Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

سهلة الاستخدام، عالية الإنتاجية، والآلية بالكامل برنامج الحصول على البيانات للجسيمات واحد Cryo-الإلكترون المجهر

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62832
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

Summary

يتطلب المجهر أحادي الجسيمات cryo-electron حزمة برامج مناسبة وخطوط أنابيب سهلة الاستخدام للحصول على البيانات التلقائية عالية الإنتاجية. هنا، نقدم تطبيق حزمة برامج اقتناء الصور المؤتمتة بالكامل، Latitude-S، وخط أنابيب عملي لجمع البيانات من الجزيئات الحيوية المهتزة في ظل ظروف جرعة منخفضة.

Abstract

في السنوات القليلة الماضية، مهدت التطورات التكنولوجية والمنهجية في المجهر أحادي الجسيمات للإلكترونات المبردة (cryo-EM) طريقا جديدا لتحديد البنية عالية الدقة للجزيئات الكبيرة البيولوجية. على الرغم من التقدم الملحوظ في cryo-EM ، لا يزال هناك مجال للتحسين في جوانب مختلفة من سير عمل تحليل الجسيمات الواحدة. يتطلب تحليل الجسيمات المفردة حزمة برامج مناسبة للحصول التلقائي على البيانات عالية الإنتاجية. تم تطوير العديد من حزم برامج الحصول التلقائي على البيانات للتصوير التلقائي للجسيمات المفردة cryo-EM في السنوات الثماني الماضية. تقدم هذه الورقة تطبيقا لخط أنابيب مؤتمت بالكامل للحصول على صورة للجزيئات الحيوية المهتزة في ظروف الجرعة المنخفضة.

وهو يوضح حزمة من البرامج ، والتي يمكن جمع البيانات cryo - EM تماما ، تلقائيا ، وعلى وجه التحديد. بالإضافة إلى ذلك، يتم التحكم بسهولة المعلمات المجهرية المختلفة من قبل هذه الحزمة من البرامج. يوضح هذا البروتوكول إمكانات حزمة البرامج هذه في التصوير الآلي للبروتين عالي الارتفاع 2 (SARS-CoV-2) من متلازمة الالتهاب الرئوي الحاد الحاد (SARS-CoV-2) مع مجهر إلكتروني كريو 200 كيلو فولت مجهز بكاشف إلكترون مباشر (DED). تم الحصول على حوالي 3000 صورة فيلم cryo-EM في جلسة واحدة (48 ساعة) من جمع البيانات ، مما أسفر عن بنية تحليل ذري للبروتين المرتفع من السارس-CoV-2. وعلاوة على ذلك، تشير هذه الدراسة الهيكلية إلى أن البروتين ارتفاع يعتمد اثنين من الامتثالات الرئيسية، 1-RBD (مجال ملزم المستقبلات) مفتوحة وجميع RBD أسفل الامتثال مغلقة.

Introduction

أصبح cryo-EM أحادي الجسيمات تقنية بيولوجية هيكلية سائدة لتحديد البنية عالية الدقة للجزيئات الجزيئية البيولوجية1. تعتمد إعادة بناء الجسيمات المفردة على الحصول على عدد كبير من الصور الدقيقة للعينات المهتزة لاستخراج صور الجسيمات ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) ، والتي تستخدم بعد ذلك لإعادة بناء بنية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للجزيئات الجزيئية البيولوجية2،3. قبل تطوير DEDs، تراوحت الدقة التي تم تحقيقها من إعادة بناء جسيم واحد بين 4 و 30 Å4،5. في الآونة الأخيرة ، وصلت الدقة القابلة للتحقيق من cryo-EM أحادية الجسيمات إلى ما بعد 1.8 Å6. وكانت DED وبرامج الحصول الآلي على البيانات من المساهمين الرئيسيين في ثورة القرار هذه7 ، حيث التدخل البشري لجمع البيانات هو الحد الأدنى. عموما، يتم إجراء التصوير بالتبريد م بمعدلات جرعة الإلكترون منخفضة (20-100 e/Å2) لتقليل الأضرار الإشعاعية الناجمة عن شعاع الإلكترون من العينات البيولوجية، مما يساهم في انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) في الصورة. ويعوق هذا ال SNR المنخفض توصيف الهياكل عالية الاستبانة للجزيئات الجزيئية البيولوجية باستخدام تحليل جسيم واحد.

الجيل الجديد من أجهزة الكشف عن الإلكترونات هي أجهزة الكشف عن CMOS (التكميلية لأكسيد المعادن أشباه الموصلات) ، والتي يمكن التغلب على هذه العقبات المنخفضة المتعلقة SNR. تسمح كاميرات CMOS للكشف المباشر هذه بقراءة سريعة للإشارة ، والتي تساهم الكاميرا بسببها في وظيفة انتشار أفضل للنقاط ، وSNR مناسبة ، وكفاءة كمية ممتازة للمحققين (DQE) للجزيئات الكبيرة البيولوجية. توفر كاميرات الكشف المباشر SNR8 عالية وضوضاء منخفضة في الصور المسجلة ، مما يؤدي إلى زيادة كمية في كفاءة الكم المخبر (DQE) - وهو مقياس لمقدار الضوضاء التي يضيفها الكاشف إلى الصورة. هذه الكاميرات أيضا تسجيل الأفلام بسرعة مئات الإطارات في الثانية الواحدة، والتي تمكن من الحصول على البيانات بسرعة9،10. كل هذه الخصائص تجعل كاميرات الكشف المباشر السريع مناسبة لتطبيقات الجرعة المنخفضة.

تستخدم صور المكدس المصححة بالحركة لمعالجة البيانات لحساب التصنيف ثنائي الأبعاد وإعادة بناء خريطة كثافة ثلاثية الأبعاد للجزيئات الكبيرة باستخدام حزم برامج مختلفة مثل RELION11 وFREALIGN12 و cryoSPARC13 و cisTEM14 و EMAN215. ومع ذلك، بالنسبة لتحليل الجسيمات المفردة، هناك حاجة إلى مجموعة بيانات هائلة لتحقيق بنية عالية الدقة. ولذلك، فإن رسوم اكتساب البيانات التلقائية ضرورية للغاية لجمع البيانات. لتسجيل مجموعات بيانات cryo-EM كبيرة، تم استخدام العديد من حزم البرامج على مدى العقد الماضي. تم تطوير حزم برامج مخصصة، مثل AutoEM16 و AutoEMation17 و Leginon18 و SerialEM19 و UCSF-Image420 و TOM221 و SAM22 و JAMES23 و JADAS24 و EM-TOOLS و EPU، للحصول الآلي على البيانات.

تستخدم حزم البرامج هذه المهام الروتينية للعثور على مواقع الثقب تلقائيا من خلال ربط صور التكبير المنخفض بصور التكبير العالي ، مما يساعد في تحديد الثقوب ذات الجليد الزجاجي من سمك الجليد التكبيري للحصول على الصورة في ظل ظروف الجرعة المنخفضة. وقد خفضت هذه الحزم من البرامج عدد المهام المتكررة وزادت من الإنتاجية لجمع البيانات cryo-EM من خلال الحصول على كمية كبيرة من البيانات ذات نوعية جيدة لعدة أيام بشكل مستمر، دون أي انقطاع ووجود مادي للمشغل. Latitude-S هي حزمة برامج مماثلة، والتي تستخدم للحصول التلقائي على البيانات لتحليل الجسيمات المفردة. ومع ذلك ، فإن حزمة البرامج هذه مناسبة فقط لأجهزة الإزالة ال دي دي K2/K3 ويتم تزويدها بهذه الكاشفات.

يوضح هذا البروتوكول إمكانات Latitude-S في الحصول الآلي على صورة بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 مع كاشف إلكترون مباشر مجهز ب 200 كيلو فولت كريو-م (انظر جدول المواد). باستخدام هذه الأداة لجمع البيانات ، يتم الحصول تلقائيا على 3000 ملف فيلم من بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 ، ويتم إجراء المزيد من معالجة البيانات للحصول على بنية بروتين ارتفاع 3.9-4.4 Å.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: هناك حاجة إلى ثلاث خطوات مهمة لجمع البيانات cryo-EM: 1. إعداد شبكة cryo-EM، 2. معايرة ومحاذاة المجهر، 3. جمع البيانات التلقائي (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، يتم تقسيم جمع البيانات الآلي إلى أ. اختيار منطقة مناسبة، ب. التحسين من Latitude-S، ج. بدء اختيار ثقب التلقائي، و د. بدء الحصول التلقائي على البيانات (الشكل 1).

1. إعداد شبكة Cryo-EM وتحميل العينة للحصول التلقائي على البيانات

  1. تنظيف الشبكات باستخدام تفريغ توهج وتختلف المعلمات توهج التفريغ على أساس المتطلبات التجريبية (هنا، 60 ق في 20 م.
  2. أضف عينة بروتين طازجة (3 ميكرولتر) إلى الشبكة التي تم تفريغها بالتوهج واحتضنها لمدة 10 ق.
  3. لطخة الشبكات لمدة 3-5 ق في الرطوبة 100٪ ويغرق بسرعة لهم في الإيثان السائل باستخدام المكبس المبرد.
  4. قم بتثبيت الشبكات يدويا في حلقة مشبك لتشكيل الخرطوشة باستخدام حلقة C-clip مرنة.
  5. قم بتحميل الشبكات المجمدة المثبتة على الخرطوشة في كاسيت التحميل التلقائي ونقل الكاسيت بواسطة غطاء النانو إلى محمل تلقائي مسبق التبريد للمجهر لجمع البيانات.

2. ضبط المجهر والمحاذاة الأساسية قبل الحصول التلقائي على البيانات

  1. تحول شعاع
    1. انقر على Beam shift من علامة التبويب المحاذاة المباشرة .
    2. تقليل التكبير، ومركز شعاع إلى المحور البصري باستخدام متعدد الوظائف X و مقبض Y .
  2. محاذاة النقطة المحورية
    1. انقر على خيار إمالة الحزمة في المحاذاة المباشرة pp X من علامة التبويب المحاذاة المباشرة .
    2. تكثيف شعاع إلى بقعة وتقليل الحركة باستخدام مقبض X و Y متعدد الوظائف .
  3. توسيط فتحة C2
    1. حدد فتحة المكثف من علامة التبويب المحاذاة .
    2. تكثيف شعاع إلى بقعة، مركز شعاع إلى المحور البصري، ومن ثم توسيع شعاع لتغطية الدائرة بالتساوي.
    3. كرر هذه الخطوات حتى يتم ضبط فتحة المكثف 2.
  4. محاذاة خالية من الغيبوبة
    1. انقر على المحاذاة X الخالية من الغيبوبة من علامة التبويب المحاذاة المباشرة لمحاذاة الحزمة إلى المحور البصري.
    2. استخدام مقبض متعدد الوظائف لتقليل شكل وحركة FFT (تأكد من أنها مستقرة).
    3. كرر نفس الإجراء ل Coma - محاذاة حرة Y.
  5. تعيين الإضاءة الموازية قبل جمع البيانات في CRYO-EM بسبب عدسة التوأم C.
    1. أدخل الفتحة الهدف (70 ميكرومتر) في وضع الحيود.
    2. ركز الفتحة الموضوعية على المستوى البؤري الأمامي للعدسة الحيود من خلال التحكم في مقبض التركيز البؤري (العدسة الموضوعية وتيار عدسة C2).
    3. تأكد من أن ينظر إلى حافة هش من الفتحة الهدف بعد defocusing السليم.
    4. أدخل سدادة الشعاع ووزع الكثافة حتى يتم تقليل حلقات حيود مسحوق الذهب.
      ملاحظة: إذا كان الحزمة منتشرة بشكل صحيح، فإن حلقة حيود واضحة لمسحوق الذهب مرئية على الشاشة، مما يشير إلى أن الشعاع متوازي.
    5. تراجع سدادة شعاع بعد وضع الإضاءة الموازية وتغيير وضع المجهر إلى نانو التحقيق.
      ملاحظة: تحقق من ضبط المجهر قبل بدء جمع البيانات لضمان الأداء الأمثل للمجهر. وسيتم تنفيذ كل هذه الإعدادات في المجهر المباشر محاذاة GUI التبويب. يتم تنفيذ كل ضبط المجهر باستخدام شبكة اختبار قبل جمع البيانات.

3. الحصول على البيانات مع خط العرض-S

  1. بدء تشغيل برنامج الحصول الآلي على البيانات Latitude-S.
    ملاحظة: يتطلب تثبيت Latitude-S أيضا معايرة المجهر، والتي سيتم إجراؤها قبل جمع البيانات، وسيتم تخزين الإعدادات بشكل دائم. يتم معايرة خمس حالات مختلفة لجمع البيانات بأربعة تكبيرات مختلفة (الشكل 1 والشكل 2). حالة الأطلس وحالة الشبكة في اثنين من التكبيرات المختلفة في وضع LM (نطاقات التكبير المنخفض). حالة الثقب في وضع SA (نطاقات التكبير العالي) ولكن مع تكبير معتدل. التركيز وحالة البيانات استخدام وضع SA التكبير عالية.
    1. انقر على DigitalMicrograph من قائمة ابدأ ، أو انقر نقرا مزدوجا على رمز DigitalMicrograph على سطح المكتب.
    2. حدد رمز إدارة التقنية من ديجيتال ميتروغراف.
      ملاحظة: سيعرض هذا النظام رموز TEM و Latitude-S (الشكل 2 والشكل التكميلي S1).
    3. حدد رمز Latitude-S لجمع البيانات التلقائية من جسيم واحد.
      ملاحظة: تعمل كاميرا K2 في ثلاثة أوضاع: خطي/متكامل، محسوب، و فائق الدقة. يمكن للمستخدم تحديد أي وضع في واجهة DigitalMicrograph. يمكن حفظ صور البيانات إما ككدسات صور مجزأة بالجرعة أو كصور مجمعة في ملفات MRC أو TIF أو .dm4 ذات أعماق بت مختلفة. وعلاوة على ذلك، يمكن حفظ البيانات كصور مصححة للحركة للكاميرا K3. على كاميرا K2، يمكن حفظ مكدس صور غير معالج كملفات MRC 4 بت أو TIF 8 بت أو ملفات .dm4 8 بت.
  2. إنشاء جلسة عمل جديدة استنادا إلى الإعدادات من جلسة عمل سابقة.
    1. تحقق من خانة الاختيار استنادا إلى جلسة عمل سابقة في لوح الألوان.
    2. حدد الزر جديد .
    3. اختر المجلد الذي يحتوي على جلسة العمل التي تستند إليها إعدادات جلسة العمل الجديدة. انتقل إلى دليل جلسة العمل السابقة لإنشاء جلسة عمل جديدة. اختر المجلد لحفظ جلسة العمل الجديدة والبيانات المقترنة بها.
    4. حدد المجلد الذي سيتم حفظ جلسة العمل الجديدة والبيانات المقترنة به واختره.
      ملاحظة: سيتم تصدير كل حالة وإعداداتها الأساسية (التكبير وظروف الإضاءة والصورة أو جهاز العرض) ومعلمات إزاحة الحزم والكاميرا (التعرض الكلي، والتعرض لإطار واحد، و binning) من الجلسة الحالية إلى الجلسة الجديدة. يظهر مسار المجلد كسلسلة نصية في أسفل لوح الألوان. تحتوي كل من لوحات الإعدادات والإعدادات على علامة نجمية (*) ملحقة بالعنوان لإظهار أنه تم إعداده بالفعل وأنه جاهز للاستخدام.
  3. متابعة جلسة عمل موجودة.
    1. اضغط الزر متابعة في لوح الألوان لمتابعة جلسة عمل موجودة.
      ملاحظة: لا يمكن تعديل المونتاج أطلس.
    2. اختر وانتقل إلى المجلد الذي يحتوي على جلسة العمل التي تحتاج إلى مواصلة.
  4. بدء جلسة جديدة تماما.
    1. انقر على علامة تبويب جديدة في لوحة الألوان. اختر المجلد الذي يحتوي على جلسة العمل التي سيتم المواصلة. حدد مجلدا لحفظ البيانات.
      ملاحظة: يتم إنشاء اسم المجلد الافتراضي باستخدام التاريخ والوقت.
    2. انقر على أيقونة الإعداد . في المربع استكشاف حالة إدارة الذي يظهر، إضافة حالة، تعيين شرط TEM، شرط الكاميرا، والصورة / المكدس، ومن ثم تسمية الحالة.
      ملاحظة: يستخدم سير عمل اقتناء البيانات التلقائي 5 حالات مختلفة لجمع البيانات التلقائي. يتم تكوين هذه الحالات وتخزينها في لوحات الحالات الخاصة بها. 10- موجز الحالة مذكور في الجدول 1.
  5. تكوين حالة أطلس.
    1. انقر على لوحة حالة أطلس.
    2. تكوين حالة أطلس مع المعلمات التالية: التكبير 115x LM وضع في نانو التحقيق، وظروف الإضاءة بقعة حجم 8 والسطوع 934400، binning: 1 ووقت التعرض الكاميرا: 1.0 ثانية للتصوير في التكبير منخفضة. راجع ملخص الحالة الوارد في الجدول 1.
    3. انقر على التالي للانتقال إلى الحالة التالية.
      ملاحظة: حالة أطلس هي حالة التكبير الأدنى، التي توفر مسح الشبكة بأكملها (الشكل التكميلي S2). عموما، هذه الدولة يساعدنا على تصور الشبكات بأكملها في التكبير منخفضة والحكم على سمك الجليد، والتسطيح، ومربع مكسورة من الشبكات. ويوصى بتوليد الأطلس في مناطق مختلفة من الشبكة لمراقبة سمك الجليد الأمثل وسمك الجليد دون المستوى الأمثل للشبكات (الشكل التكميلي S3). يمكن أن تختلف المعلمات المذكورة وفقا لاحتياجات المستخدم.
  6. تكوين حالة الشبكة.
    1. انقر على لوحة حالة الشبكة.
    2. تكوين حالة الشبكة مع البصريات التصوير المجهر التالية (التكبير 380x LM الوضع في نانو التحقيق)، وظروف الإضاءة (حجم بقعة: 8 وسطوع 626،200)، binning: 1 ووقت التعرض للكاميرا: 1.0 ثانية.
    3. انظر موجز حالة خط العرض-S الوارد في الجدول 1.
    4. انقر على التالي للانتقال إلى الحالة التالية.
      ملاحظة: يتم تعيين حالة الشبكة في تكبير أعلى من حالة أطلس بحيث يكون حقل العرض مربع شبكة واحدة (الشكل 2). في هذا التكبير خاصة، لوحظ مربع شبكة واحدة. لذلك ، لوحظت الثقوب بشكل صحيح في هذا التكبير ، مما يساعد على التحقق من سمك الجليد للثقوب (الشكل التكميلي S4). يتم استخدام فلتر ممر بسيط في حالة الشبكة لتحديد موقع الثقوب في شبكة براءات الاختراع. يمكن أن تختلف المعلمات المذكورة وفقا لاحتياجات المستخدم.
  7. تكوين حالة الثقب.
    1. انقر على لوحة حفرة.
    2. تكوين حالة الثقب مع إعدادات المجهر التالية: البصريات التصوير (التكبير 4500x وضع SM في نانو التحقيق)، وظروف الإضاءة (حجم بقعة: 7 وقطر شعاع 8.81 ميكرومتر)، binning: 1 ووقت التعرض الكاميرا: 1.0 ثانية.
    3. تغيير المعلمات إذا لزم الأمر استنادا إلى نوع الشبكة. انظر ملخص الحالة الوارد في الجدول 1.
    4. انقر على التالي للانتقال إلى الحالة التالية.
      ملاحظة: يشير وضع SA إلى نطاق تكبير عالي في المجهر الإلكتروني. تقع حالة الثقب في نطاق تكبير SA مع مجال رؤية لبضعة ميكرومترات (10-20 ميكرومتر) (الشكل 2 والشكل التكميلي S4). نطاق التكبير هذا أعلى من حالة أطلس أو الشبكة ولكنه أصغر بكثير من حالة التركيز/البيانات. في هذا التكبير، سوف تكون الثقوب الفردية مرئية. حجم الثقب مناسب لمراقبة درجات عالية من التلوث ، والثقوب الفارغة ، وسماكة الجليد المناسبة للثقوب. يتم اختيار ثقوب التصوير على أساس هذه الافتراضات. يتم استخدام اثنين من المرشحات في حالة ثقب: واحد لربط صورة مرجعية ثقب مع صورة ثقب جديد وآخر لضبط ارتفاع المرحلة إلى ارتفاع eucentric.
  8. تكوين حالة التركيز.
    1. انقر على لوحة التركيز.
    2. تكوين حالة التركيز مع إعدادات المجهر التالية: البصريات التصوير (تكبير 45،000x وضع SA في نانو التحقيق)، وظروف الإضاءة (حجم بقعة: 8 والسطوع 934400)، binning: 1 ووقت التعرض الكاميرا: 1.0 ثانية.
    3. التركيز على منطقة الكربون غير متبلور بالقرب من الحفرة. راجع ملخص حالة Latitude-S الوارد في الجدول 1.
    4. انقر على التالي للانتقال إلى الحالة التالية.
      ملاحظة: يشير وضع SA إلى نطاق تكبير عالي في المجهر الإلكتروني. حالة التركيز هي تكبير نطاق SA الأعلى. في وضع التركيز البؤري، يتم نقل الشعاع إلى منطقة كربون قريبة من الثقب المستهدف ويؤدي التركيز تلقائيا لجمع البيانات في حالة البيانات. يتم استخدام فلتر ممر النطاقات مع مرشح مستطيل هانينغ أو ناعم في حالة التركيز لقياس الإزاحة بين صورتين من صور حالة التركيز لنفس المنطقة (الشكل 2). يمكن أن تختلف المعلمات المذكورة وفقا لاحتياجات المستخدم.
  9. تكوين حالة البيانات.
    1. انقر على لوحة البيانات.
    2. تكوين حالة البيانات مع إعدادات المجهر التالية: البصريات التصوير (على سبيل المثال، التكبير 28،000x، 45،000x، 54،000x في وضع SA في نانو التحقيق)، وظروف الإضاءة (حجم البقعة: 8 وسطوع 934400)، binning: 1 ووقت التعرض للكاميرا: 1.0 ثانية.
    3. راجع ملخص حالة Latitude-S الوارد في الجدول 1.
    4. انقر على التالي للانتقال إلى الحالة التالية.
      ملاحظة: حالة البيانات هي أعلى تكبير تم تحديده استنادا إلى متطلبات حجم البكسل ودقة الهدف (الشكل 2). عموما، بعد التركيز، يتم نقل الحزمة تلقائيا إلى المنطقة المستهدفة لجمع البيانات. يمكن تغيير المعلمات المذكورة أعلاه استنادا إلى متطلبات المستخدم.

4. تكوين التركيز

  1. انقر على لوحة التكوين التركيز. حدد نطاق قيم defocus وحجم الخطوة في علامة التبويب المحددة.
  2. اضغط على الزر التالي للانتقال إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: يمكن استخدام قيم defocus السفلية للحصول على بيانات عالية الدقة. بشكل عام، يتم استخدام -0.5 إلى -3.0 ميكرومتر قيم defocus مع أحجام خطوة defocus 0.25 أو 0.5 للحصول على الصورة. يمكن للمستخدمين تخطي خطوة إعداد التركيز إذا كانوا يريدون فقط فحص العينة. ما عليك سوى الضغط على الزر التالي على لوح الألوان لتخطي خطوة تكوين التركيز.

5. محاذاة غرامة

  1. التركيز على بعض الميزات على الشبكة (مثل الجليد سداسي التلوث الجليدي)؛ انظر الشكل 3.
    ملاحظة: يجب أن لا تكون الميزات كبيرة جدا أو صغيرة جدا. يجب أن تكون مرئية في كل من حالة أطلس تكبير 115x (وضع LA) وتكبير البيانات.
  2. انقر على زر الالتقاط . ضع علامة الصليب الأحمر على نفس الميزة على كل صورة من حالات مختلفة.
  3. ابدأ بحالات التركيز والبيانات والثقوب لأن مجال الرؤية أكبر بكثير من حالات الأطلس والشبكة. تكبير حالات الأطلس والشبكة لوضع علامة الصليب الأحمر على نفس الميزة في حالات الأطلس والشبكة.
  4. انقر على زر حساب لحساب مواقف خمس حالات مختلفة، والتي سوف تحسب الإزاحات بين كل من الدول وتعكس هذه إلى إطار الإخراج.
    ملاحظة: يتم دمج قيم الإزاحة في الحالات لاستخدامها بشكل أكبر (الشكل 3). يتم تنفيذ محاذاة دقيقة لتوفير دقة عالية من موقف كل دولة (الشكل 3). تساعد هذه المحاذاة الدقيقة على تحديد الموضع الدقيق في جميع الولايات الخمس. محاذاة دقيقة أمر بالغ الأهمية للحصول على بيانات جسيم واحد. لذلك، يوصى بشدة بإجراء محاذاة دقيقة قبل التصوير.

6. إجراء الحصول على البيانات باستخدام Latitude-S

  1. انقر على لوحة التقاط.
    ملاحظة: بشكل عام، يتم تجميع بيانات أطلس عند التكبير المنخفض (115x) لتصور معظم مربعات الشبكة.
  2. اختر حجم الأطلس لتغطية الشبكة بأكملها أو جزء من الشبكة استنادا إلى المتطلبات (على سبيل المثال، 6 × 6، 8 × 8، 12 × 12، 6 × 8، 8 × 6، 12 × 8، أو 8 × 12).
    ملاحظة: يغطي حجم أطلس 16 في 16 الشبكة بأكملها.
  3. انقر على زر التقاط لالتقاط الأطلس.
    ملاحظة: تفتح نافذة التنقل Latitude-S الرئيسية وتملأ المساحة المتوفرة في DigitalMicrograph (الشكل التكميلي S5). تعرض ثلاثة أجزاء صور في إطار التنقل الرئيسي صورا لولايات النظام في ثلاثة تكبيرات مختلفة. يتم عرض الأطلس الكلي حاليا في حالته الحالية للاستحواذ في الجزء الموجود في أقصى اليسار. البلاط في الأطلس سوف تملأ كما يحدث كل التقاط.
  4. حدد مربع الشبكة استنادا إلى سمك الجليد عن طريق التنقل على الأطلس (الشكل التكميلي S5). بمجرد تحديد مربعات الشبكة المطلوبة ، انقر على زر الجدولة ولاحظ المربعات في مربع الشبكة تملأ كما يتم التقاط كل مربع الشبكة.
  5. انقر على الزر جدولة بمجرد تحديد مربعات الشبكة.
  6. حدد ثقب تمثيلي في مربع الشبكة بإضافة موضعه. بمجرد الحصول على صورة ثقب، حدد البيانات ومواضع التركيز وحفظ التخطيط كقالب (الشكل التكميلي S6).
  7. انقر على البحث التلقائي، وإعطاء حجم الثقب (على سبيل المثال، R1.2/1.3)، وانقر على زر البحث في البرنامج، مما سيؤدي إلى برنامج البحث عن العثور تلقائيا على الثقوب على أساس قطر الثقب. بعد ذلك، انقر على زر Mark لإضافة القالب (الشكل 4) وإضافة علامات دائرة حمراء في جميع الثقوب في شبكة واحدة أو مربع شبكة جزئي.
  8. إعداد كثافة لإزالة الثقوب من مربع الشبكة وتلوث الجليد (الشكل 4).
    ملاحظة: أخيرا، سيتم وضع علامة الثقوب المحددة باللون الأصفر لجدولة جمع البيانات.
  9. انقر على زر الجدولة في مهام Latitude بعد إضافة الثقوب من خلال البحث التلقائي.
    ملاحظة: قبل جدولة جمع البيانات التلقائي، تأكد من أن مستوى خزان النيتروجين السائل كاف، ومضخة توربو autoloader هو خارج، ومساحة محرك RAID مجانية. يعرض مدير مهام Latitude-S عدد حالات الأطلس ومربع الشبكة والثقب والبيانات المجدولة لجمع البيانات (الشكل 5). في Latitude-S GUI، ستكون أنظمة الألوان المختلفة مرئية، وسيتم عرض معنى أنظمة الألوان المختلفة: 1. يشير الأصفر إلى أنه غير مجدول؛ 1. 2. يشير الأخضر المقرر؛ 3. الأزرق يشير المكتسبة؛ 4. الأحمر يشير إلى فشل.

7. معالجة بيانات Cryo-EM

ملاحظة: يتم وصف معالجة الصور Cryo-EM من بروتين سبايك بالتفصيل في الأدب الحديث25.

  1. إجراء معالجة الصور من البروتين ارتفاع سارس-CoV2 باستخدام RELION 3.011.
  2. قم بفحص صور الأفلام التي تم جمعها باستخدام Latitude-S يدويا، واؤدي تصحيح الحركة الناجم عن الحزمة للأفلام الفردية باستخدام MotionCor2 software9. إجراء الفحص الأولي للصور المجهرية المصححة للحركة يدويا بمساعدة حزمة برامج cisTEM14.
    ملاحظة: كان ما يقرب من 85٪ من الصور الدقيقة المكتسبة تلقائيا ذات نوعية جيدة، وكانت البيانات إشارة في غضون 3.7-5.2 Å، والتي يتم حسابها باستخدام برنامج cisTEM14 (الشكل التكميلي S7A، B).
  3. معالجة البيانات باستخدام حزمة البرامج RELION 3.011.
    1. اختيار جزيئات ارتفاع يدويا وإخضاعها لتصنيف فئة 2D (الشكل التكميلي S7C). استخدم أفضل فئة 2D كمرجع إلى الجسيمات ذات الارتفاع الواحد 3,99,842 من الصور الدقيقة باستخدام أداة الاسترداد التلقائي RELION11.
      ملاحظة: أجريت ثلاث جولات من التصنيف ثنائي الأبعاد قبل إخضاع الجسيمات لتصنيف ثلاثي الأبعاد (الشكل التكميلي S8). وتم اختيار ما يقرب من 982 55 2 جسيما واحدا للتصنيف ثلاثي الأبعاد، وصنفت مجموعة البيانات في ست فئات. تم تنفيذ النهائي 3D لصناعة السيارات في الصقل مع أفضل فئة; تم الحصول على 85,227 جسيم ارتفاع من التصنيف ثلاثي الأبعاد.
    2. بعد التحسين التلقائي، قم بإجراء كل تحسين دقة لأوراق الجسيمات باستخدام معلمات إمالة الحزم المناسبة لتحسين الدقة. بعد ذلك ، أخضع الجسيمات لتلميع بايزي باستخدام حزمة برامج RELION 3.011. وأخيرا، استخدم مجموعة الجسيمات المصقولة لجولة أخرى من الصقل التلقائي ثلاثي الأبعاد باستخدام RELION 3.011.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وفي ظل الوضع الحالي للجائحة، تلعب منظمة التبريد والطوارئ دورا رئيسيا في توصيف هياكل مختلف البروتينات من السارس-COV-226,27,28,29، والتي قد تساعد في تطوير اللقاحات والأدوية المضادة للفيروس. هناك حاجة ملحة لجهود بحثية سريعة الخطى بموارد بشرية محدودة لمكافحة مرض الفيروس التاجي لعام 2019. الحصول على البيانات في التبريد أحادي الجسيمات هو خطوة تستغرق وقتا طويلا ولكنها حاسمة في تحديد هيكل الجزيئات الكبيرة. وقد مكنت التطورات الأخيرة في الحصول التلقائي على البيانات cryo-EM من التدخل البشري المحدود في جمع البيانات. برنامج Latitude-S هو حزمة برامج الحصول التلقائي على البيانات الهامة المستخدمة هنا لجمع البيانات الآلية من البروتين النقي سارس-CoV2 ارتفاع.

تم إجراء الحصول على بيانات Cryo-EM من بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 مع 200 كيلو فولت كريو-EM مجهزة ب DED قمة K2. وتم وضع علامة يدوية على مواقع الحصول على البيانات على الشبكة ذات سمك الجليد المرغوب فيه وتوزيع الجسيمات. وقد تم وضع علامة على هذه الوظائف بالتوازي أثناء الحصول على البيانات التي تحدث في الخلفية. وفي المواقع المميزة، أجرى برنامج Latitude-S اقتناءا آليا للبيانات بتكبير اسمي قدره 200 42x بحجم بكسل قدره 1.17 Å على مستوى العينة. تم إعداد تكوين جمع البيانات عند تكبير 42,200x مسبقا واختباره بالفعل. وسجل ما مجموعه 40 إطارا لمدة 8 ق بجرعة إلكترون قدرها 2 e−/Å2 لكل إطار؛ وهكذا، استخدمت جرعة إجمالية قدرها 80 e−/Å2 لجمع البيانات (الشكل التكميلي S9). تم الحصول على البيانات في نطاق defocus من −0.75 ميكرومتر و -2.25 ميكرومتر، مع 3000 ملف فيلم تم جمعها في يومين. كل 4 ساعة، تم إجراء فحوصات دورية وتعديلات من قبل البرنامج لضمان أن جميع ملفات الأفلام التي تم جمعها على مدى 48 ساعة كانت ذات نوعية جيدة ولم يكن هناك تحول شعاع أو تحول المحاذاة. تم جمع البيانات بشكل مستقل دون أي تدخل بشري. بالإضافة إلى ذلك، توقف Latitude-S التصوير تلقائيا في وقت تعبئة النيتروجين السائل، مما يقلل من الاهتزاز غير الضروري أو الانجراف الميكانيكي في الصور.

وكما ذكر في قسم البروتوكول، أجري الفحص الأولي للصور الدقيقة المصححة للحركة يدويا باستخدام برنامج cisTEM14. واستنادا إلى الفحص، تبين أن معظم البيانات تقع ضمن نطاق الإشارة من 3.7 إلى 5.2 Å (الشكل التكميلي S7A). وهذا يشير إلى أن جمع البيانات التلقائي باستخدام Latitude-S أمر جيد، ومعظم البيانات مناسبة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد عالية الدقة. بالإضافة إلى ذلك، تم جمع الصور في نطاق defocus (-0.75 إلى -2.25 ميكرومتر)، وتم فحص نطاقات مختلفة من defocus يدويا من قبل cisTEM14. وكانت البيانات المكتسبة قريبة جدا من نطاق فك التركيز الإعداد في Latitude-S (الشكل التكميلي S7A، B).

تم تنفيذ معالجة البيانات باستخدام حزمة البرامج RELION 3.011. تم اختيار جزيئات سبايك يدويا لحساب متوسطات الفئة 2D. التفاصيل الهيكلية المختلفة (الحلزون وورقة β) مرئية في المتوسطات فئة 2D (الشكل التكميلي S7C)، مما يشير بقوة إلى أن التوصيف الهيكلي عالية الدقة ممكن باستخدام مجموعة البيانات هذه. ومع ذلك ، يشير التصنيف ثلاثي الأبعاد أيضا إلى أن بروتين الارتفاع يحتوي على مجال ملزم لمستقبلات 1 (RBD) مفتوح وجميع RBD أسفل تشكيل الإغلاق (الشكل التكميلي S8). يشير التصنيف ثلاثي الأبعاد إلى أن الفئة -1 لديها الحد الأقصى لعدد الجسيمات ، والتي تظهر كتكشير مفتوح 1-RBD. وعلاوة على ذلك، فإن الفئتين 3 و4 تحتويان على عدد مماثل من الجسيمات، ويبدو أن كلا النموذجين لديهما جميع RBD أسفل تشكيل وثيق. ومع ذلك، تظهر الفئة -5 تشكيلا وسيطا، حيث يكون 1-RBD في وضع متوسط. ومع ذلك ، تم إعادة بناء 1-RBD حتى تشكيلات مفتوحة من البروتين ارتفاع باستخدام التماثل C1 ، والقرار العام هو 4.4 Å (الشكل 6 والشكل التكميلي S10). وبالمثل، تم تنقيح جميع RBD أسفل تشكيل وثيق (الطبقة-3 والطبقة-4) جنبا إلى جنب مع التماثل C3، والقرار العام في 0.143 FSC هو ~ 3.9 Å (الشكل 7).

معالجة الصورة الشاملة تشير إلى أن البروتين ارتفاع يعتمد جميع RBDs أسفل إغلاق و 1-RBD حتى تشكيل مفتوحة. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد تشكيل وسيطة من البروتين ارتفاع. يشير هيكل cryo-EM عالي الدقة للنسب الفرعي S2 من بروتين الارتفاع إلى السلاسل الجانبية لمخلفات الأحماض الأمينية الفردية (الشكل 6B والشكل 7C). جميع عمليات إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد ونتائج cryo-EM تشبه إلى حد كبير النتائج التي تم التوصل إليها في الأدب المنشور مؤخرا25. ومع ذلك ، تم توصيف بنية cryo-EM عالية الدقة لبروتين الارتفاع في غضون 15 يوما ، وهو أمر ممكن فقط بسبب بروتوكولات الحصول التلقائي على بيانات cryo-EM وبرامج التقاط الجسيمات التلقائية. ولذلك، يمكن أن تسهم حزم برامجيات اقتناء البيانات تلقائيا، بما في ذلك Latitude-S، إسهاما كبيرا في توصيف عدة هياكل عالية الاستبانة للكريو-م للجزيئات البيولوجية.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل في اقتناء البيانات الآلي باستخدام Latitude-S: الخطوات العامة الواجب اتباعها قبل جمع البيانات (إعداد الشبكة، وتحميل العينات، وضبط المجهر). الحصول على البيانات هو الجزء الرئيسي من هذه المخطوطة، ويتم تسليط الضوء على خط الأنابيب الذي سيتم اتباعه أثناء الحصول على البيانات. الاختصارات: cryo-EM = المجهر الإلكتروني المبرد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد حالات مختلفة لجمع البيانات ذات الجسيمات المفردة باستخدام حزمة برامج Latitude-S GUI. (A) Latitude-S للحصول على البيانات في بدلة برنامج DM3. (ب) سير عمل إجراء الحصول على البيانات. (ج) توسيع كل لوحة. اختصار: GUI = واجهة المستخدم الرسومية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: محاذاة دقيقة لإعداد دقة عالية للتركيز واكتساب الصورة. يتم تنفيذ المحاذاة الدقيقة على خمس ولايات أ. أطلس، ب. هول، ج. البيانات، د. الشبكة، e. التركيز. ركز كل ولاية بوضع العلامة الحمراء على نفس الموضع. يوصى بشدة بإجراء Fine Alignment قبل بدء أي جلسة جديدة ، مما سيساعد على إجراء التصوير في موضع معين. يعتمد اكتساب الصورة في موضع معين (دون أي تحول كبير) تماما على دقة المحاذاة الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: اختيار الثقب التلقائي باستخدام Latitude-S. يتم إجراء البحث التلقائي عن الثقوب للحصول على البيانات تلقائيا استنادا إلى حجم الثقب. (أ) يبين موقع ناقل البحث عن ثقب للعثور التلقائي على الثقوب. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (B) يظهر وضع علامات على الثقوب باستخدام حفرة العثور على ناقلات وضبط كثافة لإزالة علامة من منطقة الحدود وتلوث الجليد. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر (يسار) و 10 ميكرومتر (وسط). (ج) يظهر الإضافة التلقائية للثقوب للتصوير (الأصفر). مقياس الشريط = 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: عرض مباشر لاكتساب البيانات. (أ) يتم وضع علامة على المواضع باللون الأصفر والأخضر والأزرق والأحمر استنادا إلى حالة الحصول على البيانات في كل مركز. (ب) رمز اللون لرصد حالة الحصول على البيانات. الأخضر: مجدول، أصفر: غير مجدول، أزرق: اكتساب، أحمر: فشل. تظهر اللوحة اليسرى عدة ثقوب خضراء ملونة (مجدولة) وبعض الثقوب التي تحمل علامة زرقاء (مكتسبة)؛ شريط المقياس = 10 ميكرومتر. تظهر اللوحة الوسطى تكبيرا 4300x لثقب فردي. في هذه الصورة لثقب (لوحة وسطى)، يظهر المربع المربع الأزرق منطقة التركيز، ويظهر المربع المربع الأخضر منطقة التصوير؛ شريط المقياس = 1000 نانومتر. تعرض اللوحة اليمنى الصورة المكتسبة. تعرض اللوحة اليمنى المتطرفة أرقام الصور المجدولة، والوقت الإجمالي اللازم للتصوير، وعدد الصور المجدولة للتصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: وضع سبايك 3D مع 1RBD مفتوحة. (أ) يتم تمثيل التلقائي المكرر وشحذ مخطط البروتين ارتفاع 1-RBD مفتوحة في الجانب، أعلى، وأسفل وجهات النظر. (ب) تم تجهيز خريطة EM مع هيكل الكريستال لتصور أفضل من السلاسل الجانبية. المناطق المميزة في الخريطة لها كثافات للسلاسل الجانبية. الاختصارات: 3D = ثلاثي الأبعاد؛ RBD = مجال المستقبلات ملزمة; EM = المجهر الإلكتروني; NTD = N- المجال الطرفي; S1 = الوحدة الفرعية 1; S2 = الوحدة الفرعية 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: جميع RBD أسفل تشكيل وثيق من البروتين ارتفاع. (أ) لصناعة السيارات في صقل وشحذ مخطط البروتين ارتفاع جميع RBD أسفل تشكيل وثيق ممثلة في وجهات النظر الجانب وأعلى. (ب) تم تجهيز خريطة EM مع هيكل الكريستال لتصور أفضل من السلاسل الجانبية. تظهر الأسهم أن المناطق في الخريطة لها كثافات للسلاسل الجانبية (C). المختصرات: RBD = مجال ربط المستقبلات؛ EM = المجهر الإلكتروني; NTD = N- المجال الطرفي; S1 = الوحدة الفرعية 1; S2 = الوحدة الفرعية 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: واجهة المستخدم الرسومية لاقتناء الصور Latitude-S: يتم التحكم في وحدات تحكم المجهر المختلفة (مثل صمام العمود المفتوح / الإغلاق ، وإدراج الشاشة / التراجع من قبل واجهة المستخدم الرسومية Latitude-S. يمكن التحكم في صمام العمود والكاميرا وحالة الشاشة وملء النيتروجين السائل في اللوحة اليسرى. في الجزء السفلي من هذه اللوحة، تظهر معلمات المعايرة المختلفة باللون الأخضر (على سبيل المثال، التكبير، إمالة الحزمة، التركيز الموضوعي). إذا ظهرت أي معلمة سوداء، فإنه يشير إلى أن المعلمة غير محسنة بشكل صحيح. لذلك، يجب تحسين كافة المعلمات قبل بدء أي جلسة عمل جديدة. اختصار: GUI = واجهة المستخدم الرسومية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: تمثيل حالة أطلس. دول أطلس مختلفة تبين مربعات الشبكة ونوع الجليد التي تشكلت. (A-F) كما يتم تسليط الضوء على أحجام أطلس المختلفة. (أ، ب، د، واو) يتم تسليط الضوء على نمط الجليد السميك. (ج، د) يتم تمييز المربعات المكسورة. الجليد السميك والمناطق المكسورة (ملحوظ في الشكل) ليست مناسبة للتصوير. (E، F) مربعات شبكة جيدة للتصوير؛ A، B، C، D، و F إظهار مربعات الشبكة مناسبة للتصوير عالي الدقة. ومع ذلك، يجب استبعاد مربعات الشبكة الجليدية السميكة ومربعات الشبكة المكسورة. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (A-C)، 50 ميكرومتر (D، E)، و 25 ميكرومتر (F). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: تمثيل حالة الشبكة وحالة الثقب. تظهر حالة الشبكة وحالة الثقب المقابلة في الصورة. (أ، ه) ثقب فارغ، (F، G) الجليد السميك، (E) تلوث الجليد، و (A، B، C، D، E، و G) يتم وضع علامة على سمك الجليد مناسبة في الصورة. يتم اختيار ثقوب سمك الجليد مناسبة للحصول على الصورة (A، B، C، D، E، و G). أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (A، E، F، G)، 2 ميكرومتر (B)، 50 ميكرومتر (C)، 5 ميكرومتر (D). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S4: مرجع الثقب للتصوير التلقائي. صورة الثقب (QUANTIFOIL-Holey Carbon grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3) يتم التقاطها وحفظها للرجوع إليها في المستقبل. يمكن أن يختلف حجم مرجع الفتحة استنادا إلى أنواع مختلفة من الشبكات. من المستحسن التقاط مرجع الفتحة دوما قبل بدء أي جلسة عمل جديدة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S5: لوحة التقاط الصور في مختلف التكبير واختيار الثقب. (أ) تعرض لوحة الالتقاط إعدادات الحصول على البيانات. (ب) تعرض نافذة الملاحة الرئيسية Latitude-S ثلاثة تكبيرات متتالية. في حالة أطلس (150x)، يتم تحديد مربعات الشبكة للحصول على البيانات (اللوحة اليسرى، شريط المقياس = 50 ميكرومتر). في التكبير الأعلى (380x)، يتم تركيز مربع واحد (لوحة متوسطة، شريط مقياس = 20 ميكرومتر). مزيد من التكبير أعلى (4300x) ، وتركز ثقوب داخل كل مربع (لوحة اليد اليمنى ، شريط مقياس = 5 ميكرومتر). ومع ذلك، فإن هذه التكبيرات تتغير وفقا لحجم وشكل الشبكات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S6: إنشاء قالب لتحديد الثقب والتصوير. يتم تنفيذ إنشاء القالب عن طريق إضافة موضع على الثقب للبيانات ، ويتم وضع التركيز بجوار الثقب على سطح الكربون. يجب أن يكون التركيز على منطقة الكربون بحيث لا يلمس قطر الحزمة أي ثقب مجاور. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر (اللوحة اليسرى)، 10 ميكرومتر (لوحة وسطى)، 1000 نانومتر (اللوحة اليمنى). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S7: التصوير CRYO-EM من سارس-CoV2 باستخدام Latitude-S وفحص الصور. (أ) فحص الصور الدقيقة المكتسبة: تناسب 1D CTF، 2D CTF تناسب، والمعلمات CTF؛ تقدير بيانات البروتين ارتفاع السارس-CoV2 باستخدام cisTEM. 1D CTF تناسب وخاتم ثون يظهر أن الإشارة الإجمالية هي 4.8 Å. (B) يتم الحصول على Micrographs في اثنين من قيمة ديفوكوس مختلفة من البروتين ارتفاع باستخدام خط العرض-S. أشرطة المقياس = 50 نانومتر. (ج) متوسط الفئة 2D النهائي. متوسط الفئة 2D يظهر أعلى وأسفل، ووجهات النظر الجانبية من البروتين ارتفاع. جميع التفاصيل عالية الدقة مرئية في متوسطات الفئة 2D. الاختصارات: cryo-EM = المجهر الإلكتروني المبرد؛ 1D = أحادي البعد؛ 2D = ثنائي الأبعاد؛ CTF = وظيفة نقل التباين؛ سارس-CoV2 = فيروس كورونا متلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة 2. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S8: معالجة البيانات الخاصة ببيانات بروتين السارس-CoV2 التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج Latitude-S. تظهر الصورة سير العمل المتبع لمعالجة بيانات cryo-EM من بروتين الارتفاع. يتم إجراء تصنيف ثلاثي الأبعاد لبروتين الارتفاع باستخدام Relion 3.0. الفئة -1 يظهر 1-RBD حتى تشكيل مفتوحة. الفئة 3 والفئة 4 تظهر جميع RBD أسفل تشكيل وثيق من ارتفاع البروتين. الفئة 5 يظهر تشكيل وسيطة من البروتين ارتفاع. الاختصارات: cryo-EM = المجهر الإلكتروني المبرد؛ 3D = ثلاثي الأبعاد؛ RBD = مجال المستقبلات ملزمة; سارس-CoV2 = فيروس كورونا متلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة 2. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S9: صورة مجزأة بالجرعة تم التقاطها كمرجع لاكتساب الصورة النهائية. يتم التقاط صور الكسر الجرعة مع التعرض 8.0 ثانية والتعرض 0.2 ثانية / الإطار. انقر على زر الحفظ التلقائي بالقرب من الكاميرا لحفظ ملفات الفيلم تلقائيا. بعد الحصول على الصورة، انقر على الصورة وحفظ معلمات الصورة مجزأة الجرعة باستخدام زر تحديث الصورة في حالة جمع البيانات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S10: التوزيع الزاوي وارتباط قذيفة فورييه من السارز-CoV-2 1 RBD ولدت حتى فتح تشكيل ارتفاع خريطة البروتين. (أ) التوزيع الزاوي للنموذج الثلاثي الأبعاد النهائي لل1-RBD حتى تشكيل مفتوح للبروتين ارتفاع. يمثل الأزرق قيما أقل، ويمثل اللون الأحمر قيما أعلى لتوزيع الجسيمات العادي. (ب) منحنى ارتباط قذيفة فورييه تظهر 4.4 Å القرار من 1-RBD حتى تشكيل مفتوحة من البروتين ارتفاع, يقدر في قطع. الاختصارات: 3D = ثلاثي الأبعاد؛ RBD = مجال المستقبلات ملزمة; السارس-CoV2 = فيروس كورونا متلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة 2; FSC = ارتباط قذيفة فورييه. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

حالة صورة أطلس أطلس 115
التكبير 115، حجم بكسل 34.7 نانومتر
أشار ديفوكوس 4.38 ملم
حجم البقعة 8
وضح 934400
طريقة التصوير
بينينج 1
وقت التعرض 1.0 s
حالة مسح الشبكة الشبكة 380
التكبير 380، حجم بكسل 11.2 نانومتر
أشار ديفوكوس 2.37 ملم
حجم البقعة 8
وضح 626200
طريقة التصوير
بينينج 1
وقت التعرض 1.0 s
حالة مسح الثقب حفرة 3400
التكبير 3,400, حجم بكسل 1.20 نانومتر
أشار ديفوكوس -0.75 ميكرومتر
حجم البقعة 7
قطر الحزمة 8.81 ميكرومتر
طريقة التصوير، SA، Mh
بينينج 1
وقت التعرض 1.0 s
حالة التركيز التركيز 45k
التكبير 45,000, حجم بكسل 0.0924 نانومتر
أشار ديفوكوس 4.51 ميكرومتر
حجم البقعة 6
قطر الحزمة 0.716 ميكرومتر
طريقة التصوير، SA، Mh
بينينج 1
وقت التعرض 1.0 s
دولة أكسيسيتيون البيانات 45k
التكبير 45,000, حجم بكسل 0.0924 نانومتر
إعداد ديفوكوس الحد الأدنى: -4,500 نانومتر, الحد الأقصى: -1,500 نانومتر, الخطوات: 250 نانومتر
حجم البقعة 6
قطر الحزمة 0.752 ميكرومتر
طريقة التصويريلم,SA,Mh
بينينج 1
وقت التعرض إجمالي التعرض 8 s ل 20 إطار
إعداد الكاميرا تم العد، تسوية المكاسب، تصحيح الخلل
إعداد حفظ البيانات MRC

الجدول 1: ملخص إعداد حالة Latitude-S.

مواصفات قاعدة K2 قمة K2
TEM الجهد التشغيلي 200-400 كيلو فولت
منطقة الاستشعار النشطة 19.2 مم × 18.6 مم
حجم المستشعر بالبكسل 3838 × 3710 7676 × 7420 سوبر-
دقة
حجم البكسل الفيزيائي 5 ميكرومتر
بينينج 1-8x
مطالعة المستشعر أي منطقة تعسفية
التكبير بالنسبة للفيلم 1.3-1.5x
سرعة قراءة المستشعر 50 إطارا في الثانية كاملة 400 إطارا في الثانية كاملة
نقل السرعة إلى الكمبيوتر 8 كامل إطارا في الثانية 40 إطارا في الثانية كاملة
عرض الصورة 8 كامل إطارا في الثانية 10 إطارا في الثانية كاملة
أداء DQE (300 كيلو فولت) >0.30 (الذروة) >0.25 في 0.5 من Nyquist المادية >0.7 (الذروة) >0.50 في 0.5 من Nyquist المادية >0.06 في 1.25 من Nyquist المادية
برمجيات جناح غاتان للفحص المجهري بما في ذلك التصوير الرقمي

الجدول 2: مواصفات الكاميرا.

خيار التكوين قيمة
نوع المجهر تالوس القطب الشمالي G2
توتر شديد 200 كيلو فولت
مصدر XFEG
عدسة كريو توين
نظام فراغ تالوس TMP IGP
محمل نموذج محمل تلقائي

الجدول 3: تكوين المجهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Latitude-S هي واجهة مستخدم بديهية ، والتي توفر بيئة لإعداد وجمع الآلاف من الصور الدقيقة عالية الدقة أو ملفات الأفلام تلقائيا في يومين. ويوفر سهولة الملاحة عبر الشبكات ويحافظ على موقف مرحلة المجهر في حين أنه ينتقل من التكبير المنخفض إلى التكبير عالية. كل خطوة من خطوات الحصول على البيانات مع Latitude-S هي فعالة من حيث الوقت، مع ميزات مثل واجهة مستخدم بسيطة، وتدفق سريع للبيانات بسرعة تصل إلى 4.5 جيجابايت / ثانية، وعرض متزامن للبيانات أثناء الاستحواذ. بالإضافة إلى ذلك، تم بسهولة إعادة تحميل تجزئة الجرعة معايرتها مسبقا، ومعدل الجرعة، والتركيز، ومعلمات التكبير لبدء جلسة جديدة من اكتساب البيانات التلقائي وتوفير الوقت.

الحصول على البيانات تلقائيا في غياب الرصد المستمر ودون المساس بجودة مجموعة البيانات مهمة صعبة وتستغرق وقتا طويلا. جمع البيانات الآلي باستخدام البرمجيات Latitude-S مريحة عندما الوقت والموارد هي القيود الرئيسية، ولا سيما خلال هذا الوباء. بيد انه تم حل العديد من هياكل التبريد - الطوارئ لمختلف بروتينات السارس - فيروس الكو فى - 2 فى الشهور القليلة الماضية ، مما سيساعد شركات الادوية على تطوير اللقاحات . تستخدم المختبرات المختلفة أنواعا مختلفة من حزم برامج جمع البيانات التلقائية لجمع البيانات. استخدمنا Latitude-S مع K2 Summit DED لجمع البيانات التلقائي cryo-EM على شبكات الكربون هولي أو محلية الصنع GO المغلفة الشبكات30.

وقد أجريت تلك الدراسة باستخدام المعلمات المذكورة أعلاه في قسم البروتوكول، الذي يقدم أدلة قوية على أن Latitude-S هي حزمة برامج مناسبة ومثالية لجمع البيانات التلقائية للجسيمات المفردة cryo-EM. ومع ذلك ، فمن المستحسن جدا اتباع بروتوكولات معينة قبل بدء التصوير باستخدام كاميرا K2. تتطلب كاميرا الكشف المباشر K2 إجراءات الصيانة الأساسية لتحقيق أعلى أداء. يساعد التلويث المنتظم للكاميرا إلى 50 درجة لمدة 24 ساعة المستشعر على الأداء الأمثل عن طريق تقليل الضوضاء والتلوث في الخلفية على مستوى السطح. ومع ذلك ، بعد أن تمل الكاميرا ، وتحديث كسب والمراجع المظلمة للكاميرا هو خطوة إلزامية (يأخذ ~ 45 دقيقة) قبل تنفيذ أي اقتناء الصورة.

على الرغم من أن Latitude-S هي حزمة برامج مستقرة وسهلة الاستخدام لجمع البيانات التلقائي cryo-EM ، فمن الضروري تحسين المعلمات المختلفة (التكبير ، وحجم البقعة ، والسطوع ، ومعدل الجرعة) في 5 حالات مختلفة من Latitude-S في البداية. يعتمد تكبير الثقوب أو حالات الشبكة على أحجام الثقوب في الشبكات المثقوبة أو أنواع الشبكات الثقوبية (على سبيل المثال، R2/2 أو R1.2/1.3 أو R 0.6/1). على سبيل المثال، حجم ثقب الشبكة نوع R0.6/1 هو 0.6 ميكرومتر، وحجم الثقب للشبكة R2/2 هو 2 ميكرومتر. وبالتالي، هناك حاجة إلى نوعين مختلفين من التكبير لتصور الثقوب بشكل صحيح لأنواع الشبكة R0.6/1 و R2/2 في الشبكة وحالات الثقب في Latitude-S.

لذلك، إعدادات التكبير لأنواع مختلفة من الشبكات في 5 حالات مختلفة ستكون متغيرة. حجم البقعة والسطوع تعتمد اعتمادا كبيرا على التكبير. ومن ثم، قد تتغير هذه القيم في قيم تكبير مختلفة. لذلك، فمن المستحسن لتحسين المعلمات المختلفة من 5 حالات مختلفة من Latitude-S باستخدام أنواع مختلفة من شبكات التبريد-EM قبل البدء في الحصول التلقائي على البيانات. ومع ذلك، بمجرد تحسين جميع المعلمات وحفظها، فمن السهل إعادة تحميل جميع المعلمات على أساس متطلبات المستخدم واستخدام Latitude-S في التكبيرات المختلفة أو أنواع الشبكة.

فائدة هامة لاستخدام K2 مع Latitude-S هو أن المستخدمين يمكن بسهولة تنظيم فتح / إغلاق صمام شعاع، إدراج / سحب الكاميرا، إدراج / سحب شاشة الفوسفور من المجهر، وتنظيم تعبئة النيتروجين السائل باستخدام واجهة المستخدم الرسومية من Latitude-S. ومع ذلك، لا يمكن الوصول إلى أي خيارات أخرى (مثل إمالة البندقية، وتحول البندقية، وتحول الحزمة، والنقاط المحورية، ومركز فتحة C2، ومركز الدوران، والمحاذاة الخالية من الغيبوبة) من خلال علامة التبويب K2 Latitude-S GUI Tab (الشكل التكميلي S1 والشكل 2). خلال ساعات طويلة من جمع البيانات، قد يتغير موضع الحزمة.

يمكن لشركة Latitude-S تنفيذ عمليات فحص وتصحيح دورية تلقائية لتتبع استقرار النظام طوال فترة الحصول على البيانات. يتم الحفاظ على استقرار النظام من خلال توسيط الحزمة وتحديث المراجع المظلمة. يضمن الفحص المستمر الجودة العالية للبيانات المكتسبة. في Latitude-S، يتم تصحيح الارتفاع المتمركز في الخطوط (Z-height) مرة واحدة فقط قبل جمع البيانات، ويتم حساب الارتفاع المركزى تلقائيا بواسطة Latitude-S عندما يغير مربع الشبكة. يتم قياس التركيز تلقائيا وتعديله استنادا إلى نطاق التركيز المحدد من قبل المستخدم. سيقوم البرنامج بإعادة تعيين موضع المرحلة Z إذا تجاوز قيمة العتبة المحددة. يتم التحكم في هذا الاستقرار من خلال لوحة "استقرار النظام". ومع ذلك ، مثل غيرها من حزم الحصول التلقائي على البيانات ، Latitude-S لديها أيضا بعض القيود.

لا يمكن ل Latitude-S حساب الارتفاع المتمركز في مركز الاتحاد الأوروبي (Z-height) إذا كانت الشبكة غير مستوية. في هذا السيناريو، لا يمكن تجميع أية بيانات أو قيم defocus سيكون خارج النطاق تماما. لذلك ، يجب على المستخدمين توخي الحذر الشديد لإعداد شبكاتهم دون أي انحناء وصورة فقط شبكات سطح مستو باستخدام Latitude-S. وعلاوة على ذلك ، على عكس Leginon ، SerialEM ، وUCSF - صورة ، Latitude - S ليست حزمة البرمجيات المتاحة بحرية. Latitude-S متوافق مع كاميرات Gatan، بما في ذلك كاميرات الكشف المباشر K2 وK3 وK3 المصفاة أو المستقلة، بالإضافة إلى كاميرات Rio و OneView. عيب مهم آخر للمستخدمين هو أنه غير متوافق مع ال DEDs شعبية أخرى مثل فالكون DED. ومع ذلك ، هذا ينطبق أيضا على وحدة معالجة الرسومات ، وهي حزمة برامج تلقائية أخرى للحصول على البيانات ، والتي تتوفر مع المجاهر المبردة ومتوافقة فقط مع كاميرا Falcon. ومع ذلك ، EPU هو أيضا وظيفية مع K2 / K3 مع مرشح الطاقة (BioQuantum K3 التصوير تصفية) ولكن ليس مع كاميرا K2 / K3 مستقل.

Latitude-S مشابهة تماما ل EPU، SerialEM، AutoEM، AutoEMation، وليجينون، والتي هي حزم البرمجيات المستخدمة للحصول على البيانات التلقائية لجسيمات واحدة cryo-EM. ومع ذلك، Latitude-S متوافق فقط مع K2 DED أو K3 DED أو BioQuantum K3 Imaging Filter. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير الدعم الفني المستمر من قبل الشركة لمستخدمي Latitude-S. هذا الدعم التقني مفيد لمجموعات المستخدمين الصغيرة ، الذين يحتاجون إلى استخدام أجهزة K2 DED أو K3 DED أو BioQuantum K3 Imaging Filter للحصول على البيانات وليس لديهم معرفة مسبقة حول كيفية إعداد أو استخدام حزم البرامج المجانية مثل SerialEM و Leginon.

هناك العديد من الميزات الأخرى، مثل حيود الإلكترون microcrystal (microED)، والتصوير المقطعي، وقياس الطيف بالأشعة السينية (EDS) المشتت للطاقة، والتي تتوفر في إصدارات أخرى مختلفة من Latitude. لذلك، يمكن للمستخدمين استخدام حزمة البرامج نفسها لجمع البيانات في أوضاع أخرى. على حد علمنا، جمع البيانات للميكروED، التصوير المقطعي، وEDS غير متوفر في وحدة معالجة الرسومات أو أي حزم البرامج الأخرى. لذلك، يمكن أن تكون حزمة برامج Latitude هذه مفيدة لأغراض مختلفة بالإضافة إلى الحصول التلقائي على البيانات في cryoEM أحادي الجسيمات. ومع ذلك ، SerialEM و Leginon ، وكلاهما حزم البرمجيات الحرة ، ومناسبة للصقور أو K2 / K3 الكاميرات ومفيدة للغاية للمستخدمين الجدد. ومع ذلك، Latitude-S غير متوفرة بحرية، والتي قد تكون عيبا من حزمة البرامج هذه.

وباختصار، فإن أداة الحصول التلقائي على البيانات Latitude-S جيدة مثل حزم برامج الحصول التلقائي على البيانات الأخرى (على سبيل المثال، EPU، Leginon، SerialEM، UCSF-Image). Latitude-S هي حزمة برامج الحصول على البيانات مستقرة للغاية وسهلة الاستخدام ، والتي تتوفر مع كاميرات الكشف المباشر K2 و K3 و K3 المصفاة أو المستقلة ، بالإضافة إلى كاميرات Rio و OneView.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح المتنافسة أو المالية للإعلان عنه.

Acknowledgments

نعترف بإدارة التكنولوجيا الحيوية، وإدارة العلوم والتكنولوجيا (DST) والعلوم، ووزارة تنمية الموارد البشرية (MHRD)، الهند، للتمويل ومرفق التبريد والتبريد في IISc-Bangalore. نعترف ببرنامج DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) وDST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) لمنشأة Cryo-EM الوطنية في IISc، بنغالور. نعترف بالدعم المالي المقدم من مجلس البحوث العلمية والهندسية (SERB) (المنحة رقم SB/S2/RJN-145/2015، SERB-EMR/2016/000608 وSrb-IPA/2020/000094)، DBT (المنحة رقم BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). نشكر السيدة إيشيكا برامانيك على إعداد شبكات التبريد و EM وجمع بيانات cryo-EM وإعداد جدول المواد. كما نشكر السيد سومان ميشرا على معالجة الصور بالتبريد ومساعدتنا في إعداد الأرقام. نشكر البروفيسور راغافان فاراداراجان لمساعدتنا في الحصول على عينة بروتين سبايك النقية لهذه الدراسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blotting paper Ted Pella, INC. 47000-100 EM specimen preparation item
Capsule Thermo Fisher Scientific 9432 909 97591 EM specimen preparation unit
Cassette Thermo Fisher Scientific 1020863 EM specimen preparation unit
C-Clip Thermo Fisher Scientific 1036171 EM specimen preparation item
C-Clip Insertion Tool Thermo Fisher Scientific 9432 909 97571 EM specimen preparation tool
C-Clip Ring Thermo Fisher Scientific 1036173 EM specimen preparation item
EM grid (Quantifoil) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow discharge Machine Quorum N/A Quorum GlowQube glow discharge machine
K2 DED Gatan Inc. N/A Cryo-EM data collection device (Camera)
Latitude S Software Gatan Inc. Imaging software
Loading station Thermo Fisher Scientific 1130698 EM specimen preparation unit
Talos 200 kV Arctica Thermo Scientific™ N/A Cryo-Electron Microscope
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A EM specimen preparation unit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  3. Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
  4. Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
  5. Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
  9. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  10. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  11. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  12. Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  15. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  16. Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
  17. Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
  18. Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  20. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  21. Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
  22. Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
  23. Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
  24. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
  25. Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
  26. Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
  27. Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
  28. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  29. Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
  30. Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 173، cryo-EM، Latitude-S، تحليل الجسيمات المفردة، السارس-CoV-2، سبايك-بروتين، تالوس القطب الشمالي
سهلة الاستخدام، عالية الإنتاجية، والآلية بالكامل برنامج الحصول على البيانات للجسيمات واحد Cryo-الإلكترون المجهر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, A., P., S., Gulati, S.,… More

Kumar, A., P., S., Gulati, S., Dutta, S. User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62832, doi:10.3791/62832 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter