Summary
基于珠子的多路复用检测流程分析系统，提供双记者读取，用于开发多路复用血清学和抗体中和检测，可同时测量SARS-CoV-2的IgG和IgM抗体中和。
Abstract
COVID-19大流行强调，需要快速的高通量方法，以便对感染新型病原体（如SARS-CoV-2）进行敏感和具体的血清学检测。多路复用血清学测试可能特别有用，因为它可以同时分析多种抗原的抗体，优化病原体覆盖，并控制生物体的变异性和单个宿主的反应。在这里，我们描述了SARS-CoV-2 IgG 3-plex荧光微球为基础的检测，可以检测IgM和IgG抗体的三个主要SARS-CoV-2抗原-尖峰（S）蛋白，尖峰血管紧张素转换酶-2（ACE2）受体结合域（RBD）和核胶囊（Nc）。经检测，IgG在症状发病21天≥21天获得的血清中，其性能与SARS-CoV-2参考检测性能相当，但从症状发病时采集的样本的敏感度较高，为≤5天。此外，使用中和检测格式的可溶性ACE2，对S和RBD的抗体结合进行了抑制。
Introduction
COVID-19大流行强调了能够迅速发展和实施快速、高通量、高性能的血清学测试的重要性，这些测试可用于诊断和监测新型病原体，如SARS-CoV-2。多路复用血清学测试在大流行中可能非常有用，因为它可以同时分析多种抗原的抗体，从而提供广泛的病原体覆盖和控制有机体的变异性和宿主对感染的反应。最近报告了一种多路复用荧光珠基检测，SARS-CoV-2 IgG 3Flex（3Flex），可以检测尖峰（S）蛋白的抗体，尖峰血管紧张素转化酶-2（ACE2）受体结合域（RBD）和SARS-CoV-2的核胶囊（Nc）。3Flex 的性能与从症状发作≥ 21 天获得的血清参考 SARS-CoV-2 IgG 检测具有可比性能，但从症状发作中采集的样本的灵敏度较高，为症状发作≤5 天。此外，使用中和检测格式的可溶性ACE2对S和RBD抗原进行了抗体结合的抑制。多面珠技术已被广泛采用为多路复用血清学测试的成熟技术，具有筛选时间短、样品要求小、人工量小等明显优势。
最近，一种新的流量分析仪器已经问世，它提供了系统在以往工作1中表现出的同样的高丛、高通量能力，但增加了两个记者渠道的好处。能够测量两个荧光记者信号在一个单一的反应，允许评估两个结果每个分析每个样本，是理想的同位素应用，这通常必须在单独的反应井5执行。双记者能力为每个样本提供两倍的数据，其反应井数量是样本量要求的一半，因此比单个报告员系统具有明显的优势。本研究详细介绍了标准血清学测定协议，并描述了对中和化测定的适应。此外，本报告还描述了单记者检测转换为双记者血清学测定，随后，双记者中和检测，同时测量IgG和IgM同型抗SARS-CoV-2 S、RBD和Nc抗原的中和抗体。 图1提供了检测协议的视觉概述。
Protocol
先前测试过SARS-CoV-2诊断分析的残留人类血清样本被用于这项研究，该研究得到了罗切斯特大学机构审查委员会的批准。
1. 试剂和设备
- 从商业来源获取冠状病毒抗原和人类IgG和IgM。
- 从仪器供应商那里获得检测控制 （AC） 珠套 （45 和 220）。AC 珠设置 45 显示器 在单个记者通道 （RP1） 仪器上显示中值荧光强度 （MFI） 集合。AC 珠设置 220 监控第二记者频道 （RP2） 上的 MFI 集合。
- 获得用于耦合确认的检测抗体和抗原特异性兔塞拉和抗体。
- 使用生物素标记的抗体进行检测，其具有链球菌素、R-植物红素结合体 （SAPE） 或荧光超级亮 436 （SASB; 405 纳米 （nm） 的激发和 436 nm 的排放） 。
- 获得人类ACE2蛋白（即SARS受体）。使用前，通过溶解到无核酸水（未经过 DEPC 处理、自包装和 0.2-μm 无菌过滤）中溶解到 1 毫克/mL 浓度来补充水合性 lyophil 化 ACE2 蛋白，并储存在 4 °C 下。
- 在 96 井不绑定表面 （NBS） 黑色平底板中执行所有反应。用96井微板铝密封胶带密封板密封板，用于检测孵化步骤。使用磁板分离器进行检测洗涤步骤。
2. 抗原耦合和抗体耦合控制珠制备
- 共价耦合将磁性、聚苯乙烯和颜色编码的微球集（直径为 6.5μm）与 S、RBD 和 Nc 抗原（如 Cameron 等人所述）结合在一起。冠状病毒抗原耦合在 10 pmol/106 珠子 （S） 和 100 pmol/106 珠子 （RBD 和 Nc）.控制珠与人类IgG或IgM一起生成，如前所述1。IgG 和 IgM 耦合在 5 μg/106 珠子上。
- 耦合后，确定珠子浓度，并稀释每个股票到1 x 106珠子/mL使用描述的程序6。
- 执行确认抗原耦合与抗原特异性抗体从兔子或与阳性人类塞拉如卡梅隆等人描述。
- 确认人类IgG与检测的生物染色抗人类IgG/SAPE检测试剂耦合，与IgM耦合与植物红素（PE）标签山羊抗人类IgM。
注：耦合确认使用蛋白质特异性血清或抗体的奶点进行，因为这些试剂的最佳浓度尚不得而知。对于血清，使用串行折叠稀释，而用于作为mg/mL库存提供的抗体，使用序列 μg/mL 稀释系列。
- 确认人类IgG与检测的生物染色抗人类IgG/SAPE检测试剂耦合，与IgM耦合与植物红素（PE）标签山羊抗人类IgM。
- 稀释检测控制 （AC） 珠子，在使用多路复用珠混合之前，在两个记者通道中监控 MFI 收集，浓度为 1 x10 6 珠/mL。
3. 新鲜多重珠混合制备
- 准备多路复用珠每天从个别耦合珠新鲜混合，并控制珠子股票在1×106 珠/mL。
注：多路复用珠混合准备以 50 μL 的体积为每个珠子区域提供 2，500 个珠子。安杰洛尼（2020）6日发表的博客描述了如何为任意数量的反应准备多路复用珠混合的计算方法。
4. 样品稀释
- 将 10 μL 的血清混合到 990 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，其中含有 0.05% Tween 20、0.02% 钠阿齐德和 1% 牛血清白蛋白 （BSA） （PBS-TBN 缓冲）来准备 1：100 血清样品稀释。
- 将 1：100 稀释的 20 μL 添加到 180 μL 的 PBS-TBN 中，再次稀释样品 10 倍。
注：血清样本包括阴性血清，来自2019年COVID-19大流行前采集的样本，以及来自SARS-CoV-2 PCR阳性患者的阳性血清，代表低抗体和高抗体滴答声。阳性样本在症状发作（DFSO）≈3至>60天之间采集。所有血清样本和IgG剥离阴性控制血清被稀释到1：1000如下所述。对于中和测定，根据下面的中和协议（第 6 和第 8 节）所述，塞拉被稀释 1：500。
5. 单记者血清学测定协议
- 将 50 μL 的多路复用珠混合添加到 96 井不绑定微蒂特板的每个分配井中。
- 派佩特 50 μL 的 1：1000 血清或 PBS-TBN 进入适当的井;井中血清的最后稀释是1：2000。
- 用微板箔密封盖住盘子，在 37 °C 的加热板摇床上孵育 15 分钟，在 600 rpm 时摇晃。
- 将板从板摇床中取出，放入磁板分离器上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 在将板保留在磁铁上时，取下铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的容器出井。
- 将板在吸血纸上擦去，同时仍将板放在磁铁上。
- 清洗下文所述的反应井（首次采样后孵化清洗）。
- 从磁板中取出板，在每个井中加入 150 μL 的 PBS-TBN。
- 用新的铝箔密封盖住盘子，在 37 °C 下摇动 2 分钟，下午 600 转。
- 将板从板摇床中取出，放入板磁铁上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 在将板保留在磁铁上时，取下铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的容器出井。
- 将板在吸血纸上擦去，同时仍将板放在磁铁上。
- 清洗下文所述的反应井（第二次采样后孵化清洗）。
- 从磁板中取出板，在每个井中加入 150 μL 的 PBS-TBN。
- 用新的铝箔密封盖住盘子，在 37 °C 下摇动 2 分钟，下午 600 转。
- 将板从板摇床中取出，放入板磁铁上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 在将板保留在磁铁上时，取下铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的容器出井。
- 从磁铁中取出板。
- 通过将抗体稀释至 0.62 μg/mL，将 SAPE 稀释至 1 μg/mL，使生物素抗人类 IgG 与 SAPE 进行新的混合。每口井加100微升。
- 用微板箔密封盖住盘子，在 37 °C 的加热板摇床上孵育 15 分钟，在 600 rpm 时摇晃。
- 将板从板摇床中取出，放入磁板分离器上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 在将板保留在磁铁上时，取下铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的容器出井。
- 将板在吸血纸上擦去，同时仍将板放在磁铁上。
- 清洗下文所述的反应井（首次检测后抗体孵化清洗）。
- 从磁板中取出板，在每个井中加入 150 μL 的 PBS-TBN。
- 用新的铝箔密封盖住盘子，在 37 °C 下摇动 2 分钟，下午 600 转。
- 将板从板摇床中取出，放入板磁铁上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 在将板保留在磁铁上时，取下铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的容器出井。
- 将板在吸血纸上擦去，同时仍将板放在磁铁上。
- 洗涤下文所述的反应井（检测后第二次抗体孵化清洗）。
- 从磁板中取出板，在每个井中加入 150 μL 的 PBS-TBN。
- 用新的铝箔密封盖住盘子，在 37 °C 下摇动 2 分钟，下午 600 转。
- 将板从板摇床中取出，放入磁板分离器上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 在将板保留在磁铁上时，取下铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的容器出井。
- 从磁铁中取出板。
- 在每口井中加入 100 μL 的 PBS-TBN。
- 盖上铝箔密封，在 37 °C 下摇动 2 分钟。
- 从板摇床中取出板。然后根据用户手册取下铝箔密封件，在流量分析仪上读取每口油井的 50 μL。下面提供了简短的说明。
- 选择屏幕左上角的下拉菜单，并导航到 板配置。
- 选择 运行板。
- 选择 弹出图 标以弹出板载波。
- 将板加载到板载波上，并选择 缩回 图标以收回板载体。
- 选择 运行 图标来运行板。
6. 单记者中和检测协议
- 准备新的多重珠混合，如上文第3节所述。
- 稀释患者并控制塞拉 1：500 如下。
- 将 10 μL 的血清混合到 PBS-TBN 的 990 μL 中，稀释血清 1：100。
- 将 40 μL 的 1：100 血清添加到 160 μL 的 PBS-TBN 中，将血清再稀释 5 倍。
- 将 50 μL 的多路复用珠混合添加到 96 井不绑定微蒂特板的每个分配井中。
- 在每口井中加入 25 μL 的 2 μg/mL ACE2 稀释。
- 用微板箔密封盖住盘子，在 37 °C 的加热板摇床上孵育 2 分钟，在 600 rpm 时摇晃。
- 从板摇床中取出板并取下铝箔密封件。
- 在指定的油井中加入 25 μL 的 1：500 血清或 PBS-TBN。
- 用微板箔密封盖住盘子，在 37 °C 的加热板摇床上孵育 15 分钟，在 600 rpm 时摇晃。
- 对于检测过程的其余部分，请遵循上述步骤 5.4 到 5.18.5。
7. 转换为双重记者IgG和IgM血清学测定
- 准备上述第 2 节中描述的抗原耦合珠子。
注：另外还增加了一套珠子，加上人类IgM，用于监测是否增加了抗IgM检测试剂，以及一套额外的交流珠（220），用于监测RP2的MFI集合。所有珠子库存均为 1 x 106 珠/mL，可包含在以下多路复用珠混合中。 - 准备新的多路复用珠混合，如上文第3节所述。
- 稀释血清样本和IgG剥离阴性控制塞拉1：1000如上文第4节所述。
- 将 50 μL 的多路复用珠混合添加到 96 井不绑定微蒂特板的每个分配井中。
- 派佩特 50 μL 的 1：1000 血清或 PBS-TBN 到适当的井。井中血清的最后稀释是1：2000。
- 用微板箔密封盖住盘子，在 37 °C 的加热板摇床上孵育 15 分钟，在 600 rpm 时摇晃。
- 将板从板摇床中取出，放入磁板分离器上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 在将板保留在磁铁上时，取下铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的容器出井。
- 将板在吸血纸上擦去，同时仍将板放在磁铁上。
- 清洗下文所述的反应井（首次采样后孵化清洗）。
- 从磁板中取出板，在每个井中加入 150 μL 的 PBS-TBN。
- 用新的铝箔密封盖住盘子，在 37 °C 下摇动 2 分钟，下午 600 转。
- 将板从板摇床中取出，放入板磁铁上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 在将板保留在磁铁上时，取下铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的容器出井。
- 将板在吸血纸上擦去，同时仍将板放在磁铁上。
- 再次用 PBS-TBN（第二次采样后孵化清洗）清洗反应井，如上文所述，步骤为 7.10.1-7.10.5。
- 从磁铁中取出板。
- 将新的检测试剂与所需的试剂组合混合，并在每口井中加入 50 μL 或 100 μL。
注：检测试剂混合物含有与辉煌紫罗兰421记者染料（BV;兴奋在405纳米和排放在421 nm）结合的反人类IgG组合，使用在50μL/井由于库存试剂的数量有限。所有其他检测试剂混合物均以 100 μL/井的速度使用。 - 用微板箔密封盖住盘子，在 37 °C 的加热板摇床上孵育 15 分钟，在 600 rpm 时摇晃。
- 将板从板摇床中取出，放入磁板分离器上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 在将板保留在磁铁上时，取下铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的容器出井。
- 将板在吸血纸上擦去，同时仍将板放在磁铁上。
- 用PBS-TBN（检测抗体孵化后首次清洗）清洗下面描述的反应井。
- 从磁板中取出板，在每个井中加入 150 μL 的 PBS-TBN。
- 用新的铝箔密封盖住盘子，在 37 °C 下摇动 2 分钟，下午 600 转。
- 将板从板摇床中取出，放入磁板分离器上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 在将板保留在磁铁上时，取下铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的容器出井。
- 将板在吸血纸上擦去，同时仍将板放在磁铁上。
- 再次用 PBS-TBN（检测抗体孵化后第二次清洗）清洗反应井，如上文所述，步骤 7.17.1-7.17.5。
- 从磁铁中取出板。
- 在每口井中加入 100 μL 的 PBS-TBN。
- 盖上铝箔密封，在 37 °C 下摇动 2 分钟。
- 从板摇床中取出板。然后取下铝箔密封件，在流量分析仪上读取上述步骤 5.18.1-5.18-5 中所述每个油井的 50 μL。
8. 转换为双记者中和检测
- 使用上述第 7.1 步中描述的耦合珠。
- 准备新的多路复用珠混合，如第 7.2 步所述。
- 血清样本和IgG剥离的阴性控制血清被稀释1：500如下。
- 将 10 μL 的血清混合到 990 μL 的 PBS-TBN 中，准备 1：100 稀释。
- 将 1：100 稀释的 1：100 样品再增加 40 μL 至 PBS-TBN 的 160 μL，从而将样品稀释 5 倍。
- 将 50 μL 的多路复用珠混合添加到 96 井不绑定微蒂特板的每个分配井中。
- 在每口井中加入 25 μL 的 2 μg/mL ACE2 稀释。
- 用微板箔密封盖住盘子，在 37 °C 的加热板摇床上孵育 2 分钟，在 600 rpm 时摇晃。
- 从板摇床中取出板并取下铝箔密封件。
- 在指定的油井中加入 25 μL 的 1：500 血清或 PBS-TBN。
- 用铝箔密封盖住盘子，在 37 °C 的加热板摇床上孵育 15 分钟，在 600 rpm 时进行摇晃。
- 将板从板摇床中取出，放入磁板分离器上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 将板保留在磁铁上，取出铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的超高人出井。
- 将板在吸血纸上擦去，同时仍将板放在磁铁上。
- 按下文所述清洗反应井（首次样品孵化后清洗）。
- 从磁板中取出板，在每个井中加入 150 μL 的 PBS-TBN。
- 用新的铝箔密封盖住盘子，在 37 °C 下摇动 2 分钟，下午 600 转。
- 将板从板摇床中取出，放入磁板分离器上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 将板保留在磁铁上，取出铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的超高人出井。
- 将板在吸血纸上擦去，同时仍将板放在磁铁上。
- 再次用 PBS-TBN（第二次采样后孵化清洗）清洗反应井，如上文所述，步骤 8.13.1-8.13.5。
- 从磁铁中取出板。
- 将新的检测试剂与所需的试剂组合混合，并在每口井中加入 50 μL 或 100 μL。
注：检测试剂混合物含有与BV记者染料结合的抗人类IgG，由于库存试剂数量有限，以50微升/井的速度使用（见 材料表）。所有其他检测试剂混合物均以 100 μL/井的速度使用。 - 用微板箔密封盖住盘子，在 37 °C 的加热板摇床上孵育 15 分钟，在 600 rpm 时摇晃。
- 将板从板摇床中取出，放入磁板分离器上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 将板保留在磁铁上，取出铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的超高人出井。
- 将板在吸血纸上擦去，同时仍将板放在磁铁上。
- 清洗下面描述的反应井（首先是在检测抗体孵化后）。
- 从磁板中取出板，在每个井中加入 150 μL 的 PBS-TBN。
- 用新的铝箔密封盖住盘子，在 37 °C 下摇动 2 分钟，下午 600 转。
- 将板从板摇床中取出，放入磁板分离器上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 将板保留在磁铁上，取出铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的超高人出井。
- 将板在吸血纸上擦去，同时仍将板放在磁铁上。
- 再次用PBS-TBN（检测抗体孵化后第二次清洗）清洗反应井，详情见上文第8.21.1-8.21.5步。
- 从磁板中取出板，在每个井中加入 150 μL 的 PBS-TBN。
- 用新的铝箔密封盖住盘子，在 37 °C 下摇动 2 分钟，下午 600 转。
- 将板从板摇床中取出，放入磁板分离器上2分钟，将珠子与反应混合物分离。
- 将板保留在磁铁上，取出铝箔密封件，小心地将板倒置在废容器上，然后轻轻轻拂超高的超高人出井。
- 从磁铁中取出板。
- 在每口井中加入 100 μL 的 PBS-TBN。
- 盖上铝箔密封，在 37 °C 下摇动 2 分钟。
- 从板摇床中取出板。然后取下铝箔密封件，在流量分析仪上读取上述步骤 5.18.1-5.18-5 中所述每个油井的 50 μL。
Representative Results
优化单记者血清学分析。
卡梅隆等人介绍了所有SARS-CoV-2抗原的耦合策略，2020年1 和上述第2.1步。耦合确认策略在上文第 2.3 步中进行了描述。对于高效耦合，荧光强度中位数 （MFI） 值应显著高于无血清/无抗体负控制反应，并且应显示检测试剂量减少的 MFI 信号的剂量响应。在背景 MFI 上，大约 1，000 MFI 单位或以上的 MFI 通常表示高效的蛋白质耦合，并取决于所使用的检测试剂的浓度和特异性。使用这种方法，对S、RBD和Nc抗原耦合的确认进行了两批珠子的测试（图2）。所有抗原的MFI信号明显高于背景MFI，并显示剂量反应与检测试剂的点缀。数据还显示，两种不同数量的耦合珠子之间的 MFI 水平可重复性良好。
优化单记者检测是按照卡梅隆等人在2020年1月1日描述的。每个抗原在不同的耦合浓度下进行测试，对代表高、中、低和阴性样品的多个血清样品进行不同的稀释。此外，由于检测测量IgG滴答声，IgG剥离血清被用作额外的阴性样本。具有不同抗原耦合水平的代表性样品稀释系列的结果见 图3。此初始稀释系列使用固定浓度的检测试剂进行测试，以获得具有代表性的抗原特异性和背景 MFI 水平的潜在范围。从这些数据中，确定了额外的样品稀释范围和抗原耦合水平，并进一步测试了其他样品（未显示数据）。
其次，优化了检测试剂的浓度，以便与不同的血清稀释和抗原耦合水平一起使用。使用6个阳性和2个阴性样本的代表数据显示在 图4中。在对几百个COVID-19血清样本进行阴性检测后，为最终检测协议选择了最终最佳抗原耦合水平和检测摄政浓度，如第5节所述。
转换为单个记者中和检测
在添加血清样本之前，使用ACE2（作为相互竞争的试剂）与珠子添加孵化步骤，实现了单记者血清学测定到中和检测的转换。通过对添加的ACE2量进行滴答声，观察到IgG与S和RBD抗原结合的抑制，如图 5所示。虽然这11名患者的塞拉有不同的IgG滴答器，但每个患者的MFI信号都显著减少，ACE2浓度也随之增加。不出所料，ACE2 只影响 S 和 RBD 的 MFI 信号，而不会影响 Nc 抗原。
所有样品的剩余 MFI 信号相对于 0 μg/mL ACE2 的百分比见 图 6。对于大多数样本，随着ACE2浓度的增加，S和RBD的信号损失>30%。不出所料，ACE2 对 Nc 信号没有影响。
转换为双重记者 Igg 和 Igm 血清学测定
对于双记者IgG和IgM检测，标准单记者检测条件用于测试两个记者频道的不同抗体和记者组合。RP1 通道与之前的流量分析仪器类似，用于检测 PE 等记者染料的"橙色"荧光。第二个通道 RP2 采用紫罗兰激发激光，可用于检测在 402 nm 下兴奋的染料的"蓝色"荧光，在 421-441 nm 范围内具有发射光谱峰值。
以不同浓度测试了几种不同的抗人类IgG和IgM抗体组合，第6节详细介绍了标准的2，000倍样品稀释和孵化条件。使用一组11个PCR阳性样品（DFSO，5至>60天）和IgG剥离血清样本，对RP2通道的抗IgM进行了初步测试，这些染料与DyLight 405记者染料（DL 405;400 nm的激发和420纳米的发射）结合在一起。此检测试剂没有像图 7A、B、C中显示的那样在 RP2 通道中产生高信号。对于IgM RP2 MFI较高的样本，RBD和Nc（图7B，C）的信号最高。虽然在某些样品中此时应提升 IgM 滴答机，但通过 IgM 检测试剂观察到的 MFI 水平不超过 140 MFI 单位。此外，与同浓度使用的 PE 标记反 IgM RP1 记者相比，IgM 的控制珠在使用 DL 405 与反 IgM 结合时缺乏显著的 MFI 动态范围（图 7D）。
由于没有适合IgM的RP2记者标签检测试剂，原始生物素抗IgG与SASB测试用于RP2通道。SASB 的 RP2 通道中的 IgG 信号的动态范围与 SAPE 的动态范围不同，但它仍然具有适合测量 S、RBD 和 Nc 的 IgG 滴答声的范围（图 8）。这些数据导致测试不同的RP1 IgM和RP2 IgG检测试剂组合，如下所述。
转换为双记者中和化检测
在添加血清样本之前，通过添加ACE2和珠子的孵化步骤，双记者血清学检测被转换为中和化检测。使用从 16 μg/ml 开始的 2 倍稀释系列 ACE2，然后使用 11 个样品进行测试，并按上文所述剥离塞拉。此外，在一组11个样品上测试了RP1 IgM和RP2 IgG检测抗体混合物的3种不同组合，并剥离了血清控制。表 1详细列出了最终组合和确定为最佳试剂浓度。
对于IgG检测，在最初的单一记者检测中使用的生物素抗人类IgG/SASB与BV记者染料的另一种抗IgG一起进行了测试。虽然 BV 结合体具有较高的 RP2 MFI 信号，但 IgG 滴答声的 MFI 信号强度在 ACE2 滴答声（图 9A、C、E）中各不相同。与 BV 结合体相比，生物素抗人类 IgG/SASB 组合在整个 ACE2 点名中具有更一致的 MFI 信号降低，显示出剂量响应，尽管 MFI 水平较低。BV结合体在ACE2浓度上的信号波动也干扰了确定ACE2在IgG滴答声范围内与生物素抗人类IgG/SASB组合（图9B，D，F）的抑制百分比。MFI 信号低的样品（如 DFSO 3 样本）没有足够的滴答声来评估这些试剂的性能或测量 IgG 中和能力。
为了确定RP1通道中的IgM滴答声，将PE结合的反IgM与DyLight 549记者染料（DL 549：562纳米的激发和576纳米的排放）结合的反人类IgM进行了比较，其浓度为表1。在这两种试剂中，PE抗IgM显示的MFI高于DL 549抗人类IgM为测试样品生成的MFI（图9A、C、E）。测量这些试剂添加的IgM控制珠的平均MF为PE抗IgM的17，000≈，DL 549结合体的平均MF为2，723。即使存在这些差异，各种ACE2浓度对MFI的影响也可与DL 549结合体进行测量。对于确定 ACE2% 抑制 IgM 结合，两种 IgM 检测试剂（图 9B、D、F）之间有轻微但微不足道的差异。
| 组合 | 记者 | 井中的最后浓度 （μg/mL） | |
| RP1 | RP2 | ||
| 1 | PE 反伊格姆 | 2 | - |
| 比奥廷-伊格 | - | 0.62 | |
| 萨斯布 | - | 4 | |
| 2 | DyLight 549 反人类 Igm | 1 | - |
| 辉煌的紫罗兰 421 反人类 Igg | - | 1 | |
| 3 | DyLight 549 反人类 Igm | 1 | - |
| 比奥廷-伊格 | - | 0.62 | |
| 萨斯布 | - | 4 | |
表1：RP1和RP2记者染料组合测试列表。测量IgG和IgM滴答声时，对几个不同的RP1和RP2记者染料进行了评估。上述三种组合在不同的 RP1 检测模式下进行了测试，并优化了中和检测。对于使用 SASB 的 RP2 组合，显示生物受糖检测抗体和 SASB 的浓度。*最终浓度很好地表示反应中的最终浓度。
图1： 流程图突出显示主要检测协议步骤。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：抗原耦合的确认。 抗原耦合在100，10和下午1pmol/106 珠。对于S和RBD抗原，使用和检测与PE抗兔IgG兔子抗Sera。对于 Nc，使用了蛋白质 G 纯化兔多克隆抗 Nc。珠子的点子曲线加上10 pmol S（A），100 pmol RBD（B） 和100 pmol Nc（C） 显示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：用不同的抗原耦合水平优化血清稀释。用不同的pmol抗原/106珠耦合测试代表高、中、低和阴性样品的血清样本。使用第 5 节中描述的检测协议，使用抗原耦合珠的多重组合测试了 4 倍血清点缀。显示 S（A）、RBD（B）和 Nc（C）的点名曲线的 MFI 值。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：确定最佳血清稀释和检测试剂浓度。8个血清样本，包括阴性患者（2个样本）和低至高阳性（6个样本），在额外的血清稀释剂中进行了测试，其中3种检测试剂浓度不同。MFI 结果显示为 S（A）、RBD（B）和 Nc（C）。根据这些数据和其他数据（未显示），选择了 1：2，000 的样品稀释和 0.62 μg/mL 的生物素检测抗体浓度。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：优化单记者中和分析。将单记者血清学检测修改为中和抗体检测检测，通过添加与ACE2作为竞争对手的潜伏步骤进行，如第6节所述。使用标准检测条件，以 4 μg/mL 的双稀释系列 ACE2 对一组 11 个样品进行了测试，从低阳性到高阳性滴答声血清样本和 IgG 条纹血清样品。在这一系列ACE2浓度中，MFI的减少可以用增加的ACE2来观察S（A）和RBD（B），而不是为Nc（C）。请单击此处查看此图的较大版本。
图6： ACE2抑制信号的百分比。 显示了11个样本（图 4）的剩余信号百分比。对于每个样本，无论其IgG滴答声如何，在最高ACE2浓度下，S（A）和 RBD（B）的 MFI 信号最大降低≥30%。对于 Nc 抗原（C） 没有显著抑制信号与任何数量的 ACE2 测试。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7： 测试 DyLight 405 抗 IgM 作为 RP2 IgM 检测试剂。 一组11个样品和IgG剥离塞拉用于测试DL 405结合抗IgM作为RP2检测试剂。显示 S（A）、RBD（B）和 Nc（C）的 RP2 IgM MFI 信号。任何样本中任何抗原的最高MFI信号是大约140个MFI单位的RBD与样品H（B）。甚至IgM控制珠集上的信号在整个抗体滴答声范围内的RP2通道中也小于1，000 MFI，并且没有显示RP1通道（D）中PE抗IgM检测抗体观察到的动态范围增加。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8：优化SASB作为RP2记者与生物素抗IgG。 一组11个样品和IgG剥离塞拉用于测试标准0.62微克/mL生物素抗IgG的SASB稀释系列。显示 S（A）、RBD（B）和 Nc（C）的 RP2 通道中产生的 IgG MFIs。 请单击此处查看此图的较大版本。
图9：RP1 IgM和RP1IgG检测组合的三种不同组合的比较。在11个样品上测试了3种不同的检测抗体混合物，IgG剥离了塞拉。表1中描述了使用的组合和最终浓度。所有样品均以 2 倍 ACE2 稀释测试，起价为 16 微克/mL。显示了 DFSO 3 天、12 天和 30 天的样本数据。RP1 IgM（橙色）和RP2 IgG（蓝色）的MFI信号显示在A（DFSO 3）、C（DFSO 12）和E（DFSO 30）。 ACE2% 剩余 MFI 以 B（DFSO 3）、D （DFSO 12） 和F（DFSO 30）表示。 与无 ACE2 控件相比，表示减少 >30% 的信号突出显示为浅绿色。请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
这项研究扩展了多路复用荧光微球检测3Flex的功能，该检测定性地评估IgG对SARS-CoV-21感染的反应。虽然COVID-19的许多血清学测定检测出单个抗原，但此检测同时评估S、RBD和Nc抗原，并包括内部抗体同型控制7。此外，ACE2还用作检测SARS-CoV-2中和抗体滴答器的指标。
多抗原检测在未来可能特别有用，以区分感染者和接种疫苗者之间的免疫反应。对于SARS-CoV-2，如果只评估S和RBD抗体，就无法辨别这是由于过去的感染还是疫苗接种抗体反应。目前使用的疫苗均不针对Nc抗原，因此通过评估S/RBD和Nc抗原，可以区分过去的病毒感染（Nc-和S/RBD阳性）和疫苗接种反应（仅限S/RBD阳性：Nc 阴性）。
在目前的研究中，3Flex血清学和中和分析（第5和第6节）被转移到一个新的双记者流分析仪器（第7和第8节）。基于珠子的多路复用检测的典型免疫检测协议与标准 ELISA 协议相似，遵循样本孵化、检测抗体/记者孵化和结果分析的类似步骤8。先前的研究也证明了如何标准的ELISA测定可以转移到基于珠子的复用平台9。
检测方案可以从前身的单一记者仪器无缝传输到新的双记者系统，如测试样本和控制的结果所示（图4 和 图5）。在血清学测定中，所有阳性血清样本都显示出信号的特性剂量响应减少，这相当于样品稀释率较高，检测抗体浓度较低，而阴性样品的信号仍保持在背景水平。同样，对于中和检测，S 和 RBD 信号的减少（但不是 Nc）与 ACE2 竞争对手浓度的增加相对应，而 IgG 剥离血清对 ACE2 添加的影响要小得多。在添加血清样本之前，用ACE2预孵化珠子2分钟（如第6节和第8节所述），还比较了珠子与ACE2和血清同时结合，结果几乎没有差别（未显示数据）。然而，由于珠子加ACE2预孵化步骤获得的结果更为一致，因此这是中和检测协议（第6和第8节）采用的最后程序。
由于双记者系统包含第二个荧光记者通道，因此两个检测都转换为同位素检测，以同时测量 IgG 和 IgM 响应。流量分析仪的双记者功能允许从每个样品的多路复用器中为每个分析剂收集两个记者检测试剂的荧光信号，从而有效地将检测中每个样本生成的数据翻倍。为了开发和优化双记者检测协议，对新的RP2通道（图7和图8）评估了几个市售的记者染料和检测抗体，以确定可用的最佳选择。与DL 405记者染料结合的抗IgM抗体在RP2通道（图7）中表现不佳，因此生物素抗IgG与SASB随后被评估为RP2通道（图8）的检测。在双记者中和检测分析（表1和图9）中比较了RP1和RP2检测试剂的三种组合，以确定同时检测IgG和IgM中和抗体的最佳组合。虽然使用 PE-防 IgM 的 RP1 通道与使用 DL 549 反 IgM 的 RP2 通道之间的信号强度存在显著差异，但在 ACE2 的绑定抑制百分比测量方面没有显著差异。
对当前方法和本研究的若干限制是公认的。首先，在方法开发和优化中测试和使用的样品仅限于 8-11 个样品集。更多的样品将在扩展的研究中进行测试，以验证该方法是否完全优化。其次，对数量有限的记者氟和记者对进行了测试。对所有可用记者进行进一步测试，确定该方法可以成功使用哪些试剂。与生物素结合的抗IgG抗体不同于BV 421记者的抗IgG抗体。因此，虽然BV 421抗IgG的信号强度存在变异性，但可能是由于抗体的特殊性，与记者染料无关。测试其他可用的 BV 421 结合抗体可能会识别另一种抗体，该抗体在 RP2 通道中表现良好。未来的研究还将评估PE抗IgM与BV 421抗人类IgG的结合，分别用于RP1和RP2的检测。最后，即使具有仪器的双报告器能力，每次反应的检测也仅限于两个同型（两个参数）。如果要测量额外的同型或需要完全同位素型，则需要在单独的井中运行使用同一两个报告通道的其他反应。
基于珠子的复用技术允许快速和灵活的检测设计，易于实施到常规实验室工作流程3，4，10。这项研究表明，将先前描述的SARS-CoV-2的3Flex血清学和中和检测转移到一个流分析系统中，用单个记者测量IgG，或稍作修改，同时使用两个记者测量IgG和IgM的回答是很容易的。双记者选项比单个记者平台具有明显的优势，因为它可以提供两倍于每个样本的数据，使用一半的样本量，并在一半的反应井数量。有了适当的记者染料和检测抗体，同位素检测可以很容易地开发和执行双记者流分析仪器。
Disclosures
斯蒂芬·安杰洛尼和雪莉·邓巴是Luminex公司的员工，该公司生产了一些试剂和仪器，用于这项研究。本文的开放访问出版物由 Luminex 公司赞助
Acknowledgments
本报告由Luminex公司（德克萨斯州奥斯汀市）资助。作者感谢马修·西尔弗曼博士（生物医学出版解决方案，德尔雷海滩，佛罗里达州）的科学编辑帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACE2 (human) (rec.) | AdipoGen Life Sciences | AG-40B-0192-3050 | |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-065-098 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A7888 | Sigma-Aldrich |
| Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator | Various | ||
| Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 709-675-149 | |
| Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3650 | |
| Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile | Corning | 6570 | |
| DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-475-043 | |
| DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-506-129 | Discontinued but available from multiple vendors |
| eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate | ThermoFisher Scientific | 62-4317-82 | |
| Fisherbrand Incubating Microplate Shaker | ThermoFisher Scientific | 02-217-757 | Fisher Scientific |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE | ThermoFisher Scientific | P-2771MP | |
| Luminex Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | |
| MagPlex beads | Luminex Corporation | MC100XX-ID | |
| PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-116-129 | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | P3813 | Sigma-Aldrich |
| SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56683 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56049 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified |
| SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56047 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56048 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb | SinoBiological | 40150-R007 | |
| Sodium Azide | MilliporeSigma | S2002 | Sigma-Aldrich |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) | ThermoFisher Scientific | S21388 | premium grade |
| Tube Revolver/ Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| TWEEN 20 | MilliporeSigma | P9416 | Sigma-Aldrich |
| xMAP Antibody Couplng Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | |
| xMAP INTELLIFLEX DR-SE | Luminex Corporation | INTELLIFLEX-DRSE-RUO |
References
- Cameron, A., et al. A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).
- Waterboer, T., et al. Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins. Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).
- Pickering, J. W., et al. A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides. American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).
- Ayouba, A., et al. Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).
- Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/ (2020).
- EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
- Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf (2021).
- Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).
