Summary
Ett flödesanalyssystem för pärlbaserade multiplexerade analyser som ger en avläsning av två reporter användes för utveckling av multiplex serologiska och antikroppsneutraliseringsanalyser som samtidigt kan mäta neutraliserande IgG- och IgM-antikroppar för SARS-CoV-2.
Abstract
COVID-19-pandemin har understrukit behovet av snabba metoder för hög genomströmning för känslig och specifik serologisk detektion av infektion med nya patogener, såsom SARS-CoV-2. Multiplex serologiska tester kan vara särskilt användbara eftersom det samtidigt kan analysera antikroppar mot flera antigener som optimerar patogentäckningen och kontroller för variabilitet i organismen och det enskilda värdsvaret. Här beskriver vi en SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescerande mikrosfärbaserad analys som kan upptäcka både IgM- och IgG-antikroppar mot tre stora SARS-CoV-2-antigener-spike (S) proteinet, spike angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) receptorbindande domän (RBD) och nukleocapsid (Nc). Analysen visade sig ha jämförbar prestanda med en SARS-CoV-2 referensanalys för IgG i serum som erhållits vid ≥21 dagar från symptominställning men hade högre känslighet med prover som samlats in vid ≤5 dagar från symptom inset. Vidare, med hjälp av lösliga ACE2 i ett neutraliseringsanalysformat, visades hämning av antikroppsbindning för S och RBD.
Introduction
COVID-19-pandemin har betonat vikten av att snabbt kunna utveckla och implementera snabba, högpresterande, högpresterande serologiska tester som kan användas för diagnos och övervakning av nya patogener som SARS-CoV-2. Multiplex serologiska tester kan vara extremt användbara i en pandemi, eftersom det samtidigt kan analysera antikroppar mot flera antigener, vilket ger bred patogentäckning och kontroller för variabilitet i organismen och värdens svar på infektion. Utvecklingen av en multiplex fluorescerande pärlbaserad analys, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), som kan upptäcka antikroppar mot spike (S) proteinet, spik angiotensin-omvandla enzym-2 (ACE2) receptorbindande domän (RBD) och nukleocapsid (Nc) av SARS-CoV-2 rapporterades nyligen1. 3Flex visade sig ha jämförbar prestanda med en referens SARS-CoV-2 IgG-analys för serum som erhållits vid ≥21 dagar från symtomuppkomst men hade högre känslighet med prover som samlats in vid ≤5 dagar från symptominställning. Dessutom visades hämning av antikroppsbindning för S- och RBD-antigener med lösliga ACE2 i neutraliseringsanalysformat. Multiplex pärlbaserad teknik har antagits allmänt som en beprövad teknik för multiplex serologisk testning och har tydliga fördelar för storskalig screening, inklusive korta tid-till-resultat, små urvalskrav och minskad arbetskraft2,3,4.
Nyligen har ett nytt flödesanalysinstrument blivit tillgängligt som ger samma högplex, hög genomströmningskapacitet i systemet som demonstrerades i tidigare arbete1, men med den extra fördelen av två reporterkanaler. Förmågan att mäta två fluorescerande reportersignaler i en enda reaktion gör det möjligt att bedöma två resultat per analyt för varje prov och är idealisk för isotypningstillämpningar, som vanligtvis måste utföras i separata reaktionsbrunnar5. Den dubbla reporterkapaciteten ger dubbelt så mycket data för varje prov i hälften så många reaktionsbrunnar med hälften av provvolymkraven och har därmed en klar fördel jämfört med system med enstaka reporter. Denna studie beskriver standard serologiska analys protokollet och beskriver anpassningen till en neutralisering analys. Dessutom beskriver denna rapport omvandlingen av den enda reportern analys till en dubbel reporter serologiska analys, och därefter en dubbel reporter neutralisering analys, att samtidigt mäta neutraliserande antikroppar av både IgG och IgM isotyper mot SARS-CoV-2 S, RBD och Nc antigener. En visuell översikt över analysprotokollet finns i figur 1.
Protocol
Kvarvarande humana serumprover som tidigare testats för diagnostiska analyser av SARS-CoV-2 användes i denna studie som godkändes av University of Rochester Institutional Review Board.
1. Reagenser och utrustning
- Få coronavirusantigener och human igG och IgM från kommersiella källor.
- Hämta analyskontroll (AC) pärlsatser (45 och 220) från instrumentleverantören. AC-pärlan ställer in 45 bildskärmar Median Fluorescens Intensity (MFI) samling på RP1-instrument (Single Reporter Channel). AC-pärlan ställer in 220 bildskärmar MFI-samling på den andra reporterkanalen (RP2).
- Få detektionsantikroppar och antigenspecifika kaninser och antikroppar som används för kopplingsbekräftelse.
- Utför detektion med biotinmärkta antikroppar med antingen streptavidin, R-fykoerythrinkonjugat (SAPE) eller en streptavidinkonjugat av fluorfor Super Bright 436 (SASB; excitation vid 405 nanometer (nm) och utsläpp vid 436 nm).
- Få humant ACE2-protein (dvs. sarsreceptorn). Före användning återfukta lyofiliiserat ACE2-protein genom att upplösas till en 1 mg/ml-koncentration i nukleasfritt vatten (ej DEPC-behandlat, autoklaverat och 0,2-μm sterilt filtrerat) och förvaras vid 4 °C.
- Utför alla reaktioner i 96-brunns nonbinding yta (NBS) svarta plattbottnar. Försegla plattorna med 96 brunns microplate aluminium tätningstejp för analys inkubationssteg. Använd en magnetplattavskiljare för analystvättstegen.
2. Beredning av antigen- och antikroppsst kopplade kontrollpärlor
- Parpar magnetiska, polystyren- och färgkodade mikrosfäruppsättningar (6,5-μm diameter) med S-, RBD- och Nc-antigener enligt beskrivningen i Cameron et al.1. Coronavirusantigener kopplas till 10 pmol/106 pärlor (S) och 100 pmol/106 pärlor (RBD och Nc). Kontrollpärlor i kombination med mänsklig IgG eller IgM genereras som tidigare beskrivits1. IgG och IgM är kopplade till 5 μg/106 pärlor.
- Efter koppling, bestäm pärlkoncentrationerna och späd varje stam till 1 x 106 pärlor/ml med hjälp av beskrivnaprocedurer 6.
- Bekräfta antigenkoppling med antigenspecifika antikroppar från kanin eller med positiv mänsklig serum enligt beskrivningen i Cameron et al.1.
- Bekräfta mänsklig IgG-koppling med analysens biotinylerade anti-humana IgG/SAPE-detektionsreagenser och IgM-koppling med en fykoerythrin (PE)-märkt get anti-mänsklig IgM.
OBS: Kopplingsbekräftelse utförs med hjälp av en titrering av proteinspecifikt serum eller antikropp, eftersom den optimala koncentrationen för dessa reagenser inte är känd. För serum används seriella vikutspädningar medan seriella μg/ml utspädningsserier används för antikroppar som levereras som mg/ml-lager.
- Bekräfta mänsklig IgG-koppling med analysens biotinylerade anti-humana IgG/SAPE-detektionsreagenser och IgM-koppling med en fykoerythrin (PE)-märkt get anti-mänsklig IgM.
- Utspädda analyskontrollpärlor (AC) som övervakar MFI-insamlingen i de två reporterkanalerna till en koncentration av 1 x 106 pärlor/ml innan de används i multiplexpärlor.
3. Färsk multiplex pärla blandning beredning
- Förbered multiplexpärlor blandas färskt varje dag från de enskilda kopplade pärlpärlorna och kontrollera pärllager vid 1 x 106 pärlor / mL.
OBS: Multiplexpärlor är beredda att leverera 2 500 pärlor för varje pärlregion i en volym på 50 μL. Beräkningar för hur man förbereder multiplexpärlor för ett antal reaktioner beskrivs i bloggen publicerad av Angeloni (2020)6.
4. Provutspädning
- Bered en utspädning av serumprovet 1:100 genom att blanda 10 μL serum till 990 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 0,05 % interpolering 20, 0, 02 % natriumazid och 1 % av bovint serumalbumin (BSA) (PBS-TBN-buffert).
- Späd prover igen 10 gånger genom att tillsätta 20 μL av utspädningen på 1:100 till 180 μL PBS-TBN.
OBS: Serumprover består av negativ serum, från prover som samlats in 2019 före COVID-19-pandemin, och positiv serum från SARS-CoV-2 PCR-positiva patienter, som representerar låga och höga antikroppstitrar. Positiva prover samlades in mellan ≈3 till >60 dagar från symptominställning (DFSO). Alla serumprover och IgG-avskalad negativ kontrollserum späds till 1:1000 enligt beskrivningen nedan. För neutraliseringsanalyser späds serum ut 1:500 enligt beskrivningen i neutraliseringsprotokollen nedan (avsnitten 6 och 8).
5. Serologiska analysprotokoll för en reporter
- Tillsätt 50 μL multiplexpärlblandning till varje tilldelad brunn på en 96-brunns icke-bindande mikrotiterplatta.
- Pipett 50 μL av 1:1000 serum eller PBS-TBN i lämpliga brunnar; den slutliga utspädningen av serum i brunnen är 1:2000.
- Täck plattan med en mikroplatta folie tätning och inkubera på en uppvärmd plattskakapparat vid 37 °C i 15 min med skakningar vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på magnetplattans separator i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- När du behåller plattan på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Blot plattan på absorberande papper medan du fortfarande håller plattan på magneten.
- Tvätta reaktionsbrunnarna enligt beskrivningen nedan (första inkubationstvätten efter prov).
- Ta bort plattan från plattmagneten och tillsätt 150 μL PBS-TBN till varje brunn.
- Täck plattan med en frisk folietätning och skaka vid 37 °C i 2 min vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på plattmagneten i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- När du behåller plattan på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Blot plattan på absorberande papper medan du fortfarande håller plattan på magneten.
- Tvätta reaktionsbrunnarna enligt beskrivningen nedan (andra inkubationstvätten efter provet).
- Ta bort plattan från plattmagneten och tillsätt 150 μL PBS-TBN till varje brunn.
- Täck plattan med en frisk folietätning och skaka vid 37 °C i 2 min vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på plattmagneten i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- När du behåller plattan på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Ta bort plattan från magneten.
- Gör en ny blandning av biotin-anti-human IgG med SAPE genom att späda ut antikroppen till 0,62 μg/ml och SAPE till 1 μg/ml. Tillsätt 100 μL till varje brunn.
- Täck plattan med en mikroplatta folie tätning och inkubera på en uppvärmd plattskakapparat vid 37 °C i 15 min med skakningar vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på magnetplattans separator i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- När du behåller plattan på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Blot plattan på absorberande papper medan du fortfarande håller plattan på magneten.
- Tvätta reaktionsbrunnarna enligt beskrivningen nedan (första inkubationstvätten efter detektion).
- Ta bort plattan från plattmagneten och tillsätt 150 μL PBS-TBN till varje brunn.
- Täck plattan med en frisk folietätning och skaka vid 37 °C i 2 min vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på plattmagneten i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- När du behåller plattan på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Blot plattan på absorberande papper medan du fortfarande håller plattan på magneten.
- Tvätta reaktionsbrunnarna enligt beskrivningen nedan (andra antikroppsinkubationstvätten efter detektion).
- Ta bort plattan från plattmagneten och tillsätt 150 μL PBS-TBN till varje brunn.
- Täck plattan med en frisk folietätning och skaka vid 37 °C i 2 min vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på magnetplattans avskiljare i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- När du behåller plattan på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Ta bort plattan från magneten.
- Tillsätt 100 μL PBS-TBN till varje brunn.
- Täck med folietätning och skaka i 2 min vid 37 °C.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten. Ta sedan bort folietätningen och läs 50 μL av varje brunn på flödesanalysatorn enligt användarhandboken. En kort beskrivning ges nedan.
- Välj den nedrullningsbara menyn i det övre vänstra hörnet på skärmen och navigera till Plåtkonfiguration.
- Välj Kör platta.
- Välj ikonen Mata ut om du vill mata ut plåthållaren.
- Lasta plattan på plåthållaren och välj ikonen Dra tillbaka för att dra tillbaka plåthållaren.
- Välj ikonen Kör om du vill köra plattan.
6. Protokoll för neutralisering av en reporter
- Förbered en färsk multiplexpärlorblandning enligt beskrivningen i avsnitt 3 ovan.
- Späd patienten och kontrollera serum 1:500 enligt följande.
- Späd serum 1:100 genom att blanda 10 μL serum till 990 μL PBS-TBN.
- Späd serum ytterligare 5 gånger genom att tillsätta 40 μL 1:100 serum i 160 μL PBS-TBN.
- Tillsätt 50 μL multiplexpärlblandning till varje tilldelad brunn på en 96-brunns icke-bindande mikrotiterplatta.
- Tillsätt 25 μL 2 μg/ml ACE2 utspädning till varje brunn.
- Täck plattan med en mikroplatta folie tätning och inkubera på en uppvärmd plattskakapparat vid 37 °C i 2 min med skakningar vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och ta bort folietätningen.
- Tillsätt 25 μL 1:500 serum eller PBS-TBN till de tilldelade brunnarna.
- Täck plattan med en mikroplatta folie tätning och inkubera på en uppvärmd plattskakapparat vid 37 °C i 15 min med skakningar vid 600 varv/min.
- För återstoden av analysförfarandet, följ steg 5.4 till 5.18.5 enligt beskrivningen ovan.
7. Omvandling till en dubbel reporter IgG och IgM serologisk analys
- Förbered antigen-kopplade pärlor enligt beskrivningen i avsnitt 2 ovan.
OBS: Ytterligare en pärlsats, i kombination med mänsklig IgM, ingår för att övervaka för tillsats av anti-IgM-detekteringsreagenser, samt en extra AC-pärla (220) för att övervaka insamlingen av MFI för RP2. Alla pärllager ligger på 1 x 106 pärlor/ml för införande i multiplexpärlor som beskrivs nedan. - Bered färska multiplexpärlor enligt beskrivningen i avsnitt 3 ovan.
- Utspädda serumprover och IgG-avskalad negativ kontrollsera 1:1000 enligt beskrivningen i avsnitt 4 ovan.
- Tillsätt 50 μL multiplexpärlblandning till varje tilldelad brunn på en 96-brunns icke-bindande mikrotiterplatta.
- Pipett 50 μL av 1:1000 serum eller PBS-TBN till lämpliga brunnar. Den slutliga utspädningen av serum i brunnen är 1:2000.
- Täck plattan med en mikroplatta folie tätning och inkubera på en uppvärmd plattskakapparat vid 37 °C i 15 min med skakningar vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på magnetplattans separator i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- När du behåller plattan på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Blot plattan på absorberande papper medan du fortfarande håller plattan på magneten.
- Tvätta reaktionsbrunnarna enligt beskrivningen nedan (första inkubationstvätten efter prov).
- Ta bort plattan från plattmagneten och tillsätt 150 μL PBS-TBN till varje brunn.
- Täck plattan med en frisk folietätning och skaka vid 37 °C i 2 min vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på plattmagneten i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- När du behåller plattan på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Blot plattan på absorberande papper medan du fortfarande håller plattan på magneten.
- Tvätta reaktionsbrunnarna igen med PBS-TBN (andra inkubationstvätten efter prov), exakt som beskrivs ovan i steg 7.10.1-7.10.5.
- Ta bort plattan från magneten.
- Gör en ny detektionsreagensblandning med önskad kombination av reagenser och tillsätt 50 μL eller 100 μL till varje brunn.
OBS: Detektionsreagensblandningar som innehåller anti-Human IgG konjugerade till Brilliant Violet 421 reporter färgämne (BV; excitation vid 405 nm och utsläpp vid 421 nm) användes vid 50 μL/brunn på grund av att begränsa mängden av de tillgängliga lagerreagenserna. Alla andra detektionsreagensblandningar används vid 100 μL/brunn. - Täck plattan med en mikroplatta folie tätning och inkubera på en uppvärmd plattskakapparat vid 37 °C i 15 min med skakningar vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på magnetplattans separator i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- När du behåller plattan på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Blot plattan på absorberande papper medan du fortfarande håller plattan på magneten.
- Tvätta reaktionsbrunnarna enligt beskrivningen nedan med PBS-TBN (första tvätt efter detektion av antikroppsinkubation).
- Ta bort plattan från plattmagneten och tillsätt 150 μL PBS-TBN till varje brunn.
- Täck plattan med en frisk folietätning och skaka vid 37 °C i 2 min vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på magnetplattans separator i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- När du behåller plattan på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Blot plattan på absorberande papper medan du fortfarande håller plattan på magneten.
- Tvätta reaktionsbrunnarna igen med PBS-TBN (andra tvätt efter detektion av antikroppsinkubation), exakt som beskrivs ovan i steg 7.17.1-7.17.5.
- Ta bort plattan från magneten.
- Tillsätt 100 μL PBS-TBN till varje brunn.
- Täck med folietätning och skaka i 2 min vid 37 °C.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten. Ta sedan bort folietätningen och läs 50 μL av varje brunn på flödesanalysatorn enligt beskrivningen ovan i steg 5.18.1-5.18-5.
8. Omvandling till dubbel reporterneutraliseringsanalys
- Använd de kopplade pärlorna enligt beskrivningen i steg 7.1 ovan.
- Förbered en färsk multiplexpärlorblandning enligt beskrivningen i steg 7.2.
- Serumprover och IgG-avskalad negativ kontrollserum späds ut 1:500 enligt följande.
- Förbered en utspädning på 1:100 genom att blanda 10 μL serum till 990 μL PBS-TBN.
- Späd ut 1:100-proverna ytterligare 5 gånger genom att tillsätta 40 μL av utspädningarna på 1:100 till 160 μL PBS-TBN.
- Tillsätt 50 μL multiplexpärlblandning till varje tilldelad brunn på en 96-brunns icke-bindande mikrotiterplatta.
- Tillsätt 25 μL 2 μg/ml ACE2 utspädning till varje brunn.
- Täck plattan med en mikroplatta folie tätning och inkubera på en uppvärmd plattskakapparat vid 37 °C i 2 min med skakningar vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och ta bort folietätningen.
- Tillsätt 25 μL 1:500 serum eller PBS-TBN till de tilldelade brunnarna.
- Täck plattan med en folietätning och inkubera på en uppvärmd plattskakapparat vid 37 °C i 15 minuter med skakningar vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på magnetplattans separator i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- Med plattan kvar på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Blot plattan på absorberande papper medan du fortfarande håller plattan på magneten.
- Tvätta reaktionsbrunnarna enligt beskrivningen nedan (första inkubationstvätten efter provet).
- Ta bort plattan från plattmagneten och tillsätt 150 μL PBS-TBN till varje brunn.
- Täck plattan med en frisk folietätning och skaka vid 37 °C i 2 min vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på magnetplattans separator i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- Med plattan kvar på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Blot plattan på absorberande papper medan du fortfarande håller plattan på magneten.
- Tvätta reaktionsbrunnarna igen med PBS-TBN (andra inkubationstvätten efter prov), exakt som beskrivs ovan i steg 8.13.1-8.13.5.
- Ta bort plattan från magneten.
- Gör en ny detektionsreagensblandning med önskad kombination av reagenser och tillsätt 50 μL eller 100 μL till varje brunn.
OBS: Reagensblandningar som innehåller antimänskliga IgG-konjugerade till BV-reporterfärgen användes vid 50 μL/brunn på grund av att de tillgängliga lagerreagenserna begränsades (se materialförteckningen). Alla andra detektionsreagensblandningar används vid 100 μL/brunn. - Täck plattan med en mikroplatta folie tätning och inkubera på en uppvärmd plattskakapparat vid 37 °C i 15 min med skakningar vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på magnetplattans separator i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- Med plattan kvar på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Blot plattan på absorberande papper medan du fortfarande håller plattan på magneten.
- Tvätta reaktionsbrunnarna enligt beskrivningen nedan (först var efter detektion antikropp inkubation).
- Ta bort plattan från plattmagneten och tillsätt 150 μL PBS-TBN till varje brunn.
- Täck plattan med en frisk folietätning och skaka vid 37 °C i 2 min vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på magnetplattans separator i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- Med plattan kvar på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Blot plattan på absorberande papper medan du fortfarande håller plattan på magneten.
- Tvätta reaktionsbrunnarna igen med PBS-TBN (andra tvätt efter detektion av antikroppsinkubation), exakt som beskrivs ovan i steg 8.21.1-8.21.5.
- Ta bort plattan från plattmagneten och tillsätt 150 μL PBS-TBN till varje brunn.
- Täck plattan med en frisk folietätning och skaka vid 37 °C i 2 min vid 600 varv/min.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten och placera på magnetplattans avskiljare i 2 minuter för att separera pärlorna från reaktionsblandningen.
- Med plattan kvar på magneten, ta bort folietätningen, vänd försiktigt plattan över en avfallsbehållare och snärta försiktigt supernaten ut ur brunnarna.
- Ta bort plattan från magneten.
- Tillsätt 100 μL PBS-TBN till varje brunn.
- Täck med folietätning och skaka i 2 min vid 37 °C.
- Ta bort plattan från plattskakapparaten. Ta sedan bort folietätningen och läs 50 μL av varje brunn på flödesanalysatorn enligt beskrivningen ovan i steg 5.18.1-5.18-5.
Representative Results
Optimering av Single Reporter Serological Assay.
Kopplingsstrategin för alla SARS-CoV-2-antigener beskrivs i Cameron, et al., 20201 och i steg 2.1 ovan. Strategin för kopplingsbekräftelse beskrivs i steg 2.3 ovan. För en effektiv koppling bör medianvärdena för fluorescensintensitet (MFI) vara betydligt högre än värdena för ingen serum/ingen antikroppsnegativ kontrollreaktion och bör påvisa ett dossvar från minskande MFI-signal med minskande mängder detektionsreagens. MFI på cirka 1 000 MFI-enheter eller högre över bakgrund MFI indikerar i allmänhet effektiv proteinkoppling och är beroende av koncentrationen och specificiteten hos det detektionsreagens som används. Med denna metod testades bekräftelse av S-, RBD- och Nc-antigenkoppling för två partier pärlor (figur 2). MFI-signalerna för alla antigener var betydligt högre än bakgrunds-MFI och visade ett dossvar med titrering av detektionsreagenserna. Uppgifterna visade också god reproducerbarhet av MFI-nivåer mellan de två olika partier av kopplade pärlor.
Optimering av den enda reporteranalysen gjordes som beskrivs i Cameron, et al., 20201. Varje antigen testades vid olika kopplingskoncentrationer med olika utspädningar av flera serumprover som representerar höga, medelstora, låga och negativa prover. Dessutom, eftersom analysen mäter IgG-titrar, användes ett IgG-avskalat serum som ett extra negativt prov. Resultaten av en representativ provutspädningsserie med olika antigenkopplingsnivåer visas i figur 3. Denna första utspädningsserie testades med en fast koncentration av detektionsreagenser för att få ett potentiellt intervall av representativa antigenspecifika och bakgrunds MFI-nivåer. Från dessa data fastställdes ytterligare utspädningsintervall för prover och antigenkopplingsnivåer och testades ytterligare med ytterligare prover (data som inte visas).
Därefter optimerades koncentrationen av detektionsreagenset för användning med de olika serumutspädningarna och antigenkopplingsnivåerna. Representativa uppgifter med 6 positiva och 2 negativa prover visas i figur 4. Efter ytterligare tester med flera hundra negativa serumprover före COVID-19 valdes de slutliga optimala antigenkopplingsnivåerna och rektionskoncentrationerna ut för det slutliga analysprotokollet, enligt beskrivningen i avsnitt 5.
Konvertering till en enda reporter neutraliseringsanalys
Omvandling av den enda reporter serologiska analysen till en neutraliseringsanalys uppnåddes genom att lägga till ett inkubationssteg med ACE2 (som konkurrerande reagens) med pärlor innan serumprovet tillsätts. Genom att titrera mängden ACE2 tillsatt observerades hämning av IgG-bindning till S- och RBD-antigenerna, vilket visas i figur 5. Medan de 11 patienten serum hade olika titers av IgG, visade var och en en betydande minskning av MFI signal med ökande ACE2 koncentration. Ace2 påverkar som förväntat endast MFI-signalerna från S och RBD, men inte Nc-antigenet.
Den procentre restsignalen för MFI i förhållande till 0 μg/ml ACE2 för alla prover visas i figur 6. För de flesta prover observerades en signalförlust >30% för S och RBD med ökande ACE2-koncentration. Som förväntat fanns det ingen effekt av ACE2 på Nc-signalen.
Konvertering till en dubbel reporter IgG och IgM serologisk analys
För den dubbla reportern IgG och IgM-analysen användes standardstandarden för en reporters analysvillkor för att testa olika antikropps- och reporterkombinationer för de två reporterkanalerna. RP1-kanalen liknar tidigare flödesanalysinstrument med detektering av "orange" fluorescens för reporterfärgämnen som PE. Den andra kanalen, RP2, använder en violett excitationslaser som kan användas för att upptäcka den "blå" fluorescensen av färgämnen som är upphetsade vid 402 nm med utsläppsspektratoppar i intervallet 421-441 nm.
Flera olika anti-humana IgG- och IgM-antikroppskombinationer testades vid olika koncentrationer med de standard 2 000-faldiga provutspädnings- och inkubationsförhållandena som beskrivs i avsnitt 6. Ett första test av anti-IgM konjugerat till DyLight 405 reporter färgämne (DL 405; excitation vid 400 nm och utsläpp vid 420 nm) för RP2 kanalen utfördes med hjälp av en uppsättning av 11 PCR-positiva prover med DFSO som sträcker sig från 5 till >60 dagar, och en IgG-strippad serum prov. Detta detektionsreagens gav ingen hög signal i RP2-kanalen enligt figur 7A, B, C. För prover med hög IgM RP2 MFI sågs de högsta signalerna för RBD och Nc (Figur 7B,C). Medan IgM titers bör höjas vid denna tidpunkt i vissa prover, de observerade MFI nivåer inte överstiger 140 MFI enheter med IgM detektion reagens. Dessutom saknade kontrollpärlan för IgM ett betydande dynamiskt intervall för MFI vid användning av DL 405 konjugerat till anti-IgM jämfört med en PE-märkt anti-IgM RP1-reporter som används vid samma koncentrationer (figur 7D).
Eftersom ett lämpligt RP2-reagens för IgM inte var tillgängligt testades den ursprungliga biotinanti-IgG med SASB för användning i RP2-kanalen. Signalen för IgG i RP2-kanalen med SASB hade inte samma dynamiska räckvidd som med SAPE, men den hade fortfarande ett lämpligt intervall för att mäta IgG-titrar för S, RBD och Nc (figur 8). Dessa data ledde till testning av olika kombinationer av RP1 IgM- och RP2 IgG-detekteringsreagens, enligt beskrivningen nedan.
Konvertering till dubbel reporterneutraliseringsanalys
Den dubbla reporter serologiska analysen omvandlades till en neutraliseringsanalys genom att lägga till ett inkubationssteg med ACE2 och pärlor, innan serumprovet tillsätts. En 2-faldig utspädningsserie av ACE2 som börjar vid 16 μg/ml användes och testades sedan med uppsättningar av 11 prover och avskalad serum enligt beskrivningen ovan. Dessutom testades 3 olika kombinationer av RP1 IgM- och RP2 IgG-detektionsantikroppsblandningar på en uppsättning av 11 prover och avskalade serumkontroller. De slutliga kombinationerna och reagenskoncentrationerna som bedöms vara optimala beskrivs i tabell 1.
För IgG-detektion testades biotin anti-human IgG/SASB som används i den ursprungliga enskilda reporteranalysen tillsammans med en annan anti-IgG konjugerad till BV reporter färgämne. Medan BV-konjugaten hade höga RP2 MFI-signaler varierade MFI-signalintensiteten för IgG-titern över ACE2-titreringarna(figur 9A,C,E). Kombinationen av biotinantimänsklig IgG/SASB hade en mer konsekvent MFI-signalminskning över ACE2-titreringen jämfört med BV-konjugaten, vilket visade ett dossvar, även om MFI- nivåerna var lägre. Signalfluktuationerna från BV-konjugaten över ACE2-koncentrationerna störde också ACE2:s procentuella hämning i hela IgG-titrar jämfört med kombinationen av biotinanti-human IgG/SASB(figur 9B,D,F). Prover med låga MFI-signaler, såsom DFSO 3-provet, har inte tillräckligt höga titrar för att utvärdera prestandan hos dessa reagenser eller mäta IgG-neutraliseringskapacitet.
För bestämning av IgM-titrar i RP1-kanalen jämfördes en PE-konjugerad anti-IgM med en antimänskliga IgM konjugerad till DyLight 549-reporterfärgämnet (DL 549; excitation vid 562 nm och utsläpp vid 576 nm) vid de koncentrationer som anges i tabell 1. Av dessa två reagenser uppvisade PE-anti-IgM högre MFI än de som genererades av DL 549 antimänskisk IgM för de testade proverna(figur 9A,C,E). IgM-kontrollpärlan som mätte tillsatsen av dessa reagenser hade olika genomsnittliga MFI på ≈17 000 för PE-anti-IgM och 2 723 för DL 549 konjugat. Även med dessa skillnader var effekten av de olika ACE2-koncentrationerna på MFI mätbar med DL 549 konjugat. För att bestämma ACE2 procent hämning av IgM-bindning fanns det en liten men obetydlig skillnad mellan de två IgM-detektionsreagenserna(figur 9B,D, F).
| Kombination | Reporter | Slutlig koncentration i brunn (μg/ml) | |
| RP1 (RP1) | RP2 (RP2) | ||
| 1 | PE anti-IgM | 2 | - |
| Biotin-Ig (biotin-Ig) | - | 0.62 | |
| SASB (sasb) | - | 4 | |
| 2 | DyLight 549 Anti-Human IgM | 1 | - |
| Briljant violett 421 antimänniskt IgG | - | 1 | |
| 3 | DyLight 549 Anti-Human IgM | 1 | - |
| Biotin-Ig (biotin-Ig) | - | 0.62 | |
| SASB (sasb) | - | 4 | |
Tabell 1: Lista över testade RP1- och RP2-kombinationer av reporterfärger. Flera olika RP1 och RP2 reporter färgämnen utvärderades för att mäta IgG och IgM titers. De tre kombinationerna som visas ovan testades i olika RP1-detekteringslägen och för optimering av neutraliseringsanalysen. För RP2-kombinationer med SASB visas koncentrationer för den biotinylerade detektionsantikroppen och SASB. *Slutlig koncentration representerar den slutliga koncentrationen i reaktionsbrunnen.
Bild 1:Flödesschema som belyser protokollstegen för huvudanalys. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Bekräftelse av antigenkoppling. Antigener kopplades vid 100, 10 och 1 pmol/106 pärlor. För S- och RBD-antigener användes kanin anti-S serum och upptäcktes med PE anti-kanin IgG. För Nc användes en Protein G-renad kanin polyklonal anti-Nc. Titreringskurvorna för pärlor i kombination med 22:00 S (A), 100 pmol RBD (B) och 100 pmol Nc (C) visas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Optimering av serumutspädning med olika antigenkopplingsnivåer. Serumprover som representerar höga, medelstora, låga och negativa prover testades med de olika pmolantigen/106 pärlkopplingarna. En 4-faldig serum titrering testades med en multiplex blandning av antigen-kopplade pärlor med hjälp av analys protokollet beskrivs i avsnitt 5. MFI-värdena för titreringskurvorna för S (A), RBD (B) och Nc (C) visas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Bestämning av optimal serumutspädning och reagenskoncentration. Åtta serumprover, inklusive negativa patienter (2 prover) och låg- till högpositiva (6 prover), testades vid ytterligare serumutspädningar med tre olika reagenskoncentrationer. MFI-resultaten visas för S (A), RBD (B) och Nc (C). Baserat på dessa och andra data (ej visas) valdes en provutspädning på 1:2 000 och en antikroppskoncentration för biotindetektering på 0,62 μg/ml. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5:Optimering av en enda reporter neutraliseringsanalys. Modifiering av den enda reportern serologiska analys till en neutraliserande antikropp detektion analys utfördes genom att lägga till ett inkubationssteg med ACE2 som en konkurrent, som beskrivs i avsnitt 6. En uppsättning av 11 prover, allt från låg- till högpositiv titer serum serumprov, testades med en tvåfaldig utspädningsserie av ACE2 från 4 μg/ml, med hjälp av standardtestförhållanden. Inom detta intervall av ACE2-koncentrationer kan en minskning av MFI ses med ökad ACE2 för S (A) och RBD (B), men inte för Nc (C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6:Procentuell signalhämning med ACE2. De procentiga restsignalerna för uppsättningen av 11 prover (från figur 4) visas. För varje prov uppnåddes, oavsett dess IgG-titer, en maximal minskning på ≥30% MFI-signal för S (A) och RBD (B) vid den högsta ACE2-koncentrationen. För Nc-antigenet (C) fanns det ingen signifikant signalhämning med någon mängd ACE2-testad. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 7:Test av DyLight 405 anti-IgM som RP2 IgM detektionsreagens. En uppsättning av 11 prover och IgG-avskalad serum användes för att testa DL 405-konjugerad anti-IgM som en RP2 detektering reagens. RP2 IgM MFI-signalerna för S (A), RBD (B) och Nc (C) visas. Den högsta MFI-signalen för något antigen med något prov var cirka 140 MFI-enheter för RINGPÄRM MED prov H (B). Även signalen på IgM-kontrollpärlan var mindre än 1 000 MFI i RP2-kanalen över hela antikroppstittrarområdet och visade inte det ökade dynamiska intervallet som observerades med PE-anti-IgM-detektionsantikroppen i RP1-kanalen (D). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 8:Optimering av SASB som RP2-reporter med Biotin anti-IgG. En uppsättning av 11 prover och IgG-avskalad serum användes för att testa en utspädningsserie av SASB med standard 0,62 μg/mL biotin anti-IgG. De resulterande IgG MFI i RP2-kanalen för S (A), RBD (B) och Nc (C) visas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 9: Jämförelse av tre olika kombinationer av RP1 IgM- och RP1 IgG-detektionsblandningar. Tre olika detektion antikropp blandningar testades på 11 prover och IgG strippade serum. De kombinationer och slutliga koncentrationer som används beskrivs i tabell 1. Alla prover testades med en 2-faldig ACE2 utspädning, från 16 μg/ml. Data för prover vid DFSO på 3, 12 och 30 dagar visas. MFI-signalerna för RP1 IgM (orange) och RP2 IgG (blå) visas i A (DFSO 3), C (DFSO 12) och E (DFSO 30). ACE2 procent kvarvarande MFI visas i B (DFSO 3), D (DFSO 12) och F (DFSO 30). Signaler som representerar >30% minskning jämfört med No ACE2-kontroller markeras ljusgrönt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Denna studie utvidgade funktionaliteten hos en multiplex fluorescerande mikrosfäranalys, 3Flex, som kvalitativt bedömer IgG-svaret på infektion av SARS-CoV-21. Medan många serologiska analyser för COVID-19 upptäcker ett enda antigen, utvärderar denna analys samtidigt S-, RBD- och Nc-antigener och innehåller en intern antikroppsisotypkontroll7. Dessutom används ACE2 som en indikator för att upptäcka neutraliserande antikroppstitrar till SARS-CoV-2.
Multi-antigen analyser kan vara särskilt användbara i framtiden för att diskriminera immunsvar mellan smittade och vaccinerade personer. Med SARS-CoV-2, om endast S- och RBD-antikroppar utvärderas, skulle det vara omöjligt att urskilja om detta berodde på en tidigare infektion eller på ett vaccinationsantikroppssvar. Inget av de vacciner som för närvarande används är inriktat på Nc-antigenet, så genom att utvärdera S/RBD- och Nc-antigener är det möjligt att skilja tidigare virusinfektion (nc- och S/RBD-positiv) från ett vaccinationssvar (endast S/RBD-positivt; Nc-negativ).
I den aktuella studien överfördes 3Flex serologiska och neutraliseringsanalyser (avsnitten 5 och 6) till ett nytt instrument för dubbel reporterflödesanalys (avsnitten 7 och 8). Typiska immunoassay protokoll för pärla-baserade multiplex analyser liknar standard ELISA protokoll, efter jämförbara steg för prov inkubation, detektion antikropp/reporter inkubation och analys av resultat8. Tidigare studier har också visat hur vanliga ELISA-analyser kan överföras till en pärlbaserad multiplexplattform9.
Analysprotokollen skulle sömlöst kunna överföras från det tidigare instrumentet för en enda reporter till det nya systemet med dubbla reporterr, vilket framgår av de resultat som erhållits för proverna och kontrollerna(figur 4 och figur 5). I den serologiska analysen visade alla positiva serumprover en karakteristisk dosresponsiv minskning av signalen som motsvarade både en högre provutspädning och en lägre antikroppskoncentration, medan signalerna för de negativa proverna låg kvar på bakgrundsnivåer. För neutraliseringsanalysen motsvarade också minskande signaler för S och RBD, men inte Nc, ökande koncentrationer av ACE2-konkurrenten, medan IgG-avskalat serum påverkades mycket mindre av tillsats av ACE2. Förinkubation av pärlor med ACE2 i 2 minuter före tillsats av serumprovet (enligt beskrivningen i avsnitten 6 och 8), jämfördes också med att kombinera pärlorna med ACE2 och serum samtidigt och gav liten skillnad i resultaten (data som inte visas). Eftersom de resultat som erhållits med pärlor plus ACE2 före inkubation steg var mer konsekvent, var det dock det slutliga förfarandet som antagits för neutraliseringsanalysprotokollet (avsnitten 6 och 8).
Eftersom det dubbla reportersystemet innehåller en andra fluorescerande reporterkanal omvandlades båda analyserna till isotypningsanalyser för att samtidigt mäta både IgG- och IgM-svar. Flödesanalysatorns dubbla reporterfunktionalitet gör det möjligt att samla in fluorescerande signaler från två reagenser för reporterdetektering för varje analyt i multiplexen för varje prov, vilket effektivt fördubblar de data som genereras per prov i en analys. För utveckling och optimering av de dubbla reporteranalysprotokollen utvärderades flera kommersiellt tillgängliga reporterfärger och detektionsantikroppar för den nya RP2-kanalen (figur 7 och figur 8) för att bestämma det bästa tillgängliga alternativet. Anti-IgM-antikroppen som konjugerades med DL 405-reporterfärgen presterade inte bra i RP2-kanalen (figur 7), så biotinanti-IgG med SASB utvärderades därefter för detektion i RP2-kanalen (figur 8). Tre kombinationer av reagenser för RP1- och RP2-detektion jämfördes i den dubbla reporterneutraliseringsanalysen(tabell 1 och figur 9) för att bestämma de bäst presterande kombinationerna för samtidig detektion av IgG- och IgM-neutraliserande antikroppar. Även om det fanns betydande skillnader i signalintensiteten mellan RP1-kanalen med PE-anti IgM och RP2-kanalen med DL 549 anti-IgM, fanns det ingen signifikant skillnad i mätningen av procentbindningshämningen av ACE2.
Flera begränsningar av den nuvarande metoden och denna studie bekräftas. För det första var de prover som testades och användes i metodutveckling och optimering begränsade till uppsättningar av 8-11 prover. Fler prover kommer att testas i utökade studier för att verifiera att metoden är helt optimerad. För det andra testades ett begränsat antal reporterfluoroforer och reporterpar. Ytterligare testning av alla tillgängliga reportrar i alla möjliga kombinationer kommer att avgöra vilka reagenser som kan användas framgångsrikt i den här metoden. Anti-IgG antikropp konjugerade till biotin var annorlunda än anti-IgG antikroppar konjugerade till BV 421 reporter. Så även om variation i signalintensiteten för BV 421 anti-IgG fanns, kan det bero på antikroppens specificitet och inte relaterad till reporterfärgämnet. Testning av andra tillgängliga BV 421-konjugerade antikroppar kan identifiera en annan antikropp som skulle fungera bra i RP2-kanalen. Framtida studier kommer också att utvärdera kombinationen av PE anti-IgM med BV 421 anti-human IgG för detektion i RP1 respektive RP2. Sist, även med instrumentets dubbla reporterkapacitet, är analyser begränsade till två isotyper (två parametrar) per reaktion. Om ytterligare isotyper ska mätas eller fullständig isotypning önskas, måste ytterligare reaktioner med samma två reporterkanaler köras i separata brunnar.
Pärlbaserad multiplexeringsteknik möjliggör snabb och flexibel analysdesign med enkel implementering i rutinmässiga laboratoriearbetsflöden3,4,10. Denna studie visade hur lätt det är att överföra de tidigare beskrivna 3Flex serologiska och neutraliseringsanalyser för SARS-CoV-2 till ett flödesanalyssystem för att mäta IgG med en enda reporter, eller med liten modifiering, samtidigt som både IgG- och IgM-svar mäts med hjälp av två reportrar. Alternativet med dubbla reporter har tydliga fördelar jämfört med enskilda reporterplattformar eftersom det kan ge dubbelt så mycket data per prov, med hälften av provvolymen och i hälften av antalet reaktionsbrunnar. Med lämpliga reporterfärger och detektionsantikroppar kan isotypningsanalyser enkelt utvecklas och utföras på det dubbla reporterflödesanalysinstrumentet.
Disclosures
Stephen Angeloni och Sherry Dunbar är anställda på Luminex Corporation som producerar några av de reagenser och instrument som användes i denna studie. Open Access-publicering av den här artikeln sponsrades av Luminex Corporation
Acknowledgments
Denna rapport finansierades av Luminex Corporation (Austin, TX). Författarna tackar Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) för vetenskaplig redigeringshjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACE2 (human) (rec.) | AdipoGen Life Sciences | AG-40B-0192-3050 | |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-065-098 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A7888 | Sigma-Aldrich |
| Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator | Various | ||
| Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 709-675-149 | |
| Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3650 | |
| Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile | Corning | 6570 | |
| DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-475-043 | |
| DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-506-129 | Discontinued but available from multiple vendors |
| eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate | ThermoFisher Scientific | 62-4317-82 | |
| Fisherbrand Incubating Microplate Shaker | ThermoFisher Scientific | 02-217-757 | Fisher Scientific |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE | ThermoFisher Scientific | P-2771MP | |
| Luminex Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | |
| MagPlex beads | Luminex Corporation | MC100XX-ID | |
| PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-116-129 | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | P3813 | Sigma-Aldrich |
| SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56683 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56049 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified |
| SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56047 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56048 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb | SinoBiological | 40150-R007 | |
| Sodium Azide | MilliporeSigma | S2002 | Sigma-Aldrich |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) | ThermoFisher Scientific | S21388 | premium grade |
| Tube Revolver/ Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| TWEEN 20 | MilliporeSigma | P9416 | Sigma-Aldrich |
| xMAP Antibody Couplng Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | |
| xMAP INTELLIFLEX DR-SE | Luminex Corporation | INTELLIFLEX-DRSE-RUO |
References
- Cameron, A., et al. A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).
- Waterboer, T., et al. Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins. Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).
- Pickering, J. W., et al. A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides. American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).
- Ayouba, A., et al. Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).
- Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/ (2020).
- EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
- Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf (2021).
- Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).
