Summary
Enfeksiyon sırasında Listeria Monositogenez beyin kolonize etmek kan - beyin bariyerini geçiş yapabiliyor. Bu protokol için organlara enfeksiyon farelerin takip bakteriyel kolonizasyon değerlendirmek nasıl gösterir. Beyin parankimi bakteriyel numaraları belirli tespiti için bütün organ perfüzyon gerçekleştirmek için bir yordam sağlanmıştır.
Abstract
Listeria Monositogenez gıda kaynaklı hastalık ile sık sık ilişkili hücre içi bir bakteriyel patojen var. L. Monositogenez kan - beyin bariyerini (BBB) çapraz yeteneği ile ilgili olarak bu hayati menenjit ve ensefalit yol açabilir. BBB çeşitli toksik metabolitleri ve mikrobiyal patojenler enfeksiyonu takip kanda bulunan beyin microenvironment karşı korur ve bu nedenle beyin homeostazı destekler. Hangi L. Monositogenez kan içinde mevcut çapraz BBB enfeksiyonları tam olarak anlaşılamamıştır beyin neden olacak ve orada olmaması da beyin enfeksiyonları L. Monositogeneztarafından eğitim için bir güçlü modeli sisteminin mekanizmaları. Burada, bir basit fare enfeksiyon modeli bakteri BBB kesişiyor olup olmadığını belirlemek ve beyin içinde vivokolonize bakteri yükü quantitate için mevcut. Bu yöntemde, hayvanlar intravenöz L. Monositogenez ile enfekte ve insanca CO2 servikal çıkığı tarafından takip maruz euthanized. Hayvanların kalp perfüzyon virüslü organ hasat öncesinde gerçekleştirildi. Kan perfüzyon önce toplanan ve organ başına bakteri sayısını veya mL kan kan veya organ homogenates agar plakaları dilutions kaplama tarafından tespit edildi ve koloniler sayılması kurdu. Bu yöntem enfeksiyon L. Monositogenez tarafından beyin geliştirmek ve birden çok bakteriyel patojenler çalışma için kolayca adapte edilebilir roman reseptör-ligand etkileşimleri eğitim için kullanılabilir.
Introduction
Gram-pozitif bakteri Listeria Monositogenez fakültatif intraselüler patojen ve en ölümcül gıda kaynaklı patojenler dünya çapında biridir. L. Monositogenez kontamine yiyeceklerin yenmesi listeriosis insanlarda, şiddetli bir invaziv hastalık hedefleme çoğunlukla hamile kadınlar, yenidoğan, Yaşlı ve immün bireyler1yol açabilir. L. Monositogenez önde gelen gıda kaynaklı patojen ABD tarafından ölüm nedenleri arasında yer alıyor ve büyük ölüm oranları listeriosis üzerinden 20-%30, tüm gıda kaynaklı patojenler2için yüksek olarak yüksek. Aşı L. Monositogenez için şimdilik ve bakteri yeteneğini etkili distal organları ve beyin kan - beyin bariyerini (BBB) geçiş tarafından yaymak için hayati menenjit ve beyin3 kolonizasyon yol açabilir , 4 , 5 , 6. bakteriyel menenjit genellikle şiddetli; Çoğu kişi tedavi kurtarmak iken, enfeksiyonları çocuklarda ciddi komplikasyonlar, Örneğin, beyin hasarı, işitme kaybı veya öğrenme sorunu neden olabilir. L. Monositogenez en az % 10 için tüm topluluk hesap için menenjit ABD7alınan tahmin edilmektedir.
Beyin ve meninkslerde bakteriyel dağıtımı için büyük bir yol kan akışına var. Beyindeki kan damarlarında dolaşan bakteri BBB Beyin enfeksiyona neden çapraz edebiliyoruz. BBB kanda dolaşan yabancı parçacıklar beyin koruyan bir çok bozukluklarına bariyer sistemidir. Endotel hücreleri kan damarları8,9iç yüzeyi hatları bir katman oluşturur. L. Monositogenezyanı sıra, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia colive Haemophilus influenzae tip b (HIB) gibi birden çok bakteriyel patojenlere kolonize olan yeteneğine BBB3,4,5,6kapısı tarafından beyin. Ancak, virüslü farelerin beyninde bakteriyel yükleri incelerken, bakteri BBB geçmiş olsun, aksi halde beyinde bakteri yükü hala kan damarlarının beyin olan bakteri temsil belirlemek önemlidir. Böylece, koloni oluşturan birimler (CFU) beyin homogenates belirleme önce tüm kan fareler sıvı gereklidir.
Bu çalışmada, L. Monositogenez enfeksiyon beyin incelemek için in vivo yöntemler açıklanmaktadır. Burada açıklanan yöntemleri için biz L. Monositogenez gerilme 10403S kullanılır. L. Monositogenez 10403S sistemik listeriosis enfeksiyon10, fare modeli eğitim için en çok kullanılan laboratuar suşları biridir. Bu iletişim kuralı tarafından farelerin perfüzyon takip L. Monositogenez standart İntravenöz enjeksiyon temel alır. Şematik bir anahat farelerde enfeksiyon protokolünün Şekil 1' de gösterilen. L. Monositogenez-virüslü beyin ve diğer organ sigara periosteum veya periosteum fareler toplanan ve bakteriyel organ yük belirledi. Bu yöntemler sadece enfekte hayvanların beyninde toplam bakteriyel kolonizasyon belirlemek için yararlıdır, ama aynı zamanda bakteri beyin işgali arabuluculuk BBB vivo içinde nüfuz olup olmadığını belirlemek için yararlıdır. Bu laboratuvar iletişim kuralı ile ilgili kurumsal Biyogüvenlik kurulu ve hayvan tesis yönetimi istişare takip yapılmalıdır olduğunu vurgulamak önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan muhafaza ve prosedür boyunca rahatsızlığı en aza indirmek için azami itina ile ele üzeresiniz. Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi ve tüm federal, eyalet ve yerel yasalara uygun olarak yapılacak bir yöntemdir. Ayrıca laboratuvar deneyleri seviye 2 kılavuzlarınıza uygun olarak yapılacak olduğunu unutmayın.
1. L. Monositogenez fare enfeksiyon çalışmaları için büyüme
-
Otoklav beyin kalp infüzyon (BHI) agar orta katı ortam tabak hazırlamak için bir 1 L Erlenmeyer şişesi içinde 500 mL. Medya bir 56 ° C su banyosunda serin ve 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon streptomisin eklemek izin verir.
- Medya/Petri kabına 25 mL Petri kabına kalıplara dökülür. Oda sıcaklığında (22 oC-25 ° C) Kuru plakaları izin. Gerekirse, tabakları 37 ° C'de kadar tamamen kuru kuru.
-
Bir kısır döngü aşı ve aseptik teknik kullanarak elde bir döngü tam 10403S11donmuş L. Monositogenez zorlanma,12 BHI medya artı % 30 gliserol içinde donmuş bir hisse senedi kültüründen ve-80 ° C dondurucuya korumak.
- Çizgi üzerinde bir BHI agar/streptomisin L. Monositogenez plaka öyle ki tek bakteri kolonileri izole olabilir. L. Monositogenez kolonileri büyümeye bir 37 ° C kuluçka gecede (18 h 24 h) tabak koyun.
- Steril bir inoculating döngü kullanarak tek bir pick BHI agar L. Monositogenez koloni plaka ve Koloni 5 mL 100 µg/mL streptomisin içeren BHI suyu içeren bir steril test tüp aşılamak.
-
Biraz geceleme statik bir kuluçka makinesi 30 ° eğik L. Monositogenez kültür tüp kuluçkaya.
- Ertesi gün, L. Monositogenez Kültür (BHI medya bulanık olacak) büyüme ve girdap kısaca bir tek tip süspansiyon kültür emin olmak için kontrol edin.
- Aseptik 1 mL aliquot bakteriyel kültürünün kaldırmak ve 600 optik yoğunluk ölçmek bir spektrofotometre kullanarak nm (OD600).
Not: L. Monositogenez kültürünün optik yoğunluk ölçme önce okuma spektrofotometre boş steril BHI suyu kullanılıyor. L. Monositogenez kültür de seyreltilmiş (iki için kat) optik yoğunluk okumadan önce BHI içinde. - L. Monositogenez koloni oluşturan birim (CFU) BHI kültür mL 10 kat seri dilutions kültür kaplama tarafından belirler. Bu optik yoğunluk L. Monositogenez kültür ve kültür mL başına bakteri sayısı arasında bir ilişki kurmak yararlıdır. Genel olarak, bir L. Monositogenez kültür için 1.0 OD600 yaklaşık 1 x 109 CFU bakteri mL başına eşittir.
2. enfeksiyon fareler için L. Monositogenez hazırlanması
- 24 saat önce otele hayvan enfeksiyon, 18 tane 100 µg/mL streptomisin içeren BHI suyu kültürlerde L. Monositogenez büyümek ve OD600belirlemek / ~ CFU 1. adımda gösterildiği gibi mL başına.
Not: Fareler genellikle bir hafta öncesinde enfeksiyon sipariş edilen ve çalışmalar gerçekleştirilir enfeksiyonu önce hayvan tesisi için acclimated. Bu çalışmada 6 – 8 hafta yaşlı kadın BALB/c fare (grup başına 5 fareler), Harvard Tıp Fakültesi BSL2-seviye hayvan koruma tesisi bariyer ortamında yer ve yiyecek ve su ad libitumverilir. - L. Monositogenez kültür dayalı her fare bulaştırmak için gereken miktarını belirlemek ~ CFU bakteri kültürü mL başına. L. Monositogenez kültüründe fosfat tamponlanmış steril serum fizyolojik pH 7.2 (PBS) seyreltme için bakteri konsantrasyonu uygun olun. Fareler genellikle intravenöz 1 – 2 × 104 CFU bakteri/hayvan içeren PBS 200 µL ile bulaşmış.
- İnoculum L. Monositogenez sayısında 100 µg/mL streptomisin içeren BHI agar plakalar üzerine 10 kat seri dilutions kaplama tarafından doğrulayın. L. Monositogenez fare aşağıdaki gibi aşı sayısını belirlemek için bir gecede bir 37 ° C kuluçka plakaları kuluçkaya:
İnoculum (CFU) = (kolonileri seyreltme faktörü x sayısı) / mL kaplama enjekte hacmi (mL) x
3. enfeksiyon L. Monositogenez yolu ile intravenöz kuyruk ven enjeksiyon ile fareler
-
Kapak ve gıda depo gözleri fareler içeren kafes çıkarın ve 5 min için 250 W kızılötesi ısı lambasını altında belgili tanımlık kafes yerleştirin.
Not: Bu yöntem enjeksiyonları gerçekleştirmek daha kolay sağlama kuyruk damarları genişletmek izin verir.- Dikkatli bir şekilde hayvan uygun ölçekli bir fare aygıtı güvenli bir şekilde kuyruk ven enjeksiyonlar sırasında hayvan tutmaya frenleyici yerleştirin.
- L. Monositogenez inoculum (adım 2.2) mix ve 26 G iğne ile donatılmış bir 1 mL şırınga inoculum yükleyin.
- Fare bir yanal kuyruk damar bulun ve bir alkol yastık veya bir % 75 etanol sprey kullanarak enjeksiyon yeri temiz.
-
Yavaşça fare L. Monositogenez süspansiyon 200 µL ile 26 G iğne ile kullanarak bir yanal kuyruk damar içine enjekte et.
- Kısa bir süre herhangi bir kanama durdurmak için enjeksiyon ücreti basınç uygulamak için pamuk gazlı bez kullanın ve hayvan yeni bir kafese koyun.
Not: tüm enjekte edilir ve uygun etiketleri ile kafes işaretlemek için fareler için bu işlemi gerçekleştirin. L. Monositogenez inoculum sonrası enjeksiyon konsantrasyonu belirlemek için 2,3 inoculum kalan miktarda kullanarak adımları yineleyin. Intravenous L. Monositogenez enfeksiyon inoculum fare başına ortalama CFU öncesi ve sonrası enjeksiyon inoculum örneklerinden ölçülen bildirilir.
- Kısa bir süre herhangi bir kanama durdurmak için enjeksiyon ücreti basınç uygulamak için pamuk gazlı bez kullanın ve hayvan yeni bir kafese koyun.
- Enfekte hayvan her gün izlemek ve herhangi bir açık işaret-in hastalık not edin (Örneğin, karıştırdı kürk, Kambur duruş, halsiz hareketi, kilo kaybı). 72 h sonrası enfeksiyondan (Örneğin, 24, 48 saat sonrası enfeksiyon) çalışma öncesinde önemli ölçüde can çekişen ve insanca kurban görünür hayvanlar kaldırın. Tüm kalan hayvanlar 72 h sonrası enfeksiyon kurban kadar günlük izleme devam edin.
Not: L. Monositogenez gerilme 10403S BALB/c farelerde için % 50 Öldürücü doz (LD50) ~ 1 – 2 x 104 CFU/hayvan olur. Bu iletişim kuralını kullanan L. Monositogenez LD50 doz ile enfekte fareler işaret-in hastalık, yukarıda belirtildiği şekilde sergileyebilirler ve müfettişler 72 h sonrası enfeksiyon takip enfeksiyon için succumbing başlatmak için fareler bekliyor olabilir.
4. diseksiyon ve kardiyak perfüzyon, fareler enfekte L. Monositogenez ile
-
72 h sonrası enfeksiyon (veya bir önceki istenilen zamanda noktada), servikal çıkığı tarafından takip CO2 boğulma gibi kurumsal hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış bir iletişim kuralı kullanılarak hastalıklı fareler ötenazi.
Not: kan gerçekleştirilecek bulunuyorsa, servikal çıkığı yaparken kan damarlarının yırtılması en aza indirmek.- Fareler bir pençe seğirme yanıt yokluğunda tarafından euthanized onaylayın.
Not: kardiyak perfüzyon yapılması için ise, bir otomatik pompa/perfüzyon sistemi 4 mL cilt/dk akış hızında ayarlayın.
- Fareler bir pençe seğirme yanıt yokluğunda tarafından euthanized onaylayın.
- Hayvan sırtında bir diseksiyon tavaya yerleştirin ve % 75 etanol karın kürk/cilt yüzeyinde uygulayın.
- Makas kullanarak, karın duvarında bir kesi yapmak ve göğüs kafesinin altında sadece kesi genişletin.
- Diyafram ve viseral organlar ortaya çıkarmak.
Not: herhangi bir visseral organlara lacerate değil dikkatli olun. - Göğüs boşluğuna diyafram keserek açın ve çift taraflı kalbin sol ventrikül ortaya çıkarmak için göğüs kafesi kesilmiş.
- Künt forseps kullanarak, yavaşça yerleştirin 21 G kelebek iğne sol ventrikül bir perfüzyon sisteme bağlı ve kan (~0.2 mL) toplamak için sağ atrium 10 mM ethylenediaminetetraacetic içeren bir 2 mL tüp içine dikkatle kesin ve Kalbi kavramak asit (koagülasyon önlemek için EDTA). Kardiyak perfüzyon fare bir Şematik diyagramı Şekil 2' de gösterilmiştir.
Not: perfüzyon değil gerçekleştirilecek ise, kan geçirilebilir 1 mL şırınga kullanarak kalp ponksiyon tarafından ve hızlı bir şekilde 10 mM EDTA koagülasyon önlemek için içeren bir 2 mL tüp içine transfer. Enfekte L. Monositogenez -organları sonra açıklanan (adım olarak 5.1) hasat. - Perfüzyon başlar ve 10 mM EDTA içeren PBS 4 dk 15-20 mL ile hayvan sıvı.
Not: kan ve sağ kulakçık ve diseksiyon tava içine akan PBS-EDTA çözüm gözlemleyerek perfüzyon değerlendirmek. Beyin ve karaciğer tam perfüzyon kalan bakteri hasat organ ve dolaşımdaki kan sağlama sonra beyazlatılmış-ecek gözükmek.
5. organ hasat ve bakteriyel yüklerin belirlenmesi
- Aşağıdaki perfüzyon, dikkatli bir şekilde herhangi bir bağ ve damarlara kaldırarak hasat organları (Örneğin, karaciğer, dalak) bağlı ve organları ayrı ayrı 5 mL steril soğuk (4 ° C) PBS de içeren bir steril 15 mL konik tüp yerleştirin. Daha fazla işlem oluşana kadar örnekleri buza saklayın.
-
Beyin hasat için makas kullanarak kulakların arkasında kafa başını kesmek ve kafa derisi deri hayvanın gözleri aşağı orta çizgi arasında kesin. Gerekirse, aşırı doku kafatası karşı preslenmiş makas tutma kırpın.
- Yavaşça deliği magnum (hangi aracılığıyla omurilik geçer kafatasının delik) bir makas ucu yerleştirin ve yanal her iki tarafta kafatası kesti.
- Yavaşça kafatası arasında kemirgen 's gözler aşağı lateral basınç uygulayın emin olun orta hat kesilmiş. Pertürbasyon beyin önlemek ve beyin dokusu ve makas arasında en az temas korumak.
- İyi uç forseps kullanarak, kafatası beyin ortaya çıkarmak ve bir spatula alt beyin ve beyin kaldırmak için kafatasının arasında yer açın.
Not: Bu beyin sinir liflerinin yırtılma olur. - Dikkatle beyin bir 15 mL konik tüp 5 mL steril soğuk PBS de içeren aktarın.
- Fare leşi atın ve kalan hayvanlar için bu adımları yineleyin.
Not: bir kez tüm organlarını hasat, yordam alanı temizleyin ve bakteri yükünü belirlemek organ homojenizasyon için hazırlamak.
- Temiz ve ucu yerleştirip 10 s sırayla içinde %5 bleach steril su, % 75 etanol, her bir ayrı 15 mL konik tüp içinde bulunan steril su homogenizer çalışmasını bir Biyogüvenlik kabine yerleştirilmiş bir doku homogenizer ucu sterilize.
-
Virüslü beyin homojenize (~ 20 s ayarı 6, maksimum devir/dakika) görünür doku parçaları yok kalıncaya kadar 15 mL konik tüp.
- Temiz bakteriyel önlemek için 5.3 adımda anlatıldığı gibi homogenizer sonraki organ örnek için kirlenme taşımak.
- Homojenizasyon işlemi tüm diğer organ için (Örneğin, karaciğer, dalak) gerçekleştirin.
- Homojenizasyon işlemi tamamlandığında, homogenizer adım 5.3 ve mağaza daha fazla kullanım kadar anlatılan temiz.
-
Steril PBS organ homogenates 10 kat seri dilutions hazırlamak ve dilutions CFU organ başına belirlemek için BHI agar/streptomisin tabaklarda plakası.
Not: Benzer bir yöntem mL kan başına CFU belirlemek için gerçekleştirilir.- Tüm dilutions kaplama sonra plakaları 37 ° C kuluçka gecede aktarın.
- Ertesi gün, koloniler mL kan veya bakteri organ başına toplam sayısı aşağıdaki gibi belirlemek için her plaka üzerinde saymak:
CFU/organ (kolonileri seyreltme faktörü x sayısı) = / homogenate mL kaplama x 5
CFU/mL kan = (kolonileri seyreltme faktörü x sayısı) / mL kan kaplı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beyin son derece skarların ve L. Monositogenez hücre tipleri kan3,13' te mevcut enfekte olduğu bilinmektedir. Açıklanan protokolü L. Monositogenez kan - beyin enfeksiyonu farelerde beyin önde gelen bariyerini (BBB) çapraz yeteneğini göstermek için kullanılır. Bakteri BBB vivo içindegeçti belirlemek için perfüzyon fare kan beyin bakteriyel yüklerin belirlenmesi önce gerçekleştirilir. Aksi takdirde, elde edilen CFU beyin damarları içinde bulunan bakteriler içerebilir. L. Monositogenez bulaştırmak beyin (3A rakam) ve karaciğerleri (3B rakam) önce veya sonra 72 h sonrası enfeksiyon, perfüzyon gösterilir. Şekil 4 bakteriyel yükleri L. Monositogenez -virüslü fare organları gösterir ve mevcut beyin, kan, karaciğer ve dalak her fare bakteri sayısını göstermektedir. Bu veriler, o perfüzyon öneririz hayvanlar değil önemli ölçüde etkileyen bu çalışmada (Şekil 4) muayene fare organlarında bakteri yükü.
Resim 1 : Şematik çerçevesinde L. Monositogenez içinde vivo enfeksiyon protokolü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Kalp perfüzyon yordamı Şematik diyagramı. Perfüzyon ekleme perfüzyon iğne sol ventrikül (adım 4.6) gösterilen fare kalbine. İğne ekleme perfüzyon yordamı başlatmak için doğru avluya hemen bir kesi yapılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Hasat fare organlarda mantar enfeksiyonu takip L. Monositogenez. BALB/c fare intravenöz enfekte vahşi tipi L. Monositogenez 10403S, (1-2 x 104 bakteri/hayvan) ile yanal kuyruk ven enjeksiyon yolu ile . 72 saat sonrası enfeksiyon, fareler euthanized ve fare organları toplanan veya euthanized fareler 15-20 mL 10 organ hasat öncesinde mM EDTA içeren PBS kalbine derin. Temsilcisi beyin(a)ve karaciğerleri (B) Sigara periosteum veya periosteum fareler gösterilir. Bu bakteriyel CFU temin perfüzyon hasat organ doku ve doku içinde dolaşan kan sonra fare organları beyaz/soluk (beyazlatılmış) görüneceğini unutmayın. Bu rakam Ghosh ve ark., 201814değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Hastalıklı fare organlarında bakteri yükleri. BALB/c fare intravenöz Şekil 3' te açıklandığı gibi vahşi tipi L. Monositogenez ile 10403S bulaşmış. 72 h sonrası enfeksiyon, beyin, kan, karaciğer ve dalak her fare toplanmıştır ve bakteriyel yükleri belirledi. Ayrı deneylerde, tüm vücut perfüzyon farelerin gerçekleştirilmiş ve her organ içinde bakteri yükü belirlenir. Yatay çizgiler medyan değerleri gösterir. * Bu grup için hemen kalp perfüzyon başlamadan önce kan toplanmıştır. Bu rakam Ghosh ve ark., 201814değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L. Monositogenez hayati meningoensefalit insanlarda neden yapabiliyor. Önceki çalışmalar kan-beyin-bariyer (BBB) geçmeye ve beyin kolonize etmek bakteri yeteneğini gösterdi. Beyin işgalinin üç güzergah enfeksiyon sırasında önerilen: doğrudan penetrasyon BBB bakteriler, mononükleer hücreler3ve aksonal geçiş içinde neden L. Monositogenez suşları tarafından bulunan bakteriler tarafından verilen Gizlilik taşıma rhombencephalitis15. Beyin son derece skarların ve L. Monositogenez sistemik enfeksiyon sırasında kanda dolaşmaya bilinmektedir beri ölçüde L. Monositogenez tayini merkezi sinir sistemi kolonize kan damarları nüfuz yapabiliyor ve Beyin çok önemlidir.
Açıklanan protokolünde, intravenöz kuyruk ven enjeksiyon bir sistemik kurmak için kullanılan L. Monositogenez enfeksiyon farelerde. Bağırsak bariyer atlamak için ve kan dolaşımına üzerinden BBB özellikle bakteriyel işgali değerlendirmek için bu yöntem yararlıdır. İletişim kuralı birkaç önemli parametreler açıklanır. Bir önemli parametre içinde vivo deneyler sırasında uygun bakteriyel enfeksiyon doz kullanımıdır. Bu bakteriyel CFU farklı hayvan grupları L. Monositogenezile enfekte elde edilen karşılaştırın edebilmek için önemlidir. Bir başka önemli yönü dikkate almak için deneysel çalışma kullanılan L. Monositogenez yük olduğunu. Birden çok rapor çeşitli L. Monositogenez suşlar arasında farklılıklar onların patojenitesi ve yetenek beyin10,16bulaştırmak için tavsiye ettiler.
Burada açıklanan protokol L. Monositogenez enfeksiyon biyoloji diğer yönleri incelenmesi kolaylaştırmak için değiştirilebilir. Enfekte L. Monositogenez organları daha fazla enfekte fare görünür enflamatuar degisimler bulaşmamış denetim hayvanlara göre organ gözlemlemek histopatolojik analizleri için işlenebilir. Açıklanan yöntemlerden daha fazla hastalık fenotipleri L. Monositogenez suşları insan enfeksiyonları dahil yanı sıra potansiyel virülans belirleyicileri olarak tanımlanmış mutantlar yataklık suşları ile ilgili karakterize etmek için uygulanır. Böyle bir uygulama son zamanlarda enfeksiyon L. Monositogenez tarafından beyin artırır ve elektronika bir roman reseptör-ligand etkileşim konak hücre yüzey vimentin ana bilgisayar-patojen etkileşimleri önemi vurgulanmış ortaya çıkarmak için gerçekleştirildi 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.
Acknowledgments
Bu eser ABD halk sağlığı hizmeti tarafından desteklenen AI103806 Ulusal Sağlık Enstitüleri vermek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26 G needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21 G butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
References
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
