام نموذجي قوية لدراسة التهابات الدماغ لام الليستريه. هنا، نحن نقدم نموذج عدوى ماوس بسيطة لتحديد ما إذا كانت البكتيريا قد عبرت بي بي بي وكوانتيتاتي عبء البكتيريا التي قد استعمرت الدماغ في فيفو. في هذا الأسلوب، الحيوانات أصيبوا عن طريق الوريد مع الليستريه ل. وقد euthanized معاملة إنسانية بالتعرض لأول أكسيد الكربون2 متبوعاً بخلع عنق الرحم. وأجرى التروية القلبية للحيوانات قبل حصادها الأجهزة المصابة. تم جمع الدم قبل التروية ويتحدد العدد من البكتيريا في الجهاز أو مل من الدم تصفيح تخفيف هوموجيناتيس الدم أو الجهاز على ألواح أجار وإحصاء عدد المستعمرات وشكلت. يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة التفاعلات يجند مستقبلات الرواية التي تعزز الإصابة بالدماغ لام الليستريه ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة مسببات الأمراض البكتيرية متعددة.
Introduction
هو بكتيريا إيجابية الليستريه المستوحدة ممرض داخل الخلايا اختياري وواحد مسببات معظم القاتل المنقولة بالأغذية في جميع أنحاء العالم. ابتلاع الطعام لام الليستريه الملوثة يمكن أن يؤدي إلى داء الليستَريات في البشر، وهو مرض الغازية شديدة تستهدف معظم الحوامل، والأطفال حديثي الولادة، والأفراد المسنين، والمناعة1. لام الليستريه من بين الأسباب الرئيسية للوفاة بالممرضات المنقولة بالأغذية في الولايات المتحدة، ومعدلات الوفاة من داء الليستَريات يصل إلى 20-30 ٪، أعلى لجميع مسببات الأمراض التي تنقلها الأغذية2. حاليا لا يوجد لقاح لام الليستريه وقدرة البكتيريا على فعالية وامتدت إلى الأجهزة البعيدة والدماغ بعبور حاجز الدم في الدماغ (BBB) قد تؤدي إلى التهاب السحايا مهددة للحياة واستعمار الدماغ3 , 4 , 5 , 6-التهاب السحايا الجرثومي عادة شديدة؛ الإصابات أثناء استرداد معظم الناس الذين يتلقون العلاج، يمكن أن يسبب مضاعفات خطيرة مثل، وتلف الدماغ، وفقدان السمع أو إعاقات التعلم في الأطفال. ومن المتوقع لام الليستريه لحساب 10 في المائة على الأقل من كل المجتمع اكتسب التهاب السحايا في الولايات المتحدة7.
طريقا رئيسيا لنشر البكتيريا إلى الدماغ والسحايا من خلال مجرى الدم. البكتيريا المتداولة في الأوعية الدموية في الدماغ قادرة على عبور BBB يسبب التهاب الدماغ. بي بي بي هو نظام حاجز vascularized العالية التي تحمي الدماغ من الجسيمات الأجنبية المتداولة في الدم. خلايا بطانية تشكل طبقة خطوط سطح الداخلية ل الأوعية الدموية8،9. وبالإضافة إلى لام الليستريه، مسببات الأمراض البكتيرية متعددة مثل وجود النيسرية السحائية، العقدية الرئوية، الإشريكيّة القولونية، و النزلة النزفية من النوع باء (Hib) قادرون على استعمار الدماغ بعبور ال بي بي بي3،4،،من56. ومع ذلك، عند دراسة أعباء البكتيرية في دماغ الفئران المصابة، من المهم لتحديد ما إذا كانت البكتيريا عبروا BBB، خلاف ذلك عبء البكتيرية في الدماغ قد تمثل البكتيريا التي لا تزال في الأوعية الدموية للمخ. وبالتالي، من الضروري أن نتخلل الفئران من كل الدم قبل تحديد الوحدات المكونة للمستعمرة (زيمبابوي) من هوموجيناتيس الدماغ.
في هذه الدراسة، يصف لنا في فيفو أساليب دراسة العدوى الليستريه لام المخ. للأساليب الموصوفة هنا، استخدمنا لام الليستريه سلالة 10403S. المستوحدة ل. 10403S واحد من سلالات المختبر الأكثر استخداماً لدراسة داء الليستَريات النظمية في طراز الماوس من عدوى10. ويستند هذا البروتوكول الحقن القياسية لام الليستريه يليه نضح الفئران. ويرد في الشكل 1ملخص تخطيطي البروتوكول العدوى في الفئران. لام الليستريه-جمعت العقول المصابة والأجهزة الأخرى من الفئران غير perfused أو perfused وتحديد عبء الجهاز الجرثومي. هذه الأساليب هي مفيدة ليس فقط تحديد مجموع استعمار الدماغ في الحيوانات المصابة بالعدوى البكتيرية، ولكن هي أيضا مفيدة لتحديد ما إذا كانت البكتيريا قد تغلغلت في بي بي بي في فيفو التوسط من أجل غزو الدماغ. من المهم تسليط الضوء على أنه ينبغي أن تجري هذا البروتوكول المختبر بعد التشاور مع إدارة مرفق اللجنة والحيوان في السلامة المؤسسية ذات الصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الحيوانات الحفاظ عليها والتعامل معها العناية القصوى لتقليل عدم الراحة أثناء سير الإجراءات. الإجراء إجراء امتثالا لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة وجميع القوانين الاتحادية والولائية والمحلية. أيضا ملاحظة أن التجارب المختبرية التي تجري وفقا للمبادئ التوجيهية للسلامة البيولوجية المستوى 2.
1-النمو لام الليستريه "الدراسات الإصابة بالماوس"
-
اﻷوتوكﻻف 500 مل من ضخ القلب الدماغ (بهي) أجار المتوسطة في قارورة Erlenmeyer ل 1 لإعداد لوحات إعلامية متينة. السماح لوسائل الإعلام لتبريد في حمام مائي 56 درجة مئوية ثم قم بإضافة ستربتوميسين بتركيز نهائي 100 ميكروغرام/مل.
- صب 25 مل من وسائل الإعلام/بيتري طبق في لوحات طبق بيتري. السماح لوحات لتجف في درجة حرارة الغرفة (22 سC-25 درجة مئوية). إذا لزم الأمر، يمكن أن تجفف اللوحات عند 37 درجة مئوية حتى يجف تماما.
-
استخدام حلقة تطعيم معقمة وتقنية العقيم، الحصول على حلقة كاملة من المجمدة لام الليستريه سلالة 10403S11،12 من ثقافة الأرصدة المجمدة في بهي والغليسيرول وسائل الإعلام بالإضافة إلى 30% وتحتفظ في ثلاجة-80 درجة مئوية.
- الانتصارات لام الليستريه في أجار بهي/ستربتوميسين لوحة مثل أن يمكن أن تكون واحدة من المستعمرات البكتيرية المعزولة. وضع اللوحات في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (ح 18 إلى 24 ساعة) تنمو المستعمرات لام الليستريه .
- استخدام حلقة إينوكولاتينج عقيمة، اختيار واحدة لام الليستريه مستعمرة من أجار بهي لوحة وتطعيم المستعمرة في أنبوب اختبار عقيمة التي تحتوي على 5 مل مرق بهي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين.
-
احتضان الأنبوب الثقافة لام الليستريه يميل قليلاً في 30 ° بين عشية وضحاها في حاضنة ثابت.
- في اليوم التالي، تفقد بصريا ثقافة لام الليستريه للنمو (وسائل الإعلام بهي ستكون عكر) ودوامه بإيجاز لضمان وقف موحدة للثقافة.
- أسيبتيكالي إزالة قاسمة 1 مل من ثقافة البكتيرية وقياس الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
ملاحظة: يستخدم مرق بهي العقيمة الفارغة لجهاز المطياف الضوئي القراءة قبل قياس الكثافة البصرية للثقافة لام الليستريه . يمكن أيضا أن تضعف ثقافة لام الليستريه (اثنين إلى خمسة إضعاف) في بهي قبل قراءة الكثافة البصرية. - تحديد عدد لام الليستريه مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) كل مل الثقافة بهي بالطلاء إذ تخفيف المسلسل للثقافة. وهذا مفيد لإقامة علاقة بين الكثافة البصرية للثقافة لام الليستريه والعدد من البكتيريا كل مل ثقافة. بشكل عام، التطوير التنظيمي600 من 1.0 لثقافة لام الليستريه يساوي حوالي 1 × 109 زيمبابوي بكتيريا كل مل.
2-إعداد لام الليستريه "العدوى من الفئران"
- ثمانية عشر عاماً لأربع وعشرين ساعة قبل الإصابة بالحيوانات، تنمو الثقافات لام الليستريه في مرق بهي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين وتحديد OD600/~ زيمبابوي كل مل كما هو مبين في الخطوة 1.
ملاحظة: الفئران هي عموما أمر أسبوع واحد قبل الإصابة وهي تأقلم إلى مرفق الحيوان قبل الإصابة يتم إجراء الدراسات. في هذه الدراسة، 6 – 8 أسابيع القديمة الإناث بالب/ج الفئران (5 الفئران في كل مجموعة) كانوا يسكنون في بيئة حاجز في منشأة الاحتواء الحيوان هارفارد الطبية BSL2 المستوى وتوفير الأغذية والمياه libitum الإعلانية. - تحديد مقدار لام الليستريه الثقافة المطلوبة لتصيب كل الماوس على أساس ~ زيمبابوي الواحد مل ثقافة البكتيرية. جعل إضعاف ثقافة لام الليستريه في العقيمة مخزنة الفوسفات المالحة الرقم الهيدروجيني 7.2 (PBS) بتركيز مناسب من البكتيريا. عادة يصاب الفئران عن طريق الوريد مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 – 2 × 104 زيمبابوي من البكتيريا/الحيوان.
- التحقق من عدد لام الليستريه في العدوى بالطلاء إذ تخفيف المسلسل على لوحات أجار بهي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين. احتضان اللوحات في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها تحديد عدد لام الليستريه تلقيح كل الماوس كما يلي:
العدوى (زيمبابوي) = (عدد من المستعمرات × معامل التخفيف)/مطلي مل × حجم (mL) حقن
3-عدوى فئران مع الليستريه لام عن طريق "الحقن الوريد الذيل"
-
إزالة سلال الغطاء والغذاء من القفص الذي يحتوي على الفئران، ووضع القفص تحت مصباح الأشعة تحت حمراء حرارة ث 250 لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يسمح هذا الأسلوب الأوردة الذيل تمدد، ضمان أسهل لإجراء الحقن.- بعناية بوضع الحيوان في ماوس حجم مناسب كبح الجهاز بأمان تقييد الحيوان أثناء حقن الوريد الذيل.
- مزيج العدوى الليستريه لام (الخطوة 2، 2)، وتحميل العدوى في محقن 1 مل مزودة بإبرة ز 26.
- موقع الوريد ذيل أفقي للماوس وتنظيف مكان الحقن باستخدام منصة الكحول أو رذاذ إيثانول 75%.
-
حقن بلطف الماوس مع 200 ميليلتر من تعليق لام الليستريه في الوريد ذيل أفقي باستخدام المحاقن مع الإبرة ز 26.
- استخدام الشاش القطن بإيجاز ممارسة ضغوط على موقع الحقن لوقف أي نزيف، ووضع الحيوان في قفص جديد.
ملاحظة: إجراء هذه العملية لكل من الفئران حقن ومارك القفص مع التسميات المناسبة. لتحديد تركيز حقن بعد انتهاء العدوى الليستريه L. ، كرر الخطوة 2.3 استخدام المبلغ المتبقي من العدوى. الوريد ويقال لام الليستريه الإصابة بالعدوى كل الماوس مقاسا زيمبابوي متوسط من العينات العدوى قبل وبعد حقن.
- استخدام الشاش القطن بإيجاز ممارسة ضغوط على موقع الحقن لوقف أي نزيف، ووضع الحيوان في قفص جديد.
- مراقبة الحيوانات المصابة يوميا وملاحظة أي علامات المرض العلني (مثلاً، تكدرت الفراء، موقف متحدب، بطيئة الحركة، وفقدان الوزن). إزالة الحيوانات التي يبدو أن تحتضر كثيرا قبل الإصابة بعد انتهاء ح 72 (مثلاً، 24، 48 ساعة بعد الإصابة) من الدراسة والتضحية بطريقة إنسانية. مواصلة الرصد اليومي حتى يتم التضحية بها جميع الحيوانات المتبقية في ح 72 بعد الإصابة.
ملاحظة: هو الجرعة المميتة 50 في المائة (LD50) لام الليستريه سلالة 10403S في الفئران بالب/ج ~ 1 – 2 × 104 زيمبابوي/الحيوان. الفئران المصابة بجرعات50 دينار لام الليستريه استخدام هذا البروتوكول قد يحمل علامات المرض، كما هو مبين أعلاه، ويمكن أن نتوقع المحققين الفئران لبدء الخضوع للعدوى بعد الإصابة بعد انتهاء ح 72.
4-تشريح والقلب نضح من الفئران المصابين الليستريه ل.
-
في العدوى بعد ح 72 (أو في نقطة في وقت سابق من وقت المطلوب)، euthanize الفئران المصابة باستخدام بروتوكول أقرته "لجنة أخلاقيات الحيوان" المؤسسية، مثل الاختناق2 CO متبوعاً بخلع عنق الرحم.
ملاحظة: إذا كان جمع الدم التي يتعين القيام بها، التقليل من تمزق الأوعية الدموية أثناء القيام بخلع عنق الرحم.- تأكيد قد تم euthanized الفئران بسبب عدم استجابة نشل مخلب.
ملاحظة: إذا كان القلب نضح المراد تنفيذها، إقامة نظام الآلي مضخة/التروية بمعدل تدفق حجم 4 مل/دقيقة.
- تأكيد قد تم euthanized الفئران بسبب عدم استجابة نشل مخلب.
- ضع الحيوان على ظهرها في عموم تشريح وتطبيق الإيثانول 75% على سطح الفراء/جلد البطن.
- باستخدام مقص، جعل شق في جدار البطن وتوسيع شق للتو تحت القفص الصدري.
- كشف الحجاب الحاجز وأجهزة الحشوي.
ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم لاسيراتي أي أجهزة الحشوي. - فتح تجويف الصدر بقطع الحجاب الحاجز وقص القفص الصدري ثنائيا لفضح البطين الأيسر للقلب.
- استخدام الملقط حادة، فهم بلطف بالقلب وإدراج إبرة فراشة ز 21 متصل بنظام التروية في البطين الأيسر وثم بعناية قطع الاذين الأيمن لجمع الدم (~0.2 مل) في أنبوب 2 مل تحتوي على الإيثيلين 10 ملم حمض (يدتا) لمنع تخثر الدم. ويرد في الشكل 2رسم تخطيطي التروية القلبية في الماوس.
ملاحظة: إذا نضح لا التي يتعين القيام بها، الدم قد يكون جمعها ثقب القلب باستخدام حقنه 1 مل وتنتقل بسرعة إلى أنبوب 2 مل يحتوي على 10 مم يدتا لمنع تخثر الدم. لام الليستريه-إصابة ثم يتم حصادها الأجهزة كوصف (الخطوة 5، 1). - يبدأ نضح ونتخلل الحيوان لمدة 4 دقيقة مع 15 – 20 مل من برنامج تلفزيوني يتضمن 10 مم يدتا.
ملاحظة: تقييم التروية بمراقبة الدم وحل برنامج تلفزيوني-يدتا تتدفق من خلال الاذين الأيمن وفي عموم التشريح. سوف تظهر المخ والكبد متبيض بعد نضح كاملة ضمان أن البكتيريا المتبقية من الأجهزة المقطوع ولم يعمم الدم.
5-الجهاز الحصاد وتحديد أعباء البكتيرية
- المرفقة التالية التروية، أجهزة الحصاد (مثل الكبد والطحال) عن طريق إزالة بعناية أي المفرج والأربطة ووضع الأجهزة بشكل منفصل في أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل يحتوي على 5 مل الباردة العقيمة (4 درجة مئوية) برنامج تلفزيوني. تخزين العينات في الثلج حتى يحدث مزيد من المعالجة.
-
لحصاد الدماغ، وقطع رأس الرأس خلف الأذنين باستخدام مقص وقص الجلد فروة الرأس الفترات الفاصلة بين عيون الحيوان أسفل خط الوسط. إذا لزم الأمر، قم بقطع الأنسجة الزائدة إبقاء المقص ضغط ضد الجمجمة.
- برفق إدراج تلميح واحد مقص ماغنوم ثقبة (الثقب في قاعدة الجمجمة يمر من خلالها الحبل الشوكي) ويقتطع الجمجمة أفقياً على كلا الجانبين.
- بلطف قطع الجمجمة الفترات الفاصلة بين العينين القوارض أسفل خط الوسط، ويجري التأكد من تطبيق الضغط الأفقي. تجنب اضطرابات الدماغ والحفاظ على الحد الأدنى من الاتصال بين أنسجة المخ والمقص.
- استخدام الملقط تلميح جيد، فتح الجمجمة لكشف الدماغ ووضع ملعقة بين الجانب السفلي الدماغ وقاعدة الجمجمة لإزالة الدماغ.
ملاحظة: يؤدي إلى تمزق الألياف العصبية في الدماغ. - نقل الدماغ بعناية إلى أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني الباردة العقيمة.
- تجاهل الذبيحة الماوس، وكرر هذه الخطوات للحيوانات المتبقية.
ملاحظة: بمجرد قد تم حصادها جميع الأجهزة، تنظيف منطقة الداخلي والتحضير لتجانس الجهاز لتحديد أعباء البكتيرية.
- تنظيف وتعقيم غيض من الخالطون الأنسجة وضعها مجلس الوزراء بإدراج التلميح، ويعمل الخالطون للتبييض s في التتابع 10 5%، والمياه المعقمة، 75% إيثانول، الماء المعقم كل الوارد في أنبوب مخروطي منفصل 15 مل في السلامة الأحيائية.
-
مجانسة الدماغ المصاب (~ 20 s في الإعداد 6، دورة في الدقيقة كحد أقصى) في أنبوب مخروطي 15 مل حتى تبقى لا أجزاء الأنسجة مرئية.
- تنظيف الخالطون كما هو موضح في الخطوة 5، 3 لمنع البكتيريا تحمل أكثر من تلوث للعينة الجهاز القادم.
- تنفيذ عملية التجانس لجميع الأجهزة الأخرى (مثل الكبد والطحال).
- وبمجرد الانتهاء من عملية التذويب، تنظيف الخالطون كما هو موضح في الخطوة 5، 3 وتخزين حتى استخدامها مرة أخرى.
-
إعداد الوقت تخفيف المسلسل من هوموجيناتيس الجهاز في برنامج تلفزيوني العقيمة ولوحة تخفيف على ألواح أجار/ستربتوميسين بهي لتحديد زيمبابوي للجهاز الواحد.
ملاحظة: يتم تنفيذ أسلوب مماثل لتحديد زيمبابوي كل مل دم.- بعد أن يتم تخفيف جميع مطلي، نقل اللوحات لحاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- وفي اليوم التالي إحصاء عدد المستعمرات في كل لوحة لتحديد العدد الكلي للبكتيريا في الجهاز أو مل من الدم على النحو التالي:
زيمبابوي/الجهاز = (عدد المستعمرات × معامل التخفيف)/مل هوموجيناتي مطلي x 5
زيمبابوي/مليلتر دم = (عدد المستعمرات × معامل التخفيف)/مطلي مل دم
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فاسكولاريزيد الدماغ هو الغاية و لام الليستريه المعروف لتصيب أنواع الخلايا الموجودة في الدم3،13. يستخدم بروتوكول وصف لإثبات قدرة لام الليستريه على عبور حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) مما أدى إلى إصابة في الدماغ في الفئران. لتحديد إذا كانت البكتيريا عبروا BBB في فيفو، يتم نضح الدم في الماوس قبل تحديد أعباء البكتيرية في الدماغ. وبخلاف ذلك، قد تتضمن زيمبابوي حصلت على البكتيريا التي تكون موجودة في الأوعية الدموية للمخ. لام الليستريه المصابة العقول (الشكل 3A) والكبد (الشكل 3B) قبل أو بعد يظهر نضح في ح 72 بعد الإصابة. 4 الرقم يظهر أعباء البكتيرية في لام الليستريهالمصابة الماوس الأجهزة ويوضح عدد البكتيريا الموجودة في المخ، والدم، والكبد والطحال من كل الماوس. تشير هذه البيانات إلى أن نضح من الحيوانات لم تؤثر إلى حد كبير عبء البكتيرية في أجهزة الماوس فحصه في هذه الدراسة (الشكل 4).
الشكل 1 : ملخص تخطيطي لام الليستريه المجراة البروتوكول العدوى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : رسم تخطيطي للإجراء التروية القلبية. نضح من خلال قلب الماوس عرض إدراج إبرة التروية في البطين الأيسر (الخطوة 4، 6). بعد غرز الإبرة، يرصد شق فورا إلى الاذين الأيمن بدء إجراء نضح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : حصاد أجهزة الماوس بعد الإصابة مع لام الليستريه. بالب/ج الفئران أصيبوا عن طريق الوريد عن طريق حقن الوريد الذيل الأفقي مع البرية من نوع الليستريه ل. 10403S، (1-2 × 104 البكتيريا/الحيوان). في 72 ساعة بعد الإصابة، قد euthanized الفئران وجمعت أجهزة الماوس أو كانت perfused euthanized الفئران من خلال القلب مع 15-20 مل من برنامج تلفزيوني يتضمن 10 مم يدتا قبل الحصاد الجهاز. وترد من الفئران غير perfused أو perfused العقول الممثل (A) والكبد (ب). لاحظ أن أجهزة الماوس سيظهر الأبيض/بالي (المقشر) بعد نضح مؤكدا أن زيمبابوي البكتيرية من الأنسجة الجهاز المقطوع ولا الدم المتداولة داخل الأنسجة. وقد تم تعديل هذا الرقم من غوش et al., 201814. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : أعباء البكتيرية في أجهزة الماوس المصابة. بالب/ج الفئران أصيبوا عن طريق الوريد مع البرية من نوع الليستريه L. 10403S كما هو موضح في الشكل 3. في 72 ح ما بعد الإصابة، الدماغ، الدم، والكبد والطحال من كل الماوس وجمعت وتحديد أعباء البكتيرية. في تجارب منفصلة، أنجز نضح الجسم كله من الفئران وتحديد عبء البكتيرية داخل كل جهاز من أجهزة. تشير الخطوط الأفقية إلى القيم الوسيطة. * لهذه المجموعة، تم جمع الدم فورا قبل بدء التروية القلبية. وقد تم تعديل هذا الرقم من غوش et al., 201814. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المستوحدة لام غير قادرة على تسبب التهاب السحايا والدماغ مما يهدد حياة البشر. الدراسات السابقة أثبتت قدرة البكتيريا عبر الدم-الدماغ-الجدار (BBB) واستعمار الدماغ. وقد اقترحت ثلاث طرق لغزو الدماغ أثناء الإصابة: مباشرة اختراق BBB بالبكتيريا، والنقل خلسة بواسطة البكتيريا الواردة داخل الخلايا وحيدات النوى3، والهجرة محواري لام الليستريه السلالات التي تسبب رهومبينسيفاليتيس15. منذ vascularized الدماغ هو الغاية و لام الليستريه المعروف أن يعمم في الدم أثناء العدوى المجموعية، تحديد مدى لام الليستريه قادرة على اختراق الأوعية الدموية لاستعمار في الجهاز العصبي المركزي و الدماغ أمر بالغ الأهمية.
في وصف البروتوكول بحقن الوريد الوريد الذيل يستخدم لإنشاء المنهجية العدوى الليستريه L. في الفئران. يعد هذا الأسلوب مفيداً لتجاوز حاجز الأمعاء وتقييم BBB من مجرى الدم على وجه التحديد البكتيرية الغزو. ويصف البروتوكول العديد من المعالم الهامة. معلمة مهمة واحدة هي استخدام الجرعة المناسبة من العدوى البكتيرية أثناء تجارب في فيفو . هذا أمر بالغ الأهمية ليتمكن من مقارنة زيمبابوي البكتيرية التي تم الحصول عليها من مختلف مجموعات الحيوانات المصابة مع الليستريه لام. جانب مهم آخر للنظر هو سلالة لام الليستريه المستخدمة للدراسة التجريبية. واقترح تقارير متعددة الاختلافات بين مختلف سلالات لام الليستريه في القدرة الإمراضية والقدرة على إصابة في الدماغ10،16.
يمكن تعديل البروتوكول هو موضح هنا لتسهيل النظر في الجوانب الأخرى للبيولوجيا العدوى الليستريه لام . يمكن معالجة أجهزة الليستريه لام مصابة كذلك لإجراء تحاليل نسيجية لمراقبة التغيرات المثيرة مرئية في الماوس المصابة الأجهزة مقارنة بالحيوانات مصابة عنصر التحكم. يمكن تطبيق الأساليب الموصوفة كذلك تميز تعمل الأمراض ذات الصلة بسلالات لام الليستريه المتورطين في الإصابات البشرية فضلا عن سلالات إيواء طفرات المعرفة في احتمال الفوعة المحددات. هذا تطبيق وأجرى مؤخرا لتكشف عن وجود تفاعل رواية مستقبلات-يجند يعزز الإصابة بالدماغ لام الليستريه وعزز أبرزت أهمية الخلية المضيفة فيمنتين السطحية في التفاعلات المضيف الممرض 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها "خدمة الصحة العامة في الولايات المتحدة" منح AI103806 من "المعاهد الوطنية للصحة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26 G needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21 G butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
References
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
