Summary
Um sistema de análise de fluxo para ensaios multiplexados baseados em contas que fornece uma leitura de dois repórteres foi usado para o desenvolvimento de ensaios sorológicos e de neutralização de anticorpos multiplex que podem medir simultaneamente anticorpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.
Abstract
A pandemia COVID-19 tem sublinhado a necessidade de métodos rápidos de alta produtividade para detecção sorológica sensível e específica de infecção com novos patógenos, como o SARS-CoV-2. Testes sorológicos multiplex podem ser particularmente úteis porque podem simultaneamente analisar anticorpos para múltiplos antígenos que otimizam a cobertura de patógenos, e controles para variabilidade no organismo e na resposta individual do hospedeiro. Aqui descrevemos um ensaio baseado em microesfera fluorescente SARS-CoV-2 IgG 3-plex que pode detectar anticorpos IgM e IgG a três antígenos principais SARS-CoV-2- a proteína spike (S), enzime-2 (ACE2) de conversão de angiotensina (RBD) e nucleocapsídeo (Nc). O ensaio mostrou-se ter desempenho comparável a um ensaio de referência SARS-CoV-2 para IgG em soro obtido em ≥21 dias após o início do sintoma, mas teve maior sensibilidade com amostras coletadas em ≤5 dias após o início do sintoma. Além disso, utilizando ACE2 solúvel em formato de ensaio de neutralização, foi demonstrada inibição de ligação de anticorpos para S e RBD.
Introduction
A pandemia COVID-19 enfatizou a importância de ser capaz de desenvolver e implementar rapidamente testes sorológicos rápidos, de alto rendimento e de alto desempenho que podem ser usados para diagnóstico e vigilância de novos patógenos, como o SARS-CoV-2. Testes sorológicos multiplex podem ser extremamente úteis em uma pandemia, pois podem simultaneamente analisar anticorpos para múltiplos antígenos, o que prevê uma ampla cobertura patógena e controles para variabilidade no organismo e a resposta do hospedeiro à infecção. O desenvolvimento de um ensaio baseado em contas fluorescentes multiplex, o SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), que pode detectar anticorpos para a proteína spike (S), o pico de enzima conversor de angiotensina-2 (ACE2) receptor-vinculação (RBD) e nucleocapsídeo (Nc) de SARS-CoV-2 foi recentemente relatado1. 3Flex mostrou ter desempenho comparável a um ensaio de referência SARS-CoV-2 IgG para soro obtido em ≥21 dias após o início do sintoma, mas apresentou maior sensibilidade com amostras coletadas em ≤5 dias após o início do sintoma. Além disso, a inibição da ligação de anticorpos foi demonstrada para antígenos S e RBD utilizando ACE2 solúvel em um formato de ensaio de neutralização. A tecnologia baseada em multiplex tem sido amplamente adotada como uma tecnologia comprovada para testes sorológicos multiplex e tem vantagens distintas para a triagem em larga escala, incluindo curto tempo de resultados, pequenos requisitos amostrais e mão de obra reduzida2,3,4.
Recentemente, um novo instrumento de análise de fluxo tornou-se disponível que fornece a mesma capacidade de alto plex e alto rendimento do sistema demonstrado no trabalho anterior1, mas com o benefício adicional de dois canais de repórteres. A capacidade de medir dois sinais fluorescentes de repórter em uma única reação permite a avaliação de dois resultados por analito para cada amostra e é ideal para aplicações de isotipagem, que normalmente devem ser realizadas em poços de reação separados5. A capacidade de repórter duplo fornece o dobro dos dados para cada amostra em metade do número de poços de reação com metade dos requisitos de volume amostral e, portanto, tem uma clara vantagem sobre sistemas de repórteres únicos. Este estudo detalha o protocolo de ensaio sorológico padrão e descreve a adaptação a um ensaio de neutralização. Além disso, este relatório descreve a conversão do ensaio de repórter único para um ensaio sorológico de repórter duplo e, posteriormente, um ensaio de neutralização de repórteres duplo, para medir simultaneamente anticorpos neutralizantes de isótipos IgG e IgM contra os antígenos SARS-CoV-2 S, RBD e Nc. Uma visão geral visual do protocolo de ensaio é fornecida na Figura 1.
Protocol
Foram utilizadas neste estudo amostras residuais de soro humano previamente testadas para análises diagnósticas SARS-CoV-2, que foi aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Rochester.
1. Reagentes e equipamentos
- Obtenha antígenos coronavírus e IgG e IgM humanos de fontes comerciais.
- Obtenha conjuntos de contas de controle de ensaio (AC) (45 e 220) do fornecedor de instrumentos. O conjunto de contas AC 45 monitora a coleção Mediana de Intensidade de Fluorescência (MFI) em instrumentos do canal de repórter único (RP1). A conta AC definiu 220 monitores da coleção MFI no segundo canal de repórteres (RP2).
- Obtenha anticorpos de detecção e soro de coelho específico para antígeno e anticorpos usados para confirmação de acoplamento.
- Realize a detecção com anticorpos rotulados por biotina com um streptavidina, conjugado R-phycoerythrin (SAPE) ou um conjugado streptavidin de fluorohore Super Bright 436 (SASB; excitação a 405 nanômetros (nm) e emissão a 436 nm).
- Obter proteína HUMANA ACE2 (ou seja, o Receptor SARS). Antes do uso, a proteína ACE2 sehidratada e 0,2-μm dissolveu-se a uma concentração de 1 mg/mL em água livre de nuclease (não tratada por DEPC, autoclavada e 0,2-μm filtrada) e armazenar a 4 °C.
- Realize todas as reações em placas de fundo plano (NBS) pretas de 96 bem. Sele as placas com fita de vedação de alumínio de 96 poços para etapas de incubação de ensaios. Use um separador de placa magnética para os passos de lavagem do ensaio.
2. Preparação de contas de controle acoplado a antígenos e anticorpos
- Covalently casal conjuntos magnéticos, poliestirenos e microesferas codificados por cores (6,5-μm de diâmetro) com antígenos S, RBD e Nc, conforme descrito em Cameron et al.1. Os antígenos coronavírus são acoplados a 10 pmol/106 contas (S) e 100 pmol/106 contas (RBD e Nc). As contas de controle aliadas ao IgG ou IgM humanos são geradas como descrito anteriormente1. IgG e IgM estão acoplado a 5 μg/106 contas.
- Após o acoplamento, determine as concentrações de contas e dilua cada estoque para 1 x 106 contas/mL usando procedimentos descritos6.
- Realize a confirmação do acoplamento de antígeno com anticorpos específicos de antígeno de coelho ou com soro humano positivo como descrito em Cameron et al.1.
- Confirme o acoplamento de IgG humano com os reagentes de detecção anti-humanos do ensaio IgG/SAPE, e o acoplamento IgM com um IgM de cabra biotinítula (PE) rotulado como bode anti-humano.
NOTA: A confirmação do acoplamento é realizada usando uma titulação de soro ou anticorpo específico para proteínas, pois a concentração ideal para usar nesses reagentes não é conhecida. Para o soro, são utilizadas diluições de dobras seriais, enquanto para anticorpos fornecidos como estoques mg/mL, são utilizadas séries de diluição serial μg/mL.
- Confirme o acoplamento de IgG humano com os reagentes de detecção anti-humanos do ensaio IgG/SAPE, e o acoplamento IgM com um IgM de cabra biotinítula (PE) rotulado como bode anti-humano.
- Contas de ensaio diluído (AC) que monitoram a coleta de MFI nos dois canais de repórter para uma concentração de 1 x 106 contas/mL antes de usar em misturas de contas multiplex.
3. Preparação fresca da mistura de contas multiplex
- Prepare as contas multiplex misturas frescas a cada dia acoplado a cada conta acoplado e controle de estoques de contas em 1 x 106 contas/mL.
NOTA: As misturas de contas multiplex estão preparadas para entregar 2.500 contas para cada região de contas em um volume de 50 μL. Cálculos de como preparar mixes de contas multiplex para qualquer número de reações estão descritos no blog publicado por Angeloni (2020)6.
4. Diluição amostral
- Prepare uma diluição amostra de soro de 1:100 contendo 0,05% Tween 20, 0,02% de azida de sódio e 1% de albumina de soro bovino (BSA) (tampão PBS-TBN).
- Diluir amostras novamente 10 vezes adicionando 20 μL da diluição de 1:100 a 180 μL de PBS-TBN.
NOTA: As amostras de soro consistem em soro negativo, de amostras coletadas em 2019 antes da pandemia COVID-19, e sera positiva de pacientes SARS-CoV-2 PCR-positivo, representando títulos de anticorpos baixos e altos. Foram coletadas amostras positivas entre ≈3 a > 60 dias a partir do início dos sintomas (DFSO). Todas as amostras de soro e sera de controle negativo despojado do IgG são diluídas para 1:1000, conforme descrito abaixo. Para ensaios de neutralização, o sera é diluído 1:500 conforme descrito nos protocolos de neutralização abaixo (seções 6 e 8).
5. Protocolo de ensaio sorológico de repórter único
- Adicione 50 μL de mistura de contas multiplex a cada poço atribuído de uma placa microtiter de 96 bem não vinculante.
- Pipeta 50 μL de 1:1000 soro ou PBS-TBN nos poços apropriados; a diluição final do soro no poço é de 1:2000.
- Cubra a placa com uma vedação de papel alumínio microplacado e incuba em um agitador de placa aquecido a 37 °C por 15 min com agitação a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no separador da placa magnética por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Enquanto retém a placa no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Borrique a placa em papel absorvente enquanto ainda segura a placa no ímã.
- Lave os poços de reação conforme descrito abaixo (primeira lavagem pós-amostra).
- Retire a placa do ímã da placa e adicione 150 μL de PBS-TBN a cada poço.
- Cubra a placa com um selo de papel alumínio fresco e agite a 37 °C por 2 min a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no ímã da placa por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Enquanto retém a placa no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Borrique a placa em papel absorvente enquanto ainda segura a placa no ímã.
- Lave os poços de reação conforme descrito abaixo (segunda lavagem pós-amostra de incubação).
- Retire a placa do ímã da placa e adicione 150 μL de PBS-TBN a cada poço.
- Cubra a placa com um selo de papel alumínio fresco e agite a 37 °C por 2 min a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no ímã da placa por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Enquanto retém a placa no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Remova a placa do ímã.
- Faça uma mistura fresca de IgG biotina-anti-humano com SAPE diluindo o anticorpo para 0,62 μg/mL e o SAPE a 1 μg/mL. Adicione 100 μL a cada poço.
- Cubra a placa com uma vedação de papel alumínio microplacado e incuba em um agitador de placa aquecido a 37 °C por 15 min com agitação a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no separador da placa magnética por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Enquanto retém a placa no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Borrique a placa em papel absorvente enquanto ainda segura a placa no ímã.
- Lave os poços de reação conforme descrito abaixo (primeira lavagem de incubação de anticorpos pós-detecção).
- Retire a placa do ímã da placa e adicione 150 μL de PBS-TBN a cada poço.
- Cubra a placa com um selo de papel alumínio fresco e agite a 37 °C por 2 min a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no ímã da placa por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Enquanto retém a placa no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Borrique a placa em papel absorvente enquanto ainda segura a placa no ímã.
- Lave os poços de reação conforme descrito abaixo (segunda lavagem de incubação de anticorpos pós-detecção).
- Retire a placa do ímã da placa e adicione 150 μL de PBS-TBN a cada poço.
- Cubra a placa com um selo de papel alumínio fresco e agite a 37 °C por 2 min a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no separador da placa magnética por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Enquanto retém a placa no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Remova a placa do ímã.
- Adicione 100 μL de PBS-TBN a cada poço.
- Cubra com vedação de papel alumínio e agite por 2 min a 37 °C.
- Retire a placa do agitador da placa. Em seguida, remova o selo de folha e leia 50 μL de cada poço no analisador de fluxo de acordo com o Manual do Usuário. Uma breve descrição é fornecida abaixo.
- Selecione o menu suspenso no canto superior esquerdo da tela e navegue até a configuração da placa.
- Selecione Placa de execução.
- Selecione o ícone Ejetar para ejetar o porta-placas.
- Carregue a placa no porta-placas e selecione o ícone Retrair para retrair o porta-placas.
- Selecione o ícone Executar para executar a placa.
6. Protocolo de ensaio de neutralização de repórter único
- Prepare uma mistura de contas multiplex fresca, conforme descrito na seção 3 acima.
- Diluir o paciente e controlar o sera 1:500 da seguinte forma.
- Diluir o soro 1:100 misturando 10 μL de soro em 990 μL de PBS-TBN.
- Diluir o soro mais 5 vezes adicionando 40 μL de 1:100 soro em 160 μL de PBS-TBN.
- Adicione 50 μL de mistura de contas multiplex a cada poço atribuído de uma placa microtiter de 96 bem não vinculante.
- Adicione 25 μL de diluição ACE2 de 2 μg/mL a cada poço.
- Cubra a placa com uma vedação de papel alumínio microplacado e incubar em um agitador de placa aquecida a 37 °C por 2 min com agitação a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e remova o selo de papel alumínio.
- Adicione 25 μL de 1:500 soro ou PBS-TBN aos poços atribuídos.
- Cubra a placa com uma vedação de papel alumínio microplacado e incuba em um agitador de placa aquecido a 37 °C por 15 min com agitação a 600 rpm.
- Para o restante do procedimento de ensaio, siga as etapas 5.4 a 5.18.5 como descrito acima.
7. Conversão para um ensaio sorológico IgG e IgM de repórter duplo
- Prepare contas acoplado a antígenos como descrito na Seção 2 acima.
NOTA: Um conjunto adicional de contas, juntamente com igM humano, está incluído para monitorar a adição de reagentes de detecção anti-IgM, bem como um conjunto adicional de contas AC (220) para monitorar a coleta de MFI para RP2. Todas as ações de contas estão em 1 x 106 contas/mL para inclusão em misturas de contas multiplex, conforme descrito abaixo. - Prepare misturas de contas multiplex frescas como descrito na Seção 3 acima.
- Amostras de soro diluído e soro de controle negativo despojado de IgG 1:1000, conforme descrito na Seção 4 acima.
- Adicione 50 μL de mistura de contas multiplex a cada poço atribuído de uma placa microtiter de 96 bem não vinculante.
- Pipeta 50 μL de 1:1000 soro ou PBS-TBN para os poços apropriados. A diluição final do soro no poço é de 1:2000.
- Cubra a placa com uma vedação de papel alumínio microplacado e incuba em um agitador de placa aquecido a 37 °C por 15 min com agitação a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no separador da placa magnética por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Enquanto retém a placa no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Borrique a placa em papel absorvente enquanto ainda segura a placa no ímã.
- Lave os poços de reação conforme descrito abaixo (primeira lavagem pós-amostra).
- Retire a placa do ímã da placa e adicione 150 μL de PBS-TBN a cada poço.
- Cubra a placa com um selo de papel alumínio fresco e agite a 37 °C por 2 min a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no ímã da placa por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Enquanto retém a placa no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Borrique a placa em papel absorvente enquanto ainda segura a placa no ímã.
- Lave os poços de reação novamente com PBS-TBN (segunda lavagem pós-amostra), exatamente conforme descrito acima nas etapas 7.10.1-7.10.5.
- Remova a placa do ímã.
- Faça uma mistura de reagente de detecção fresca com a combinação necessária de reagentes e adicione 50 μL ou 100 μL a cada poço.
NOTA: As misturas de reagente de detecção contendo o IgG anti-Humano conjugado ao corante repórter Brilhante Violet 421 (BV; excitação a 405 nm e emissão a 421 nm) foram utilizadas a 50 μL/well devido à limitação das quantidades de reagentes de estoque disponíveis. Todas as outras misturas de reagente de detecção são usadas a 100 μL/well. - Cubra a placa com uma vedação de papel alumínio microplacado e incuba em um agitador de placa aquecido a 37 °C por 15 min com agitação a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no separador da placa magnética por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Enquanto retém a placa no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Borrique a placa em papel absorvente enquanto ainda segura a placa no ímã.
- Lave os poços de reação conforme descrito abaixo com PBS-TBN (primeira lavagem após a incubação de anticorpos de detecção).
- Retire a placa do ímã da placa e adicione 150 μL de PBS-TBN a cada poço.
- Cubra a placa com um selo de papel alumínio fresco e agite a 37 °C por 2 min a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no separador da placa magnética por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Enquanto retém a placa no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Borrique a placa em papel absorvente enquanto ainda segura a placa no ímã.
- Lave os poços de reação novamente com PBS-TBN (segunda lavagem após a incubação de anticorpos), exatamente como descrito acima nas etapas 7.17.1-7.17.5.
- Remova a placa do ímã.
- Adicione 100 μL de PBS-TBN a cada poço.
- Cubra com vedação de papel alumínio e agite por 2 min a 37 °C.
- Retire a placa do agitador da placa. Em seguida, remova o selo de folha e leia 50 μL de cada poço no analisador de fluxo, conforme descrito acima nas etapas 5.18.1-5.18-5.
8. Conversão para ensaio de neutralização de repórter duplo
- Use as contas acoplado conforme descrito na etapa 7.1 acima.
- Prepare uma mistura de contas multiplex fresca, conforme descrito na etapa 7.2.
- Amostras de soro e soro de controle negativo despojado são diluídos 1:500 da seguinte forma.
- Prepare uma diluição de 1:100 misturando 10 μL de soro em 990 μL de PBS-TBN.
- Diluir as amostras de 1:100 mais 5 vezes adicionando 40 μL das diluições de 1:100 a 160 μL de PBS-TBN.
- Adicione 50 μL de mistura de contas multiplex a cada poço atribuído de uma placa microtiter de 96 bem não vinculante.
- Adicione 25 μL de diluição ACE2 de 2 μg/mL a cada poço.
- Cubra a placa com uma vedação de papel alumínio microplacado e incubar em um agitador de placa aquecida a 37 °C por 2 min com agitação a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e remova o selo de papel alumínio.
- Adicione 25 μL de 1:500 soro ou PBS-TBN aos poços atribuídos.
- Cubra a placa com uma vedação de papel alumínio e incuba em um agitador de placa aquecido a 37 °C por 15 min com agitação a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no separador da placa magnética por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Com a placa retida no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Borrique a placa em papel absorvente enquanto ainda segura a placa no ímã.
- Lave os poços de reação conforme descrito abaixo (primeira lavagem pós-amostra de incubação).
- Retire a placa do ímã da placa e adicione 150 μL de PBS-TBN a cada poço.
- Cubra a placa com um selo de papel alumínio fresco e agite a 37 °C por 2 min a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no separador da placa magnética por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Com a placa retida no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Borrique a placa em papel absorvente enquanto ainda segura a placa no ímã.
- Lave os poços de reação novamente com PBS-TBN (segunda lavagem pós-amostra de incubação), exatamente conforme descrito acima nas etapas 8.13.1-8.13.5.
- Remova a placa do ímã.
- Faça uma mistura de reagente de detecção fresca com a combinação necessária de reagentes e adicione 50 μL ou 100 μL a cada poço.
NOTA: As misturas de reagente de detecção contendo o IgG anti-Humano conjugado ao corante repórter BV foram utilizadas a 50 μL/well devido à limitação das quantidades de reagentes de estoque disponíveis (ver Tabela de Materiais). Todas as outras misturas de reagente de detecção são usadas a 100 μL/well. - Cubra a placa com uma vedação de papel alumínio microplacado e incuba em um agitador de placa aquecido a 37 °C por 15 min com agitação a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no separador da placa magnética por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Com a placa retida no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Borrique a placa em papel absorvente enquanto ainda segura a placa no ímã.
- Lave os poços de reação como descrito abaixo (primeiro foi após a incubação de anticorpos de detecção).
- Retire a placa do ímã da placa e adicione 150 μL de PBS-TBN a cada poço.
- Cubra a placa com um selo de papel alumínio fresco e agite a 37 °C por 2 min a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no separador da placa magnética por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Com a placa retida no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Borrique a placa em papel absorvente enquanto ainda segura a placa no ímã.
- Lave os poços de reação novamente com PBS-TBN (segunda lavagem após a incubação de anticorpos de detecção), exatamente como detalhado acima nas etapas 8.21.1-8.21.5.
- Retire a placa do ímã da placa e adicione 150 μL de PBS-TBN a cada poço.
- Cubra a placa com um selo de papel alumínio fresco e agite a 37 °C por 2 min a 600 rpm.
- Retire a placa do agitador da placa e coloque no separador da placa magnética por 2 minutos para separar as contas da mistura de reação.
- Com a placa retida no ímã, remova o selo de papel alumínio, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de resíduos e tire suavemente o supernatante dos poços.
- Remova a placa do ímã.
- Adicione 100 μL de PBS-TBN a cada poço.
- Cubra com vedação de papel alumínio e agite por 2 min a 37 °C.
- Retire a placa do agitador da placa. Em seguida, remova o selo de folha e leia 50 μL de cada poço no analisador de fluxo, conforme descrito acima nas etapas 5.18.1-5.18-5.
Representative Results
Otimização do Ensaio Sorológico Único Repórter.
A estratégia de acoplamento para todos os antígenos SARS-CoV-2 é descrita em Cameron, et al., 20201 e na etapa 2.1 acima. A estratégia de confirmação de acoplamento é descrita na etapa 2.3 acima. Para um acoplamento eficiente, os valores de intensidade de fluorescência mediana (IMFI) devem ser significativamente maiores do que a reação de controle negativo de nenhum soro/sem anticorpos e devem demonstrar uma resposta de dose de diminuição do sinal de MFI com quantidades de detecção de reagente. Os IMis de aproximadamente 1.000 unidades de MFI ou mais de segundo plano MFI geralmente indicam acoplamento eficiente de proteínas e dependem da concentração e especificidade do reagente de detecção utilizado. Utilizando este método, a confirmação do acoplamento de antígeno S, RBD e Nc foram testados para dois lotes de contas(Figura 2). Os sinais de IM para todos os antígenos foram significativamente maiores que o MFI de fundo e mostraram uma resposta de dose com titulação dos reagentes de detecção. Os dados também mostraram boa reprodutibilidade dos níveis de FI entre os dois lotes diferentes de contas acoplou.
A otimização do ensaio de repórter único foi feita como descrito em Cameron, et al., 20201. Cada antígeno foi testado em diferentes concentrações de acoplamento com diferentes diluições de várias amostras de soro representando amostras altas, médias, baixas e negativas. Além disso, como o ensaio mede os títulos IgG, um soro despojado de IgG foi usado como uma amostra negativa adicional. Os resultados de uma série representativa de diluição amostral com diferentes níveis de acoplamento de antígeno são mostrados na Figura 3. Esta série inicial de diluição foi testada com uma concentração fixa de reagentes de detecção para obter uma gama potencial de níveis representativos de IPS e MFI de fundo. A partir desses dados, foram determinadas faixas adicionais de diluição amostral e níveis de acoplamento de antígenos e testados posteriormente com amostras adicionais (dados não mostrados).
Em seguida, a concentração do reagente de detecção foi otimizada para uso com as diferentes diluições de soro e níveis de acoplamento de antígenos. Dados representativos utilizando 6 amostras positivas e 2 negativas são mostrados na Figura 4. Após testes adicionais com várias centenas de amostras de soro pré-COVID-19 negativos, os níveis de acoplamento de antígeno ideal e concentrações de regente de detecção foram selecionados para o protocolo de ensaio final, conforme descrito na seção 5.
Conversão para um único ensaio de neutralização de repórteres
A conversão do ensaio sorológico único repórter para um ensaio de neutralização foi alcançada adicionando uma etapa de incubação usando ACE2 (como reagente concorrente) com as contas antes de adicionar a amostra de soro. Ao titular a quantidade de ACE2 adicionado, observou-se a inibição da ligação IgG aos antígenos S e RBD, como mostrado na Figura 5. Enquanto os 11 pacientes tiveram diferentes títulos de IgG, cada um apresentou uma diminuição significativa no sinal de FI com aumento da concentração ace2. Como esperado, ace2 só impacta os sinais de MFI de S e RBD, mas não o antígeno Nc.
O sinal de MFI residual percentual relativo a 0 μg/mL ACE2 para todas as amostras é mostrado na Figura 6. Para a maioria das amostras, observou-se perda de sinal >30% para S e RBD com aumento da concentração de ACE2. Como esperado, não houve efeito de ACE2 no sinal Nc.
Conversão para um ensaio sorológico de repórter duplo IgG e IgM
Para o ensaio IgG e IgM de repórter duplo, as condições padrão de ensaio de repórteres individuais foram usadas para testar diferentes combinações de anticorpos e repórteres para os dois canais de repórteres. O canal RP1 é semelhante aos instrumentos de análise de fluxo anteriores com detecção de fluorescência "laranja" para corantes repórteres como PE. O segundo canal, RP2, emprega um laser de excitação violeta que pode ser usado para detectar a fluorescência "azul" de corantes animados a 402 nm com picos de espectro de emissão na faixa de 421-441 nm.
Várias combinações diferentes de anticorpos IgG e IgM anti-humanos foram testadas em várias concentrações com as condições padrão de diluição e incubação amostral de 2.000 vezes detalhadas na seção 6. Um teste inicial de anti-IgM conjugado ao dylight 405 reporter dye (DL 405; excitação a 400 nm e emissão a 420 nm) para o canal RP2 foi realizado usando um conjunto de 11 amostras positivas para PCR com DFSO variando de 5 a >60 dias, e uma amostra de soro despojado do IgG. Este reagente de detecção não produziu um sinal alto no canal RP2, como mostrado na Figura 7A, B,C. Para amostras com igM RP2 MFI elevado, os sinais mais elevados foram observados para RBD e Nc (Figura 7B,C). Embora os títulos de IgM devam ser elevados neste momento em algumas amostras, os níveis observados de IFI não excediam 140 unidades de MFI com o reagente de detecção de IgM. Além disso, a conta de controle para IgM não tinha um alcance dinâmico significativo para o MFI ao usar dL 405 conjugado ao anti-IgM em comparação com um repórter anti-IgM RP1 rotulado pe usado nas mesmas concentrações(Figura 7D).
Como um reagente de detecção RP2 adequado para IgM não estava disponível, o anti-IgG de biotina original com SASB foi testado para uso no canal RP2. O sinal para IgG no canal RP2 com SASB não tinha o mesmo alcance dinâmico do SAPE, mas ainda tinha um alcance adequado para medir títulos IgG para S, RBD e Nc (Figura 8). Esses dados levaram a testar diferentes combinações de reagentes de detecção RP1 IgM e RP2 IgG, conforme descrito abaixo.
Conversão para ensaio de neutralização de repórter duplo
O ensaio sorológico duplo repórter foi convertido em um ensaio de neutralização adicionando uma etapa de incubação com ACE2 e contas, antes de adicionar a amostra de soro. Foi utilizada uma série de diluição de 2 vezes de ACE2 a partir de 16 μg/ml e, em seguida, testada com conjuntos de 11 amostras e sera descascada como descrito acima. Além disso, 3 combinações diferentes de misturas de anticorpos de detecção RP1 IgM e RP2 IgG foram testadas em um conjunto de 11 amostras e controles de soro despojados. As combinações finais e as concentrações de reagentes determinadas a serem ótimas estão detalhadas na Tabela 1.
Para detecção de IgG, o IgG/SASB anti-humano biotina usado no ensaio original de repórter único foi testado juntamente com outro anti-IgG conjugado ao corante repórter BV. Enquanto o conjugado BV tinha sinais de MFI rp2 elevados, a intensidade do sinal MFI para o título de IgG variou entre as titulações ACE2(Figura 9A, C,E). A combinação biotina anti-humana IgG/SASB teve uma redução mais consistente do sinal MFI em toda a titulação ACE2 em comparação com o conjugado BV, demonstrando uma resposta de dose, embora os níveis de IFI fossem mais baixos. A flutuação do sinal pelo conjugado BV através das concentrações ACE2 também interferiu na determinação da inibição percentual por ACE2 em toda a gama de títulos IgG em comparação com a combinação biotina anti-humana IgG/SASB(Figura 9B, D,F). Amostras com sinais de MFI baixos, como a amostra DFSO 3, não possuem títulos altos o suficiente para avaliar o desempenho desses reagentes ou medir a capacidade de neutralização do IgG.
Para determinar os títulos IgM no canal RP1, um anti-IgM conjugado por PE foi comparado a um IgM anti-humano conjugado ao dyLight 549 reporter dye (DL 549; excitação a 562 nm e emissão a 576 nm) nas concentrações listadas na Tabela 1. Desses dois reagentes, o anti-IgM PE apresentou MFIs mais elevados do que os gerados pelo IgM anti-humano DL 549 para as amostras testadas(Figura 9A, C,E). A conta de controle IgM que mede a adição desses reagentes apresentou diferentes MFIs médios de ≈17.000 para o anti-IgM pe e 2.723 para o conjugado DL 549. Mesmo com essas diferenças, o impacto das várias concentrações ace2 no FIM foi mensurável com o conjugado DL 549. Para determinar a inibição de ACE2 por cento da ligação IgM, houve uma pequena, mas insignificante diferença entre os dois reagentes de detecção de IgM(Figura 9B, D,F).
| Combinação | Repórter | Concentração Final Em Poço (μg/mL) | |
| RP1 | RP2 | ||
| 1 | PE anti-IgM | 2 | - |
| Biotina-Ig | - | 0.62 | |
| SASB | - | 4 | |
| 2 | DyLight 549 IgM Anti-Humano | 1 | - |
| Brilhante Violeta 421 IgG Anti-Humano | - | 1 | |
| 3 | DyLight 549 IgM Anti-Humano | 1 | - |
| Biotina-Ig | - | 0.62 | |
| SASB | - | 4 | |
Tabela 1: Lista de combinações de corantes de repórter RP1 e RP2 testadas. Vários diferentes corantes de repórter RP1 e RP2 foram avaliados para medir títulos IgG e IgM. As três combinações mostradas acima foram testadas em diferentes modos de detecção RP1 e para otimização do ensaio de neutralização. Para combinações RP2 usando SASB, concentrações para o anticorpo de detecção biotinilada e SASB são mostradas. *Concentração Final representa bem a concentração final na reação.
Figura 1: Fluxograma destacando as principais etapas do protocolo de ensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Confirmação do acoplamento de antígeno. Antígenos foram acoplados a 100, 10 e 1 pmol/106 contas. Para antígenos S e RBD, foi usado e detectado soro anti-coelho de coelho s. Para Nc, foi utilizado um anti-Nc policlonal de coelho purificado de proteína G. As curvas de titulação para contas acopladas com 10 pmol S(A),100 pmol RBD(B)e 100 pmol Nc (C)são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Otimização da diluição do soro com diferentes níveis de acoplamento de antígeno. Amostras de soro representando amostras altas, médias, baixas e negativas foram testadas com os diferentes acoplamentos de antígeno pmol/106. Uma titulação de soro de 4 vezes foi testada com uma mistura multiplex de contas acopladas a antígenos usando o protocolo de ensaio descrito na seção 5. Os valores de MFI das curvas de titulação para S (A),RBD(B)e Nc (C) são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Determinação da concentração ideal de diluição e detecção de reagentes do soro. Oito amostras de soro, incluindo pacientes negativos (2 amostras) e de baixa a alta positivo (6 amostras), foram testadas em diluições adicionais de soro com três diferentes concentrações de reagentes de detecção. Os resultados do MFI são mostrados para S (A),RBD (B)e Nc (C). Com base nesses e em outros dados (não mostrados), foi selecionada uma diluição amostral de 1:2.000 e uma concentração de anticorpos de detecção de biotina de 0,62 μg/mL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Otimização do ensaio de neutralização de repórter único. A modificação do ensaio sorológico único repórter a um ensaio de detecção de anticorpos neutralizante foi realizada adicionando uma etapa de incubação com ACE2 como concorrente, conforme descrito na Seção 6. Um conjunto de 11 amostras, variando de sera de titer baixo a alto positivo, e uma amostra de soro listrado IgG foram testados com uma série de diluição de duas vezes de ACE2 a partir de 4 μg/mL, usando condições de ensaio padrão. Nesta faixa de concentrações ACE2, pode-se ver uma diminuição no IFI com o aumento do ACE2 para S (A) e RBD(B),mas não para Nc(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Inibição percentual de sinal com ACE2. Os sinais residuais por cento para o conjunto de 11 amostras (da Figura 4) são mostrados. Para cada amostra, independentemente de seu título IgG, foi alcançada uma diminuição máxima de ≥ 30% de sinal MFI para S (A) e RBD (B)na maior concentração ACE2. Para o antígeno Nc(C)não houve inibição significativa do sinal com qualquer quantidade de ACE2 testada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Teste de DyLight 405 anti-IgM como reagente de detecção RP2 IgM. Um conjunto de 11 amostras e soros despojados de IgG foram usados para testar dL 405-conjugado anti-IgM como um reagente de detecção RP2. Os sinais RP2 IgM MFI para S (A),RBD(B)e Nc (C) são mostrados. O maior sinal de MFI para qualquer antígeno com qualquer amostra foi de aproximadamente 140 unidades MFI para RBD com amostra H (B). Mesmo o sinal no conjunto de contas de controle IgM foi inferior a 1.000 MFI no canal RP2 em toda a faixa de titulação de anticorpos e não mostrou o aumento do alcance dinâmico observado com o anticorpo de detecção anti-IgM PE no canal RP1(D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Otimização do SASB como repórter RP2 com Biotin anti-IgG. Um conjunto de 11 amostras e soros despojados de IgG foram usados para testar uma série de diluição de SASB com o padrão 0,62 μg/mL anti-IgG. Os IgG MFIs resultantes no canal RP2 para S (A),RBD (B)e Nc (C) são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Comparação de três combinações diferentes de misturas de detecção RP1 IgM e RP1 IgG. Três diferentes misturas de anticorpos de detecção foram testadas em 11 amostras e soros despojados de IgG. As combinações e concentrações finais utilizadas estão descritas na Tabela 1. Todas as amostras foram testadas com diluições ACE2 de 2 vezes, a partir de 16 μg/mL. Os dados para amostras no DFSO de 3, 12 e 30 dias são mostrados. Os sinais MFI para RP1 IgM (laranja) e RP2 IgG (azul) são mostrados em A (DFSO 3), C (DFSO 12) e E (DFSO 30). Os MFIs residuais ace2% são mostrados em B (DFSO 3), D (DFSO 12) e F (DFSO 30). Os sinais que representam uma redução de >30% em relação aos controles ACE2 não são destacados verde claro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este estudo expandiu a funcionalidade de um ensaio de microesfera fluorescente multiplex, 3Flex, que avalia qualitativamente a resposta do IgG à infecção pelo SARS-CoV-21. Enquanto muitos ensaios sorológicos para COVID-19 detectam um único antígeno, este ensaio avalia simultaneamente antígenos S, RBD e Nc, e inclui um controle interno de isótipo de anticorpos7. Além disso, o ACE2 é usado como um indicador para detectar titulações de anticorpos neutralizantes ao SARS-CoV-2.
Ensaios multi-antígenos podem ser particularmente úteis no futuro para discriminar respostas imunes entre pessoas infectadas e vacinadas. Com o SARS-CoV-2, se apenas os anticorpos S e RBD forem avaliados, seria impossível discernir se isso foi devido a uma infecção passada ou a uma resposta de anticorpos de vacinação. Nenhuma das vacinas que estão atualmente em uso tem como alvo o antígeno Nc, portanto, avaliando antígenos S/RBD e Nc, é possível distinguir a infecção viral passada (Nc- e S/RBD-positivo) a partir de uma resposta de vacinação (somente S/RBD positivo; Nc-negativo).
No presente estudo, os ensaios sorológicos e de neutralização 3Flex (seções 5 e 6) foram transferidos para um novo instrumento de análise de fluxo de repórteres duplos (seções 7 e 8). Os protocolos típicos de imunoensaio para ensaios multiplex baseados em contas são semelhantes aos protocolos ELISA padrão, seguindo etapas comparáveis para incubação de amostras, incubação de anticorpos/repórteres de detecção e análise dos resultados8. Estudos anteriores também demonstraram como os ensaios padrão ELISA podem ser transferidos para uma plataforma multiplexação baseada em contas9.
Os protocolos de ensaio poderiam ser perfeitamente transferidos do instrumento de repórter único antecessor para o novo sistema de repórter duplo, como mostram os resultados obtidos para as amostras e controles de teste(Figura 4 e Figura 5). No ensaio sorológico, todas as amostras positivas de soro demonstraram uma diminuição característica de dose-responsiva no sinal correspondente tanto a uma maior diluição amostral quanto a uma menor concentração de anticorpos de detecção, enquanto os sinais para as amostras negativas permaneceram em níveis de fundo. Da mesma forma, para o ensaio de neutralização, sinais decrescente para S e RBD, mas não Nc, corresponderam ao aumento das concentrações do concorrente ACE2, enquanto o soro despojado do IgG foi muito menos afetado pela adição de ACE2. A pré-incubação das contas com ACE2 por 2 minutos antes da adição da amostra de soro (conforme descrito nas seções 6 e 8), também foi comparada à combinação das contas com ACE2 e soro ao mesmo tempo e produziu pouca diferença nos resultados (dados não apresentados). No entanto, como os resultados obtidos com as contas mais a etapa de pré-incubação ACE2 foram mais consistentes, foi o procedimento final adotado para o protocolo de ensaio de neutralização (seções 6 e 8).
Como o sistema de repórteres duplos incorpora um segundo canal de repórteres fluorescentes, ambos os ensaios foram convertidos em ensaios de isotipagem para medir simultaneamente as respostas IgG e IgM. A funcionalidade de repórter duplo do analisador de fluxo permite a coleta de sinais fluorescentes de dois reagentes de detecção de repórteres para cada analito no multiplex para cada amostra, dobrando efetivamente os dados gerados por amostra em um ensaio. Para o desenvolvimento e otimização dos protocolos de ensaio de repórter duplo, vários corantes de repórteres disponíveis comercialmente e anticorpos de detecção foram avaliados para o novo canal RP2 (Figura 7 e Figura 8) para determinar as melhores opções disponíveis. O anticorpo anti-IgM conjugado com o corante repórter DL 405 não teve um bom desempenho no canal RP2(Figura 7),por isso o anti-IgG biotina com SASB foi posteriormente avaliado para detecção no canal RP2(Figura 8). Três combinações de reagentes de detecção RP1 e RP2 foram comparadas no ensaio de neutralização de repórteres duplos (Tabela 1 e Figura 9) para determinar as combinações de melhor desempenho para detecção simultânea de anticorpos neutralizantes IgG e IgM. Embora houvesse diferenças significativas na intensidade do sinal entre o canal RP1 usando PE-anti IgM e o canal RP2 usando dL 549 anti-IgM, não houve diferença significativa na medição da inibição por cento de ligação por ACE2.
Várias limitações ao método atual e este estudo são reconhecidas. Em primeiro lugar, as amostras testadas e utilizadas no desenvolvimento e otimização do método foram limitadas a conjuntos de 8-11 amostras. Mais amostras serão testadas em estudos expandidos para verificar se o método está totalmente otimizado. Em segundo lugar, um número limitado de repórteres fluoroforos e pares de repórteres foram testados. Testes adicionais de todos os repórteres disponíveis em todas as combinações possíveis determinarão quais reagentes podem ser usados com sucesso neste método. O anticorpo anti-IgG conjugado à biotina era diferente do anticorpo anti-IgG conjugado ao repórter BV 421. Assim, embora a variabilidade na intensidade do sinal para o BV 421 anti-IgG existisse, poderia ser devido à especificidade do anticorpo e não relacionada ao corante repórter. Testar outros anticorpos conjugados BV 421 disponíveis pode identificar outro anticorpo que teria um bom desempenho no canal RP2. Estudos futuros também avaliarão a combinação de PE anti-IgM com IgG anti-humano BV 421 para detecção em RP1 e RP2, respectivamente. Por último, mesmo com a capacidade de repórter duplo do instrumento, os ensaios são limitados a dois isótipos (dois parâmetros) por reação. Se os isótipos adicionais forem medidos ou a isotipagem completa for desejada, então reações adicionais usando os mesmos dois canais de repórteres precisariam ser executadas em poços separados.
A tecnologia multiplexa-de-contas permite o design de ensaio rápido e flexível com fácil implementação em fluxos de trabalho de laboratório de rotina3,4,10. Este estudo demonstrou a facilidade na transferência dos ensaios sorológicos e de neutralização 3Flex descritos anteriormente para SARS-CoV-2 para um sistema de análise de fluxo para medir o IgG com um único repórter, ou com ligeira modificação, medindo simultaneamente as respostas do IgG e do IgM usando dois repórteres. A opção de repórter duplo tem vantagens claras sobre plataformas de repórteres individuais, pois pode fornecer o dobro de dados por amostra, usando metade do volume amostral e em metade do número de poços de reação. Com os corantes de repórter apropriados e anticorpos de detecção, os ensaios de isotipagem podem ser facilmente desenvolvidos e realizados no instrumento de análise de fluxo de repórteres duplo.
Disclosures
Stephen Angeloni e Sherry Dunbar são funcionários da Luminex Corporation que produz alguns dos reagentes e instrumentos que foram usados neste estudo. A publicação do Open Access deste artigo foi patrocinada pela Luminex Corporation
Acknowledgments
Este relatório foi financiado pela Luminex Corporation (Austin, TX). Os autores agradecem matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) pela assistência científica de edição.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACE2 (human) (rec.) | AdipoGen Life Sciences | AG-40B-0192-3050 | |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-065-098 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A7888 | Sigma-Aldrich |
| Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator | Various | ||
| Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 709-675-149 | |
| Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3650 | |
| Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile | Corning | 6570 | |
| DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-475-043 | |
| DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-506-129 | Discontinued but available from multiple vendors |
| eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate | ThermoFisher Scientific | 62-4317-82 | |
| Fisherbrand Incubating Microplate Shaker | ThermoFisher Scientific | 02-217-757 | Fisher Scientific |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE | ThermoFisher Scientific | P-2771MP | |
| Luminex Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | |
| MagPlex beads | Luminex Corporation | MC100XX-ID | |
| PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-116-129 | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | P3813 | Sigma-Aldrich |
| SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56683 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56049 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified |
| SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56047 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56048 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb | SinoBiological | 40150-R007 | |
| Sodium Azide | MilliporeSigma | S2002 | Sigma-Aldrich |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) | ThermoFisher Scientific | S21388 | premium grade |
| Tube Revolver/ Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| TWEEN 20 | MilliporeSigma | P9416 | Sigma-Aldrich |
| xMAP Antibody Couplng Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | |
| xMAP INTELLIFLEX DR-SE | Luminex Corporation | INTELLIFLEX-DRSE-RUO |
References
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