Summary

ליסטריה דלקת של המוח

Published: October 02, 2018
doi:

Summary

במהלך זיהום, ליסטריה הוא מסוגל לחצות את מחסום הדם – מוח ליישב את המוח. ב פרוטוקול זה, נדגים כיצד להעריך מושבת חיידקים של איברים בעקבות זיהום של עכברים. הליך כדי לבצע כל האיבר זלוף לקביעת ספציפי של חיידקי מספרים ב- parenchyma המוח מסופק.

Abstract

ליסטריה הוא פתוגן חיידקי תאיים, אשר קשורה לעיתים קרובות עם זיהום שמקורם במזון. היכולת של ל’ monocytogenes לחצות את מחסום הדם – מוח (BBB) היא בנוגע כמו זה יכול להוביל סכנת חיים דלקת קרום המוח, דלקת קרום המוח. BBB מגן microenvironment למוח את מטבוליטים רעילים שונים של חיידקים פתוגנים נמצאו בדם בעקבות זיהום, לכן תומך המוח הומאוסטזיס. המנגנון שבאמצעותו ל’ monocytogenes נוכח הדם חוצה BBB לגרום למוח זיהומים אינם מובנים במלואם, ויש גם חוסר מערכת מודל חזקים ללמוד זיהומים במוח על-ידי monocytogenes ל’. כאן, אנו מציגים מודל זיהום עכבר פשוטות כדי לקבוע אם חיידקים חצו BBB וכדי quantitate את הנטל של חיידקים כי השתלטו על המוח בתוך vivo. בשיטה זו, היו נגועים לווריד ל’ monocytogenes וחיות היו מורדמים בצורה אנושית על ידי חשיפה CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. זלוף הלב של בעלי החיים בוצעה לפני קצירת האיברים הנגועים. דם נאסף לפני זלוף, המספר של חיידקים לכל איבר או מ”ל של דם נקבע על ידי ציפוי דילולים של homogenates דם או איברים על פלטות אגר והקים ספירת מספר מושבות. בשיטה זו ניתן ללמוד אינטראקציות קולטן הרומן-ליגנד זיהום של המוח על ידי ל’ monocytogenes ולשפר ניתן להתאים בקלות לצורך המחקר של פתוגנים חיידקיים רבים.

Introduction

חיידק גראם חיוביים ליסטריה הוא. חיידק תאיים עיצוב גבות ואחד הכי קטלני המועבר במזון פתוגנים ברחבי העולם. בליעה של ל’ monocytogenes שזוהמו מזון יכול להוביל ליסטריוסיס בבני אדם, מחלה פולשנית קשה מיקוד נשים בעיקר בהריון, תינוקות, של אנשים זקנים, וגם immunocompromised1. Monocytogenes ל’ היא בין הגורמים המובילים. למוות חיידק המועבר במזון בארה ב, שיעורי התמותה במקרה של ליסטריוסיס גבוה כמו 20-30%, הגבוה ביותר עבור פתוגנים שמקורם במזון כל2. אין חיסון כיום קיימת monocytogenes ל’ , היכולת של החיידקים כדי להפיץ ביעילות איברים דיסטלי והמוח מאת לחצות את מחסום הדם – מוח (BBB) עלול להוביל סכנת חיים דלקת קרום המוח ו קולוניזציה של המוח3 , 4 , 5 , 6. דלקת קרום המוח היא בדרך כלל חמורה; בעוד רוב האנשים המקבלים טיפול להתאושש, זיהומים יכול לגרום לסיבוכים רציניים, למשל, נזק מוחי, אובדן שמיעה או ליקויי למידה אצל ילדים. Monocytogenes ל’ הוא חזה לקחת בחשבון לפחות 10% של כל קהילה רכשה דלקת קרום המוח ארה ב7.

כביש מרכזי עבור הפצת החיידק אל המוח ואל קרומי המוח היא דרך מחזור הדם. חיידקים במחזור הדם במוח מסוגלים לעבור BBB לגרום דלקת המוח. BBB היא מערכת מאוד vascularized מכשול זה מגן על המוח מפני חלקיקים זרים במחזור הדם. תאי אנדותל מהווים שכבה המרפדת את השטח הפנימי של כלי הדם8,9. בנוסף monocytogenes ל’, מספר פתוגנים חיידקיים כגון מנינגוקוקוס, סטרפטוקוקוס pneumoniae, Escherichia coliו Haemophilus influenzae סוג b (Hib) מסוגלים להמדינות המוח על ידי חציית5,64,3,BBB. עם זאת, כאשר בוחנים את הנטל חיידקי במוח של עכברים נגועים, חשוב לקבוע שאם חיידקים חצו BBB, אחרת הנטל חיידקי במוח עשוי לייצג חיידקים שעדיין נמצאים כלי הדם של המוח. לפיכך, יש צורך perfuse העכברים של כל הדם לפני קביעת המושבה יוצרי יחידות (CFU) של המוח homogenates.

במחקר זה, אנו מתארים ויוו שיטות לבחון ל’ monocytogenes זיהום של המוח. בשיטות המתוארות כאן, השתמשנו ל’ monocytogenes זן 10403S. Monocytogenes ל’ 10403S הוא אחד של זנים המעבדה הנפוצה ביותר ללמוד ליסטריוסיס מערכתית במודל עכבר של זיהום10. פרוטוקול זה מבוסס על תקן ורידיות ל’ monocytogenes ואחריו זלוף של העכברים. קו מיתאר סכמטי של פרוטוקול זיהום בעכברים מוצג באיור1. Monocytogenes ל’-המוח נגוע ואיברים אחרים של עכברים ללא perfused או perfused נאספו וקבעה הנטל איברים חיידקי. שיטות אלה הם שימושיים לא רק בקביעת מושבת חיידקים הכולל של המוח אצל בעלי חיים נגועים, אך יש גם מועיל לקביעת אם חיידקים יש שחדר ה BBB ויוו לתווך הפלישה של המוח. חשוב להדגיש כי פרוטוקול המעבדה זה צריך להתנהל בעקבות התייעצות עם הוועדה אבטחה מוסדיים הרלוונטיים וניהול מתקן חיה.

Protocol

כל בעלי החיים הם תוחזקה מטופלים בזהירות מירבית כדי למזער את אי נוחות במהלך ההליך. הנוהל הוא אמור להתנהל בהתאם חיה מוסדיים אכפת. שימוש הוועדה ואת כל חוקי הפדרלי, המדינה והמקומיים. שימו לב גם כי הניסויים מעבדה הם להתנהל על פי הנחיות אבטחה ברמה 2. 1. גידול של ל’ monocytogenes ללימודי …

Representative Results

המוח הוא מאוד vascularized וידוע monocytogenes ל’ כדי להדביק את סוגי תאים הנמצאים בדם3,13. הפרוטוקול המתואר משמש כדי להפגין את היכולת של ל’ monocytogenes לחצות את מחסום הדם – מוח (BBB) מובילים לזיהום במוח בעכברים. כדי לקבוע אם חיידקים חצו ה BBB- ויוו, ז?…

Discussion

Monocytogenes ל’ הוא מסוגל לגרום סכנת חיים meningoencephalitis בני אדם. מחקרים קודמים הראו את היכולת של חיידקים לחצות את-מחסום הדם המוח-(BBB) ליישב את המוח. שלושה מסלולים הפלישה למוח. הוצעו במהלך זיהום: ישיר חדירה של BBB על ידי חיידקים, התגנבות תעבורה על-ידי חיידקים הכלול בתוך תאי תאי3והעברה ע?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי שירות בריאות הציבור האמריקני מענק AI103806 של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Brain Heart Infusion media Becton Dickinson 237200
Streptomycin sulfate  Amresco 0382-50G
Petri dishes VWR 25384-342
Glycerol VWR 97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer IKA 3352109 Model: T18BS1
Spectrophotometer Beckman Coulter DU 800 series
BALB/c mice Jackson Laboratory Model #000651
1 mL syringes Becton Dickinson 309659
26-gauge needles Becton Dickinson 305115
21-gauge butterfly needles Becton Dickinson 367281
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich 60004
15 mL conical tubes VWR 21008-918
Round-bottom test tubes VWR 60819-546
Phosphate-buffered saline  Corning 46-013-CM
Stainless steel spatula VWR 82027-520
Stainless steel scissors (6.5 in) VWR 82027-592
Stainless steel scissors (4.5 in) VWR 82027-578
Stainless steel blunt forceps  (4.5 in) VWR 82027-440
Stainless steel fine tip forceps  (6 in) VWR 82027-406

References

  1. Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
  2. de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
  3. Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
  4. Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
  5. Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
  6. Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
  7. Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
  8. Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
  9. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  10. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  11. Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
  12. Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
  13. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
  14. Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
  15. Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
  16. Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ghosh, P., Higgins, D. E. Listeria monocytogenes Infection of the Brain. J. Vis. Exp. (140), e58723, doi:10.3791/58723 (2018).

View Video