Summary
Система анализа потока для мультиплексированных анализов на основе шариков, которая обеспечивает показания с двумя репортерами, была использована для разработки мультиплексных серологических анализов и анализов нейтрализации антител, которые могут одновременно измерять нейтрализующие антитела IgG и IgM для SARS-CoV-2.
Abstract
Пандемия COVID-19 подчеркнула необходимость быстрых высокопроизводительных методов для чувствительного и специфического серологического выявления инфекции новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Мультиплексное серологическое тестирование может быть особенно полезным, поскольку оно может одновременно анализировать антитела к нескольким антигенам, что оптимизирует охват патогенов и контролирует изменчивость в организме и индивидуальную реакцию хозяина. Здесь мы описываем sars-CoV-2 IgG 3-плекс флуоресцентной микросферы, который может обнаруживать как антитела IgM, так и IgG к трем основным антигенам SARS-CoV-2 - спайковой (S) белку, спайк-ангиотензинпревращающему ферменту-2 (ACE2), рецептор-связывающему домену (RBD) и нуклеокапсиду (Nc). Было показано, что анализ имеет сопоставимую производительность с эталонным анализом SARS-CoV-2 для IgG в сыворотке, полученной через ≥21 день с момента появления симптомов, но имел более высокую чувствительность с образцами, собранными через ≤5 дней от начала симптомов. Кроме того, используя растворимый ACE2 в формате нейтрализационного анализа, было продемонстрировано ингибирование связывания антител для S и RBD.
Introduction
Пандемия COVID-19 подчеркнула важность возможности быстрой разработки и внедрения быстрых, высокопроизводительных, высокоэффективных серологических тестов, которые могут быть использованы для диагностики и эпиднадзора за новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Мультиплексное серологическое тестирование может быть чрезвычайно полезным в условиях пандемии, поскольку оно может одновременно анализировать антитела к нескольким антигенам, что обеспечивает широкий охват патогенов и контроль за изменчивостью в организме и реакцией хозяина на инфекцию. Недавносообщалосьо разработке мультиплексного флуоресцентного бисероплетного анализа SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), который может обнаруживать антитела к спайково-белку (S), шипово-ангиотензинпревращающий фермент-2 (ACE2) рецептор-связывающий домен (RBD) и нуклеокапсид (Nc) SARS-CoV-2. Было показано, что 3Flex имеет сопоставимую производительность с эталонным анализом SARS-CoV-2 IgG для сыворотки, полученной через ≥21 день с момента появления симптомов, но имел более высокую чувствительность с образцами, собранными через ≤5 дней от начала симптомов. Кроме того, было продемонстрировано ингибирование связывания антител для антигенов S и RBD с использованием растворимого ACE2 в формате нейтрализационного анализа. Технология на основе мультиплексных шариков была широко принята в качестве проверенной технологии для мультиплексного серологического тестирования и имеет явные преимущества для крупномасштабного скрининга, включая короткое время до результатов, требования к небольшим образцам и сокращение трудозатрат2,3,4.
Недавно стал доступен новый прибор анализа потока, который обеспечивает ту же высокоплексную, высокопроизводительную способность системы, которая была продемонстрирована в предыдущей работе1,но с дополнительным преимуществом двух репортерных каналов. Возможность измерения двух флуоресцентных репортерных сигналов в одной реакции позволяет оценить два результата на анализируемый файл для каждого образца и идеально подходит для применения изотипирования, которое обычно должно выполняться в отдельных реакционных скважинах5. Возможность двойного репортера обеспечивает вдвое больше данных для каждого образца в вдвое меньшем количестве реакционных скважин с половиной требований к объему пробы и, таким образом, имеет явное преимущество перед системами с одним репортером. В этом исследовании подробно описывается стандартный протокол серологического анализа и описывается адаптация к анализу нейтрализации. Кроме того, в этом отчете описывается преобразование анализа одного репортера в серологический анализ с двойным репортером, а затем двойной анализ нейтрализации репортера для одновременного измерения нейтрализующих антител изотипов IgG и IgM против антигенов SARS-CoV-2 S, RBD и Nc. Визуальный обзор протокола анализа приведен на рисунке 1.
Protocol
Остаточные образцы сыворотки крови человека, ранее протестированные для диагностических анализов SARS-CoV-2, были использованы в этом исследовании, которое было одобрено Институциональным наблюдательным советом Университета Рочестера.
1. Реагенты и оборудование
- Получить антигены коронавируса и человеческие IgG и IgM из коммерческих источников.
- Получите наборы бусин (45 и 220) для контроля анализа (AC) у поставщика прибора. Набор из 45 мониторов средней интенсивности флуоресценции (MFI) на инструментах с одним репортером (RP1). Набор бусин переменного тока 220 мониторов коллекции МФО на втором репортером канале (RP2).
- Получить обнаружение антител и антиген-специфических сывороток кролика и антител, используемых для подтверждения связи.
- Выполняют обнаружение с помощью меченых биотином антител либо стрептавидином, R-фикоэритриновым конъюгатом (SAPE), либо стрептавидиновым конъюгатом флуорофора Super Bright 436 (SASB; возбуждение при 405 нанометрах (нм) и эмиссия при 436 нм).
- Получить человеческий белок ACE2 (т.е. рецептор SARS). Перед применением регидратируют лиофилизированный белок ACE2 путем растворения до концентрации 1 мг/мл в воде, не содержит нуклеазы (не обработанной DEPC, автоклавной и 0,2-мкм стерильной фильтрованной) и храните при 4 °C.
- Выполняйте все реакции в 96-скважинных необязывных поверхностных (NBS) черных плоскодонных пластинах. Запечатайте пластины алюминиевой уплотнительной лентой с микропластинкой 96 скважин для этапов инкубации анализа. Используйте магнитный пластинчатый сепаратор для этапов промывки анализа.
2. Подготовка контрольных шариков, связанных с антигенами и антителами
- Ковалентно соединяют магнитные, полистирольные и цветовые наборы микросфер (диаметр 6,5 мкм) с антигенами S, RBD и Nc, как описано в Cameron et al.1. Коронавирусные антигены соединяются при 10 пмоль/106 бусин (S) и 100 пмоль/106 бусин (RBD и Nc). Управляющие бусины в сочетании с человеческим IgG или IgM генерируются, как описаноранее 1. IgG и IgM соединены при 5 мкг/106 шариках.
- После соединения определяют концентрации шариков и разбавляют каждый бульон до 1 х 106 шариков/мл, используя описанные процедуры6.
- Выполните подтверждение связи антигена с антиген-специфическими антителами от кролика или с положительными человеческими сыворотами, как описано в Cameron et al.1.
- Подтвердите связь IgG человека с биотинилированными античеловеческими реагентами обнаружения IgG / SAPE в анализе и связь IgM с помеченным фикоэритрином (PE) козьим античеловеческим IgM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подтверждение связи выполняется с использованием титрования белково-специфической сыворотки или антитела, поскольку оптимальная концентрация для использования этих реагентов неизвестна. Для сыворотки используются последовательные разбавления, тогда как для антител, поставляемых в виде мг/мл, используются последовательные серии разбавления мкг/мл.
- Подтвердите связь IgG человека с биотинилированными античеловеческими реагентами обнаружения IgG / SAPE в анализе и связь IgM с помеченным фикоэритрином (PE) козьим античеловеческим IgM.
- Разбавляйте контрольные бусины (AC), которые контролируют сбор MFI в двух репортерных каналах до концентрации 1 x 106 бусин /мл перед использованием в мультиплексных бисероплетениях.
3. Приготовление смеси из свежих мультиплексных шариков
- Готовьте мультиплексные бусины свежими каждый день из отдельных бусин и контролируйте запасы бусин по 1 x 106 бусин / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мультиплексные бисенные смеси готовятся для доставки 2 500 бусин для каждой области бусины в объеме 50 мкл. Расчеты того, как приготовить мультиплексные бисероплетительные смеси для любого количества реакций, описаны в блоге, опубликованном Angeloni (2020)6.
4. Разбавление проб
- Приготовьте разведение образца сыворотки 1:100 путем смешивания 10 мкл сыворотки с 990 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), содержащего 0,05% Tween 20, 0,02% азида натрия и 1% бытового сывороточного альбумина (BSA) (буфер PBS-TBN).
- Разбавляют образцы снова в 10 раз, добавляя 20 мкл разбавления 1:100 к 180 мкл PBS-TBN.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы сыворотки состоят из отрицательных сывороток из образцов, собранных в 2019 году до пандемии COVID-19, и положительных сывороток от SARS-CoV-2 ПЦР-положительных пациентов, представляющих низкие и высокие титры антител. Положительные образцы были собраны в период от ≈3 до >60 дней с момента появления симптомов (DFSO). Все образцы сыворотки и IgG-очищенные отрицательные контрольные сыворотки разбавляют до 1:1000, как описано ниже. Для анализов нейтрализации сыворочные сыворочные сыворо разбавляют 1:500, как описано в протоколах нейтрализации ниже (разделы 6 и 8).
5. Протокол серологического анализа с одним репортером
- Добавьте 50 мкл мультиплексной бисероплетительной смеси к каждому выделенному колодец 96-скважинной несвязывающей микротитры.
- Пипетка 50 мкл сыворотки 1:1000 или PBS-TBN в соответствующие скважины; окончательное разведение сыворотки в скважине составляет 1:2000.
- Накройте пластину уплотнением из микропластиной фольги и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
- Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
- Промывайте реакционные колодцы, как описано ниже (первая промывка после инкубации пробы).
- Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
- Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
- Снимите пластину с шейкера пластин и поместите на магнит пластины на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
- Промывайте реакционные колодцы, как описано ниже (вторая инкубационная промывка после отбора проб).
- Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
- Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
- Снимите пластину с шейкера пластин и поместите на магнит пластины на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Снимите пластину с магнита.
- Внесите свежую смесь биотин-античеловеческого IgG с SAPE, разбавляя антитело до 0,62 мкг/мл и SAPE до 1 мкг/мл. Добавьте 100 мкл к каждой скважине.
- Накройте пластину уплотнением из микропластиной фольги и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
- Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
- Промывайте реакционные колодцы, как описано ниже (первая инкубационная промывка антител после обнаружения антител).
- Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
- Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
- Снимите пластину с шейкера пластин и поместите на магнит пластины на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
- Промывайте реакционные колодцы, как описано ниже (вторая инкубационная промывка антител после обнаружения).
- Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
- Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
- Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на сепаратор магнитной пластины на 2 минуты, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Снимите пластину с магнита.
- Добавьте 100 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
- Накройте фольгой и встряхните в течение 2 мин при 37 °C.
- Снимите пластину с шейкерной пластины. Затем снимите фольгированный уплотнение и считайте 50 мкл каждой скважины на анализаторе потока в соответствии с Руководством пользователя. Ниже приводится краткое описание.
- Выберите раскрывающееся меню в левом верхнем углу экрана и перейдите в раздел Конфигурация пластины.
- Выберите Выполнить пластину.
- Щелкните значок «Извлечь», чтобы извлечь держатель пластины.
- Загрузите пластину на держатель пластины и выберите значок Втянуть, чтобы втянуть держатель пластины.
- Щелкните значок Выполнить, чтобы запустить тарелку.
6. Протокол нейтрализации одного репортера
- Приготовьте свежую смесь из мультиплексных шариков, как описано в разделе 3 выше.
- Разбавляют больного и контролируют сывороточные 1:500 следующим образом.
- Разбавить сыворотку 1:100, смешав 10 мкл сыворотки с 990 мкл PBS-TBN.
- Разбавить сыворотку еще в 5 раз, добавив 40 мкл сыворотки 1:100 в 160 мкл PBS-TBN.
- Добавьте 50 мкл мультиплексной бисероплетительной смеси к каждому выделенному колодец 96-скважинной несвязывающей микротитры.
- Добавьте 25 мкл разбавления 2 мкг/мл ACE2 в каждую скважину.
- Накройте пластину уплотнением из микропластини и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 2 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
- Снимите пластину с шейкерной пластины и снимите уплотнение из фольги.
- Добавьте 25 мкл сыворотки 1:500 или PBS-TBN в назначенные скважины.
- Накройте пластину уплотнением из микропластиной фольги и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
- Для остальной части процедуры анализа выполните шаги 5.4-5.18.5, как описано выше.
7. Преобразование в двойной репортер IgG и IgM серологический анализ
- Приготовьте бусины, связанные с антигенами, как описано в разделе 2 выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный набор шариков в сочетании с человеческим IgM включен для мониторинга добавления реагентов обнаружения анти-IgM, а также дополнительный набор бусин переменного тока (220) для мониторинга сбора MFI для RP2. Все бусины имеют по 1 x 106 бусин /мл для включения в мультиплексные бисероплетение, как описано ниже. - Приготовьте свежие смеси из мультиплексного бисера, как описано в разделе 3 выше.
- Разбавляйте образцы сыворотки и IgG-очищенные отрицательные контрольные сыворотки 1:1000, как описано в разделе 4 выше.
- Добавьте 50 мкл мультиплексной бисероплетительной смеси к каждому выделенному колодец 96-скважинной несвязывающей микротитры.
- Пипетка 50 мкл сыворотки 1:1000 или PBS-TBN в соответствующие скважины. Окончательное разведение сыворотки в скважине составляет 1:2000.
- Накройте пластину уплотнением из микропластиной фольги и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
- Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
- Промывайте реакционные колодцы, как описано ниже (первая промывка после инкубации пробы).
- Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
- Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
- Снимите пластину с шейкера пластин и поместите на магнит пластины на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
- Снова промыть реакционные колодцы PBS-TBN (вторая инкубационная промывка после отбора проб), как описано выше на этапах 7.10.1-7.10.5.
- Снимите пластину с магнита.
- Сделайте свежую смесь реагентов Detection с необходимой комбинацией реагентов и добавьте 50 мкл или 100 мкл в каждую скважину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смеси реагентов обнаружения, содержащие античеловеческий IgG, сопряженный с репортерным красителем Brilliant Violet 421 (BV; возбуждение при 405 нм и излучение при 421 нм), использовали при 50 мкл/скважину из-за ограниченного количества имеющихся запасов реагентов. Все остальные смеси реагентов detection используются при 100 мкл/скважина. - Накройте пластину уплотнением из микропластиной фольги и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
- Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
- Промыть реакционные колодцы, как описано ниже, PBS-TBN (первая промывка после обнаружения инкубации антител).
- Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
- Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
- Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
- Снова промыть реакционные колодцы PBS-TBN (вторая промывка после инкубации антител), точно так же, как описано выше в шагах 7.17.1-7.17.5.
- Снимите пластину с магнита.
- Добавьте 100 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
- Накройте фольгой и встряхните в течение 2 мин при 37 °C.
- Снимите пластину с шейкерной пластины. Затем снимите уплотнение фольги и считывание 50 мкл каждой скважины на анализаторе потока, как описано выше на этапах 5.18.1-5.18-5.
8. Преобразование в двойной анализ нейтрализации репортеров
- Используйте связанные шарики, как описано в шаге 7.1 выше.
- Приготовьте свежую смесь из мультиплексных шариков, как описано в шаге 7.2.
- Образцы сыворотки и IgG-очищенные отрицательные контрольные сыворотки разбавляют 1:500 следующим образом.
- Приготовьте разведение 1:100, смешивая 10 мкл сыворотки с 990 мкл PBS-TBN.
- Разбавьте образцы 1:100 еще в 5 раз, добавив 40 мкл разведения 1:100 к 160 мкл PBS-TBN.
- Добавьте 50 мкл мультиплексной бисероплетительной смеси к каждому выделенному колодец 96-скважинной несвязывающей микротитры.
- Добавьте 25 мкл разбавления 2 мкг/мл ACE2 в каждую скважину.
- Накройте пластину уплотнением из микропластини и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 2 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
- Снимите пластину с шейкерной пластины и снимите уплотнение из фольги.
- Добавьте 25 мкл сыворотки 1:500 или PBS-TBN в назначенные скважины.
- Накройте пластину фольгированной пломбой и высиживайте на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
- Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удержив пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
- Промывайте реакционные колодцы, как описано ниже (первая промывка после инкубации образца).
- Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
- Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
- Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удержив пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
- Снова промыть реакционные колодцы PBS-TBN (вторая инкубационная промывка после отбора проб), как описано выше на этапах 8.13.1-8.13.5.
- Снимите пластину с магнита.
- Сделайте свежую смесь реагентов Detection с необходимой комбинацией реагентов и добавьте 50 мкл или 100 мкл в каждую скважину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смеси реагентов обнаружения, содержащие античеловеческий IgG, конъюгированный с репортерным красителем BV, использовались при 50 мкл/скважину из-за ограниченного количества имеющихся запасов реагентов (см. Таблицу материалов). Все остальные смеси реагентов detection используются при 100 мкл/скважина. - Накройте пластину уплотнением из микропластиной фольги и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
- Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удержив пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
- Промыть реакционные колодцы, как описано ниже (сначала было обнаружено после обнаружения инкубации антител).
- Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
- Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
- Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удержив пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
- Снова промыть реакционные колодцы PBS-TBN (вторая промывка после инкубации антител обнаружения), точно так же, как описано выше на этапах 8.21.1-8.21.5.
- Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
- Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
- Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на сепаратор магнитной пластины на 2 минуты, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
- Удержив пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
- Снимите пластину с магнита.
- Добавьте 100 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
- Накройте фольгой и встряхните в течение 2 мин при 37 °C.
- Снимите пластину с шейкерной пластины. Затем снимите уплотнение фольги и считывание 50 мкл каждой скважины на анализаторе потока, как описано выше на этапах 5.18.1-5.18-5.
Representative Results
Оптимизация серологического анализа одного репортера.
Стратегия соединения для всех антигенов SARS-CoV-2 описана в Cameron, et al., 20201 и в шаге 2.1 выше. Стратегия подтверждения соединения описана на этапе 2.3 выше. Для эффективной связи значения средней интенсивности флуоресценции (МФО) должны быть значительно выше, чем реакция (реакции) отрицательного контроля без сыворотки/без антител, и должны демонстрировать дозовый ответ на снижение сигнала МФО с уменьшением количества реагента обнаружения. МФО приблизительно 1000 единиц МФО или более по сравнению с фоновой МФО обычно указывают на эффективную связь с белками и зависят от концентрации и специфичности используемого реагента обнаружения. Используя этот метод, подтверждение связи антигенов S, RBD и Nc было протестировано для двух партий бусин(рисунок 2). Сигналы МФО для всех антигенов были значительно выше фоновой МФО и показывали дозовый ответ с титрованием реагентов обнаружения. Данные также показали хорошую воспроизводимость уровней МФО между двумя различными партиями связанных бусин.
Оптимизация анализа одного репортера была выполнена, как описано в Cameron, et al., 20201. Каждый антиген тестировали в различных концентрациях связи с различными разведениями нескольких образцов сыворотки, представляющих высокие, средние, низкие и отрицательные образцы. Кроме того, поскольку анализ измеряет титры IgG, в качестве дополнительного отрицательного образца была использована сыворотка, удаленная IgG. Результаты репрезентативного ряда разбавления образца с различными уровнями связи антигенов показаны на рисунке 3. Эта начальная серия разбавления была протестирована с фиксированной концентрацией реагентов обнаружения для получения потенциального диапазона репрезентативных антиген-специфических и фоновых уровней МФО. На 000 данных были определены дополнительные диапазоны разбавления проб и уровни связи антигенов, которые были дополнительно протестированы с дополнительными образцами (данные не показаны).
Затем концентрацию детектируемого реагента оптимизировали для использования с различными сывороточными разведениями и уровнями связи антигенов. Репрезентативные данные с использованием 6 положительных и 2 отрицательных образцов показаны на рисунке 4. После дополнительного тестирования с несколькими сотнями отрицательных образцов сыворотки до COVID-19 для окончательного протокола анализа были выбраны окончательные оптимальные уровни связи антигенов и концентрации регентов обнаружения, как описано в разделе 5.
Преобразование в один анализ нейтрализации репортера
Преобразование однопортрового серологического анализа в нейтрализующий анализ достигалось путем добавления инкубационного этапа с использованием ACE2 (в качестве конкурирующего реагента) с шариками перед добавлением образца сыворотки. При титровании количества добавленного ACE2 наблюдалось ингибирование связывания IgG с антигенами S и RBD, как показано на рисунке 5. В то время как сывороподражения 11 пациентов имели разные титры IgG, каждый из них показал значительное снижение сигнала MFI с увеличением концентрации ACE2. Как и ожидалось, ACE2 влияет только на сигналы MFI S и RBD, но не на антиген Nc.
Процент остаточного сигнала МФО относительно 0 мкг/мл ACE2 для всех образцов показан на рисунке 6. Для большинства образцов потеря сигнала >30% наблюдалась для S и RBD с увеличением концентрации ACE2. Как и ожидалось, влияние ACE2 на сигнал Nc не произошло.
Преобразование в двойной репортерный серологический анализ IgG и IgM
Для анализа двойного репортера IgG и IgM стандартные условия анализа одного репортера использовались для тестирования различных комбинаций антител и репортеров для двух репортерских каналов. Канал RP1 аналогичен предыдущим приборам анализа потока с обнаружением «оранжевой» флуоресценции для репортерных красителей, таких как PE. Второй канал, RP2, использует фиолетовый лазер возбуждения, который может быть использован для обнаружения «синей» флуоресценции красителей, возбужденных при 402 нм с пиками спектров излучения в диапазоне 421-441 нм.
Несколько различных комбинаций античеловеческих антител IgG и IgM были протестированы в различных концентрациях со стандартными 2000-кратными условиями разбавления и инкубации образцов, подробно описанными в разделе 6. Первоначальное испытание анти-IgM, сопряженного с репортерным красителем DyLight 405 (DL 405; возбуждение при 400 нм и излучение при 420 нм) для канала RP2, проводилось с использованием набора из 11 ПЦР-положительных образцов с DFSO в диапазоне от 5 до >60 дней и образца сыворотки, снятой IgG. Этот реагент обнаружения не производил высокий сигнал в канале RP2, как показано на рисунке 7A,B, C. Для образцов с высоким IgM RP2 MFI самые высокие сигналы были замечены для RBD и Nc(рисунок 7B,C). Хотя титры IgM должны быть повышены в это время в некоторых образцах, наблюдаемые уровни MFI не превышали 140 единиц MFI с реагентом обнаружения IgM. Кроме того, контрольная шарика для IgM не имели значительного динамического диапазона для MFI при использовании DL 405, сопряженного с анти-IgM, по сравнению с полиэтиленовым анти-IgM RP1 репортером, используемым при тех же концентрациях(рисунок 7D).
Поскольку подходящий реагент обнаружения RP2 с репортерной маркировкой для IgM был недоступен, оригинальный биотин анти-IgG с SASB был протестирован для использования в канале RP2. Сигнал для IgG в канале RP2 с SASB не имел того же динамического диапазона, что и у SAPE, но он все же имел подходящий диапазон для измерения титров IgG для S, RBD и Nc(рисунок 8). Эти данные привели к тестированию различных комбинаций реагентов для детектирования RP1 IgM и RP2 IgG, как описано ниже.
Преобразование в двойной анализ нейтрализации репортеров
Серологический анализ с двойным репортером преобразовывали в анализ нейтрализации путем добавления инкубационного этапа с ACE2 и бусинами перед добавлением образца сыворотки. Использовали 2-кратную серию разбавления ACE2, начиная с 16 мкг/мл, а затем тестировали с наборами из 11 образцов и очищенными сыворочками, как описано выше. Кроме того, 3 различные комбинации смесей антител для обнаружения RP1 IgM и RP2 IgG были протестированы на наборе из 11 образцов и очищенных контрольных сывороточной сыворотки. Окончательные комбинации и концентрации реагентов, определенные как оптимальные, подробно описаны в таблице 1.
Для обнаружения IgG биотин против человека IgG / SASB, используемый в оригинальном анализе одного репортера, был протестирован вместе с другим анти-IgG, конъюгированным с репортерным красителем BV. В то время как конъюгат BV имел высокие сигналы RP2 MFI, интенсивность сигнала MFI для титра IgG варьировалась в зависимости от титрования ACE2(рисунок 9A,C, E). Комбинация биотина против человека IgG/ SASB имела более последовательное снижение сигнала MFI во время титрования ACE2 по сравнению с конъюгатом BV, демонстрируя реакцию дозы, хотя уровни MFI были ниже. Флуктуация сигнала конъюгатом BV в концентрациях ACE2 также мешала определению процента ингибирования ACE2 в диапазоне титров IgG по сравнению с комбинацией биотина против человека IgG/SASB(рисунок 9B,D, F). Образцы с низким уровнем сигналов MFI, такие как образец DFSO 3, не имеют достаточно высоких титров для оценки эффективности этих реагентов или измерения нейтрализующей способности IgG.
Для определения титров IgM в канале RP1 PE-конъюгированный анти-IgM сравнивали с античеловеческим IgM, сопряженным с репортерным красителем DyLight 549 (DL 549; возбуждение при 562 нм и излучение при 576 нм) при концентрациях, перечисленных в таблице 1. Из этих двух реагентов PE anti-IgM показал более высокие MFIs, чем те, которые генерируются DL 549 античеловеческим IgM для тестируемых образцов(рисунок 9A,C, E). Контрольный шарик IgM, измеряющий добавление этих реагентов, имел различные средние МФО в размере ≈17 000 для PE anti-IgM и 2 723 для сопряжения DL 549. Даже с этими различиями влияние различных концентраций ACE2 на МФО можно было измерить с помощью сопряженного DL 549. Для определения ACE2-процентного ингибирования связывания IgM наблюдалась небольшая, но незначительная разница между двумя реагентами обнаружения IgM(рисунок 9B,D, F).
| Сочетание | Докладчик | Конечная концентрация в скважине (мкг/мл) | |
| РП1 | РП2 | ||
| 1 | ПЭ анти-IgM | 2 | - |
| Биотин-Иг | - | 0.62 | |
| САСБ | - | 4 | |
| 2 | DyLight 549 Античеловеческий IgM | 1 | - |
| Бриллиант Фиолетовый 421 Античеловеческий IgG | - | 1 | |
| 3 | DyLight 549 Античеловеческий IgM | 1 | - |
| Биотин-Иг | - | 0.62 | |
| САСБ | - | 4 | |
Таблица 1: Список протестированных комбинаций репортерных красителей RP1 и RP2. Несколько различных репортерных красителей RP1 и RP2 были оценены для измерения титров IgG и IgM. Три комбинации, показанные выше, были протестированы в различных режимах обнаружения RP1 и для оптимизации анализа нейтрализации. Для комбинаций RP2 с использованием SASB показаны концентрации для биотинилированного антитела обнаружения и SASB. *Конечная концентрация представляет собой конечную концентрацию в реакционной скважине.
Рисунок 1:Блок-схема, выделяющая основные этапы протокола анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Подтверждение связи антигенов. Антигены соединяли при 100, 10 и 1 пмоль/106 шариках. Для антигенов S и RBD использовались анти-S сыворотки кролика, которые были обнаружены с помощью PE anti-rabbit IgG. Для Nc был использован белок G-очищенный кролик поликлональный анти-Nc. Показаны кривые титрования для шариков в сочетании с 10 пмоль S(A),100 пмоль RBD(B)и 100 пмоль Nc(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Оптимизация разведения сыворотки с различными уровнями связи антигенов. Образцы сыворотки, представляющие собой высокие, средние, низкие и отрицательные образцы, были протестированы с различным антигеном pmol /10 6 шариковых связок. 4-кратное титрование сыворотки было протестировано с мультиплексной смесью бусин, связанных с антигеном, с использованием протокола анализа, описанного в разделе 5. Показаны значения MFI кривых титрования для S(A),RBD(B)и Nc(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Определение оптимального разведения сыворотки и обнаружение концентрации реагента. Восемь образцов сыворотки, включая отрицательных пациентов (2 образца) и низко- и высоко-положительных (6 образцов), были протестированы в дополнительных разведениях сыворотки с тремя различными концентрациями реагентов обнаружения. Результаты MFI показаны для S(A),RBD(B)и Nc(C). На основе этих и других данных (не показаны) был выбран образец разведения 1:2000 и концентрация антител для обнаружения биотина 0,62 мкг/мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Оптимизация анализа нейтрализации одного репортера. Модификацию одиночного репортерного серологического анализа на нейтрализующий анализ обнаружения антител проводили путем добавления инкубационного этапа с ACE2 в качестве конкурента, как описано в разделе 6. Набор из 11 образцов, начиная от низко- до высокоположительных титрных сывороток, и образец сыворотки IgG-полосатый тестировали с двукратной серией разбавления ACE2, начиная с 4 мкг/мл, с использованием стандартных условий анализа. В этом диапазоне концентраций ACE2 снижение MFI можно увидеть при увеличении ACE2 для S(A)и RBD(B),но не для Nc(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Процентное ингибирование сигнала с ПОМОЩЬЮ ACE2. Показан процент остаточных сигналов для набора из 11 выборок (из рисунка 4). Для каждого образца, независимо от его титра IgG, было достигнуто максимальное снижение сигнала МФО ≥30% для S(A)и RBD(B)при самой высокой концентрации ACE2. Для Nc-антигена(C)не наблюдалось значимого ингибирования сигнала с любым количеством испытуемого ACE2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Испытание DyLight 405 против IgM в качестве реагента обнаружения RP2 IgM. Набор из 11 образцов и IgG-очищенные сыворотки были использованы для тестирования DL 405-конъюгированного анти-IgM в качестве реагента обнаружения RP2. Показаны сигналы RP2 IgM MFI для S(A),RBD(B)и Nc(C). Самый высокий сигнал MFI для любого антигена с любым образцом составил примерно 140 единиц MFI для RBD с образцом H(B). Даже сигнал на контрольном наборе бусин IgM составлял менее 1000 MFI в канале RP2 во всем диапазоне титров антител и не показывал увеличенного динамического диапазона, наблюдаемого с антителом обнаружения PE анти-IgM в канале RP1(D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8:Оптимизация SASB в качестве репортера RP2 с Биотином анти-IgG. Набор из 11 образцов и IgG-очищенные сыворотки были использованы для тестирования серии разбавления SASB со стандартным 0,62 мкг/мл биотина анти-IgG. Показаны результирующие МФО IgG в канале RP2 для S(A),RBD(B)и Nc(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9:Сравнение трех различных комбинаций RP1 IgM и RP1 IgG смесей детектирования. Три различные смеси антител для обнаружения были протестированы на 11 образцах и IgG, очищенных от сывороток. Используемые комбинации и конечные концентрации описаны в таблице 1. Все образцы были протестированы с 2-кратным разбавлениями ACE2, начиная с 16 мкг/мл. Показаны данные для образцов в DFSO за 3, 12 и 30 дней. Сигналы MFI для RP1 IgM (оранжевый) и RP2 IgG (синий) показаны в A (DFSO 3), C (DFSO 12) и E (DFSO 30). Остаточные МФУ ACE2% показаны в B (DFSO 3), D (DFSO 12) и F (DFSO 30). Сигналы, представляющие снижение >30% по сравнению с элементами управления Без ACE2, подсвечиваются светло-зеленым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Это исследование расширило функциональность мультиплексного флуоресцентного микросферного анализа 3Flex, который качественно оценивает реакцию IgG на инфекцию SARS-CoV-21. В то время как многие серологические анализы на COVID-19 обнаруживают один антиген, этот анализ одновременно оценивает антигены S, RBD и Nc и включает внутренний контроль изотипа антител7. Кроме того, ACE2 используется в качестве индикатора для выявления нейтрализующих титров антител к SARS-CoV-2.
Анализы на несколько антигенов могут быть особенно полезны в будущем для распознавания иммунных реакций между инфицированными и вакцинированными людьми. При SARS-CoV-2, если оценивать только антитела S и RBD, было бы невозможно определить, было ли это связано с прошлой инфекцией или с ответом антител к вакцинации. Ни одна из используемых в настоящее время вакцин не нацелена на антиген Nc, поэтому, оценивая антигены S/RBD и Nc, можно отличить прошлую вирусную инфекцию (Nc- и S/RBD-положительную) от ответа на вакцинацию (только S/RBD-положительный; Nc-отрицательный).
В текущем исследовании серологические и нейтрализуемые анализы 3Flex (разделы 5 и 6) были перенесены на новый прибор анализа двойного репортерного потока (разделы 7 и 8). Типичные протоколы иммуноанализа для мультиплексных анализов на основе шариков аналогичны стандартным протоколам ИФА, следуя сопоставимым этапам инкубации образцов, инкубации антител / репортера и анализа результатов8. Предыдущие исследования также продемонстрировали, как стандартные анализы ИФА могут быть перенесены на платформу мультиплексирования на основе бисера9.
Протоколы анализа могут быть легко перенесены с предшествующие однопортажуные приборы на новую систему двойного репортера, о чем свидетельствуют результаты, полученные для тестовых образцов и элементов управления(рисунок 4 и рисунок 5). В серологическом анализе все положительные образцы сыворотки показали характерное дозочувствительное снижение сигнала, соответствующее как более высокому разбавлению образца, так и более низкой концентрации антител для обнаружения, тогда как сигналы для отрицательных образцов оставались на фоновых уровнях. Аналогичным образом, для анализа нейтрализации снижение сигналов для S и RBD, но не для Nc, соответствовало увеличению концентраций конкурента ACE2, тогда как очищенная сыворотка IgG была гораздо менее затронута добавлением ACE2. Предварительная инкубационная обработка шариков с ACE2 в течение 2 мин до добавления образца сыворотки (как описано в разделах 6 и 8) также сравнивалась с объединением шариков с ACE2 и сывороткой одновременно и производила небольшую разницу в результатах (данные не показаны). Однако, поскольку результаты, полученные с помощью шариков плюс прединкрубационная ступень ACE2, были более последовательными, это была окончательная процедура, принятая для протокола нейтрализации анализа (разделы 6 и 8).
Поскольку двойная репортерная система включает в себя второй флуоресцентный репортерный канал, оба анализа были преобразованы в изотипирование для одновременного измерения ответов IgG и IgM. Функция двойного репортера анализатора потока позволяет получать флуоресцентные сигналы от двух реагентов обнаружения репортеров для каждого анализируемого вещества в мультиплексе для каждого образца, эффективно удваивая данные, генерируемые на образец в анализе. Для разработки и оптимизации протоколов двойного репортерного анализа было оценено несколько коммерчески доступных репортерных красителей и антител обнаружения для нового канала RP2(рисунок 7 и рисунок 8)для определения наилучшего доступного варианта (вариантов). Анти-IgM антитело, конъюгированное с репортерным красителем DL 405, не работало хорошо в канале RP2(рисунок 7),поэтому биотин анти-IgG с SASB впоследствии оценивали для обнаружения в канале RP2(рисунок 8). Три комбинации реагентов для детектирования RP1 и RP2 сравнивали в двойном анализе нейтрализации репортеров(таблица 1 и рисунок 9)для определения наиболее эффективных комбинаций для одновременного обнаружения нейтрализующих антител IgG и IgM. Хотя существовали значительные различия в интенсивности сигнала между каналом RP1 с использованием PE-anti IgM и каналом RP2 с использованием DL 549 anti-IgM, не было существенной разницы в измерении процентного ингибирования связывания ACE2.
Признается ряд ограничений нынешнего метода и этого исследования. Во-первых, образцы, протестированные и использованные при разработке и оптимизации метода, были ограничены наборами из 8-11 образцов. Больше образцов будет протестировано в расширенных исследованиях, чтобы убедиться, что метод полностью оптимизирован. Во-вторых, было протестировано ограниченное количество репортерских флуорофоров и репортерских пар. Дальнейшее тестирование всех доступных репортеров во всех возможных комбинациях позволит определить, какие реагенты могут быть успешно использованы в этом методе. Анти-IgG антитело, конъюгированное с биотином, отличалось от анти-IgG-антитела, конъюгированного с репортером BV 421. Таким образом, хотя изменчивость интенсивности сигнала для BV 421 anti-IgG существовала, она могла быть обусловлена специфичностью антитела и не связана с репортерным красителем. Тестирование других доступных BV 421-конъюгированных антител может идентифицировать другое антитело, которое будет хорошо работать в канале RP2. Будущие исследования также будут оценивать комбинацию ПЭ анти-IgM с BV 421 античеловеческим IgG для обнаружения в RP1 и RP2 соответственно. Наконец, даже при двойной репортерной способности прибора анализы ограничены двумя изотипами (двумя параметрами) на реакцию. Если необходимо измерить дополнительные изотипы или желательно полное изотипирование, то дополнительные реакции с использованием тех же двух репортерных каналов должны быть запущены в отдельных скважинах.
Технология мультиплексирования на основе бисера позволяет быстро и гибко проектировать анализ с простым внедрением в рутинные лабораторные рабочие процессы3,4,10. Это исследование продемонстрировало легкость переноса ранее описанных серологических и нейтрализующих анализов 3Flex для SARS-CoV-2 на систему анализа потока для измерения IgG с помощью одного репортера или с небольшой модификацией, одновременно измеряя ответы IgG и IgM с использованием двух репортеров. Опция двойного репортера имеет явные преимущества перед платформами с одним репортером, поскольку она может предоставлять в два раза больше данных на образец, используя половину объема образца и половину количества реакционных скважин. С соответствующими репортерными красителями и антителами обнаружения анализы изотипирования могут быть легко разработаны и выполнены на приборе анализа двойного репортерного потока.
Disclosures
Стивен Анджелони и Шерри Данбар являются сотрудниками корпорации Luminex, которая производит некоторые из реагентов и инструментов, которые использовались в этом исследовании. Публикация этой статьи в открытом доступе была спонсирована корпорацией Luminex
Acknowledgments
Этот отчет был профинансирован корпорацией Luminex (Остин, техас). Авторы благодарят Мэтью Сильвермана PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) за помощь в научном редактировании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACE2 (human) (rec.) | AdipoGen Life Sciences | AG-40B-0192-3050 | |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-065-098 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A7888 | Sigma-Aldrich |
| Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator | Various | ||
| Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 709-675-149 | |
| Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3650 | |
| Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile | Corning | 6570 | |
| DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-475-043 | |
| DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-506-129 | Discontinued but available from multiple vendors |
| eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate | ThermoFisher Scientific | 62-4317-82 | |
| Fisherbrand Incubating Microplate Shaker | ThermoFisher Scientific | 02-217-757 | Fisher Scientific |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE | ThermoFisher Scientific | P-2771MP | |
| Luminex Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | |
| MagPlex beads | Luminex Corporation | MC100XX-ID | |
| PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-116-129 | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | P3813 | Sigma-Aldrich |
| SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56683 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56049 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified |
| SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56047 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56048 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb | SinoBiological | 40150-R007 | |
| Sodium Azide | MilliporeSigma | S2002 | Sigma-Aldrich |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) | ThermoFisher Scientific | S21388 | premium grade |
| Tube Revolver/ Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| TWEEN 20 | MilliporeSigma | P9416 | Sigma-Aldrich |
| xMAP Antibody Couplng Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | |
| xMAP INTELLIFLEX DR-SE | Luminex Corporation | INTELLIFLEX-DRSE-RUO |
References
- Cameron, A., et al. A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).
- Waterboer, T., et al. Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins. Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).
- Pickering, J. W., et al. A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides. American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).
- Ayouba, A., et al. Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).
- Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/ (2020).
- EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
- Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf (2021).
- Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).
