Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

حقن الساركوما العظمية داخل الظنبوب لتوليد الساركوما العظمية العظمية ونماذج الفئران الخبيثة الرئوية

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63072
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education
* These authors contributed equally

Summary

يصف البروتوكول الحالي حقن الساركوما العظمية داخل الظنبوب لتوليد نماذج الفئران التي تحمل الساركوما العظمية العظمية وآفات الانبثاث الرئوي.

Abstract

الساركوما العظمية هي سرطان العظام الأولي الأكثر شيوعا لدى الأطفال والمراهقين، مع الرئتين باعتبارها الموقع النقيلي الأكثر شيوعا. معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات لمرضى الساركوما العظمية الذين يعانون من ورم خبيث رئوي أقل من 30٪. لذلك ، فإن استخدام نماذج الفئران التي تحاكي تطور الساركوما العظمية في البشر له أهمية كبيرة لفهم الآلية الأساسية لسرطان الساركوما العظمية والانبثاث الرئوي لتطوير علاجات جديدة. هنا ، يتم الإبلاغ عن إجراءات مفصلة لتوليد نماذج الساركوما العظمية الأولية والفئران الخبيثة الرئوية عن طريق الحقن داخل الظنبوب لخلايا الساركوما العظمية. جنبا إلى جنب مع التلألؤ الحيوي أو نظام التصوير الحي بالأشعة السينية ، يتم استخدام نماذج الفئران الحية هذه لمراقبة وقياس نمو الساركوما العظمية والانبثاث. لإنشاء هذا النموذج ، تم تحميل مصفوفة غشاء سفلي تحتوي على خلايا الساركوما العظمية في حقنة صغيرة الحجم وحقنها في ساق واحد من كل فأر أثيميك بعد تخديرها. تم التضحية بالفئران عندما وصلت الساركوما العظمية الأولية إلى الحد الأقصى للحجم في البروتوكول المعتمد من IACUC. تم فصل الساقين اللتين تحملان الساركوما العظمية والرئتين المصابتين بآفات الانبثاث. تتميز هذه النماذج بفترة حضانة قصيرة ، ونمو سريع ، وآفات حادة ، وحساسية في مراقبة تطور الآفات النقيلية الأولية والرئوية. لذلك ، هذه نماذج مثالية لاستكشاف وظائف وآليات عوامل محددة في تسرطن الساركوما العظمية والانبثاث الرئوي ، والبيئة الدقيقة للورم ، وتقييم الفعالية العلاجية في الجسم الحي.

Introduction

الساركوما العظمية هي سرطان العظام الأولي الأكثر شيوعا لدى الأطفال والمراهقين 1,2 ، والذي يتسلل بشكل رئيسي إلى الأنسجة المحيطة ، وحتى ينتقل إلى الرئتين عند تشخيص المرضى. الانبثاث الرئوي هو التحدي الرئيسي لعلاج الساركوما العظمية ، ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات لمرضى الساركوما العظمية الذين يعانون من ورم خبيث رئوي لا يزال منخفضا يصل إلى 20٪ -30٪ 3،4،5. ومع ذلك ، فقد زاد معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات من الساركوما العظمية الأولية إلى حوالي 70 ٪ منذ 1970s بسبب إدخال العلاج الكيميائي6. لذلك ، هناك حاجة ماسة لفهم الآلية الأساسية لسرطان الساركوما العظمية والانبثاث الرئوي لتطوير علاجات جديدة. تطبيق نماذج الفئران التي تحاكي أفضل تطور الساركوما العظمية في البشر له أهمية كبيرة7.

يتم إنشاء النماذج الحيوانية للساركوما العظمية عن طريق الهندسة الوراثية التلقائية المستحثة ، والزرع ، وغيرها من التقنيات. نادرا ما يستخدم نموذج الساركوما العظمية التلقائي بسبب وقت تكوين الورم الطويل ، ومعدل حدوث الورم غير المتناسق ، وانخفاض المراضة ، وضعف الاستقرار 8,9. على الرغم من أن نموذج الساركوما العظمية المستحثة يمكن الحصول عليه أكثر سهولة من الساركوما العظمية التلقائية ، إلا أن تطبيق نموذج الساركوما العظمية المستحثة محدود لأن العامل المحث سيؤثر على البيئة الدقيقة ، والتسبب في الأمراض ، والخصائص المرضية للساركوما العظمية10. تساعد النماذج المعدلة وراثيا على فهم التسبب في السرطانات لأنها يمكن أن تحاكي بشكل أفضل البيئات الفسيولوجية والمرضية البشرية. ومع ذلك ، فإن النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا لها أيضا حدودها بسبب صعوبة التعديل المعدل وراثيا على المدى الطويل والتكلفة العالية. علاوة على ذلك ، حتى في النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا الأكثر قبولا على نطاق واسع الناتجة عن تعديل الجينات p53 و Rb ، حدث 13.6٪ فقط من الساركوما في عظام الأطراف الأربعة11,12.

زرع هي واحدة من أكثر الطرق شيوعا لإنتاج نموذج السرطان النقيلي الأولي والبعيد في السنوات الأخيرة بسبب المناورة البسيطة ، ومعدل تكوين الورم المستقر ، والتجانس الأفضل13. يشمل الزرع زراعة غير متجانسة وزرع العظام وفقا لمواقع الزرع. في زرع الساركوما العظمية غير المتجانسة، يتم حقن خلايا الساركوما العظمية خارج مواقع الساركوما العظمية الأولية (العظام) للحيوانات، عادة تحت الجلد، تحت الجلد14. على الرغم من أن عملية زرع الساركوما غير المتجانسة واضحة دون الحاجة إلى إجراء عملية جراحية في الحيوانات ، إلا أن المواقع التي يتم فيها حقن خلايا الساركوما العظمية لا تمثل البيئة الدقيقة الفعلية للساركوما العظمية البشرية. زرع الساركوما العظمية هو عندما يتم حقن خلايا الساركوما العظمية في عظام الحيوانات، مثل الساق15،16. بالمقارنة مع الطعوم غير المتجانسة ، تتميز الطعوم العظمية العظمية بفترة حضانة قصيرة ، ونمو سريع ، وطبيعة تآكل قوية. لذلك ، فهي نماذج حيوانية مثالية للدراسات المتعلقة بالساركوما العظمية17.

الحيوانات الأكثر استخداما هي الفئران والكلاب وأسماك الزرد18,19. عادة ما يستخدم النموذج التلقائي للساركوما العظمية في الأنياب لأن الساركوما العظمية هي واحدة من أكثر الأورام شيوعا في الأنياب. ومع ذلك ، فإن تطبيق هذا النموذج محدود بسبب وقت تكوين الورم الطويل ، وانخفاض معدل تكوين الورم ، وضعف التجانس ، والاستقرار. غالبا ما تستخدم أسماك الزرد لبناء نماذج الورم المعدلة وراثيا أو بالضربة القاضية بسبب تكاثرها السريع20. لكن جينات الزرد تختلف عن الجينات البشرية ، لذلك فإن تطبيقاتها محدودة.

يصف هذا العمل الإجراءات التفصيلية والاحتياطات والصور التمثيلية لإنتاج الساركوما العظمية الأولية في الساق مع ورم خبيث رئوي عن طريق الحقن داخل الساق لخلايا الساركوما العظمية في الفئران الأثيمية. تم تطبيق هذه الطريقة لإنشاء الساركوما العظمية الأولية في ساق الفئران لتقييم الفعالية العلاجية ، والتي أظهرت قابلية عالية للتكاثر21,22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان بجامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي. تأقلمت الفئران الأثيمية الذكور BALB / c البالغة من العمر أربعة أسابيع لمدة أسبوع قبل الجراحة للحقن التقويمي لخلايا الساركوما العظمية. تم إيواء الفئران في أقفاص الفئران ذات التهوية الفردية مع خمسة فئران لكل قفص في دورة ضوئية / مظلمة مدتها 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى تغذية SPF والمياه المعقمة.

1. إعداد الخلايا

  1. في يوم حقن الخلايا العظمية الساركوما (143B-Luciferase) ، اغسل 80٪ -90٪ من الخلايا المتقاربة المزروعة في طبق زراعة خلايا 10 سم مرتين باستخدام PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) والتريبسينيز مع 1.5 مل من 0.25٪ من التربسين لمدة 3 دقائق. ثم ، أضف 6 مل من وسائط MEM المحتوية على مصل بنسبة 10٪ لإخماد التربسين ، وجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي 15 مل.
    ملاحظة: يتم الحصول على خط خلية 143B-Luciferase من خط الخلية 143B transfect مع متجه pLV-luciferase23.
  2. استنشاق 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى غرفة لوحة عد الخلايا وحساب تركيز الخلية باستخدام عداد خلية تلقائي (انظر جدول المواد).
  3. الطرد المركزي للخلايا في 800 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. استنشاق السوبرناتانت باستخدام ماصة وأعد تعليق حبيبات الخلية في مصفوفة غشاء سفلي 8.5 ملغم / مل (انظر جدول المواد) إلى تركيز نهائي قدره 2 × 107 خلايا / مل.
  5. الحفاظ على الخلايا على الجليد ، وإحضارها إلى غرفة الجراحة. يجب استخدام الخلايا في غضون 2 ساعة.
    ملاحظة: لتجنب جرعات الحقن غير الدقيقة (على سبيل المثال ، بسبب المساحة الميتة في المحاقن) ، يتم إعداد تعليق خلوي إضافي (عادة ما يكون ضعف الحجم المطلوب لتعليق الخلية). يتم الاحتفاظ بمصفوفة الغشاء السفلي على الجليد طوال الوقت لأنها تحتوي على خاصية التخثر فوق درجة حرارة الغرفة24.

2. جراحة الحقن التقويمي لخلايا الساركوما العظمية

ملاحظة: يتم عرض أدوات الجراحة في الشكل 1.

  1. تم تربية الفئران في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض. تم تنفيذ جميع الإجراءات في خزانة معقمة بأدوات معقمة.
  2. تخدير الفئران عن طريق تعريضها ل 2٪ من الإيسوفلوران و 98٪ من الأكسجين (معدل تدفق الأكسجين ، 2 لتر / دقيقة).
  3. ضع كمية صغيرة من مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
    ملاحظة: نفذ الإجراء بأكمله في منطقة جيدة التهوية. قبل حقن خلايا الساركوما العظمية ، تأكد من أن كل فأر يخضع للتخدير العميق بواسطة قرصة إصبع القدم ؛ إذا كان الماوس لا يزال لديه استجابات ، مثل الارتعاش أو الرعشة ، فانتظر لفترة طويلة حتى تختفي الاستجابات المذكورة أعلاه.
  4. حافظ على كل ماوس في وضع ضعيف. امسك كاحل الماوس باستخدام الإبهام والسبابة وقم بتطهير موقع حقن الساق باستخدام مسحة إيثانول بنسبة 70٪.
    ملاحظة: لتثبيت كاحل الماوس بإحكام، فإن كلا من أطراف أصابع الإبهام والسبابة لهما أهمية كبيرة للإجراءات اللاحقة.
  5. قم بتدوير مفصل الكاحل لكل ماوس إلى الخارج لتحريك الساق والشظية ، وثني مفصل الركبة إلى وضع مناسب حتى تكون هضبة الساق القريبة (الجزء العلوي من الساق) مرئية بوضوح من خلال الجلد (الشكل 2A).
  6. قم بتوصيل الإبرة بحقنة 1 مل ووجه طرف الإبرة نحو موقع الحقن. تأكد من أن إبرة المحقنة موازية للمحور الطويل للساق.
    1. أدخل الإبرة عن طريق الجلد من خلال الرباط الرضفي أو المجاور له أثناء مروره عبر كبسولة الجلد / المفصل ؛ th0en ، قم بتدوير المحقنة (1/2 إلى 3/4-دائرة) لحفر ثقب من خلال منصة الساق نحو الطرف البعيد من الساق (التجويف النخاعي) لحقن خلية الساركوما العظمية باستخدام حقنة صغيرة الحجم (الشكل 2B ، C).
      ملاحظة: يمكن الشعور بالدوران المتزامن للساق أثناء الحفر إذا كان طرف الإبرة دقيقا. تأكد من أن الإبر تتحرك إلى الأمام مع دوران المحقنة بدلا من دفعها مباشرة إلى الأمام حتى يكون حوالي نصف الإبرة في الساق.
  7. تحقق مما إذا كانت إبرة المحقنة قد قامت بحركة بارزة في القناة النخاعية لضمان نجاح الحفر.
    ملاحظة: قم بإجراء فحص بالأشعة السينية (انظر جدول المواد) للتأكد من الموضع المناسب للإبرة وجمع الصور.
  8. قم بتحميل تعليق خلية الساركوما العظمية 143B (من الخطوة 1.5) في حقنة صغيرة الحجم واستبدل حقنة 1 مل في الساق بحقنة صغيرة الحجم محملة بالخلايا 143B (الشكل 2D). حقن ببطء ~ 10 ميكرولتر (تجاهل الحل الموجود مسبقا في الإبرة) من تعليق الخلايا 143B في الساق كل ماوس أثيميك (حوالي 2 × 105 خلايا) دون تطبيق ضغط عال.
  9. اضغط على موقع الحقن بقطعة قطن لمدة 20-30 ثانية عند إزالة المحقنة صغيرة الحجم.
  10. ضع كل ماوس مرة أخرى في قفص نظيف وراقب عن كثب حتى يتم استرداد الماوس تماما من التخدير (حوالي 10 دقائق).
  11. راقب نمو الورم في الجسم الحي باستخدام نظام التصوير بالأشعة السينية. قم بقياس القطر الأطول (a) والقطر القصير (b) لكتلة السرطان كل أسبوع باستخدام فرجار لحساب حجم الورم (V): V = 1/2 × a x b2.
    ملاحظة: تخدير الفئران عن طريق تعريضها ل 2٪ من الأيزوفلوران و 98٪ من الأكسجين. تم تخدير الفئران للتصوير بالأشعة السينية. يتيح حقن داخل الظنبوب من لوسيفيراز أو بروتين الفلورسنت المسمى خلايا الساركوما العظمية تتبع آفات الساركوما العظمية الأولية والنقيلية.
    ملاحظة: استندت نقاط النهاية الإنسانية للفئران المصابة بالساركوما العظمية بسبب نمو الورم في الركبة وورم خبيث في الرئة إلى المعايير التالية: (1) درجة حالة الجسم ، (2) عتبة فقدان الوزن بنسبة 20٪ ، (3) متوسط القطر الأقصى للأورام البالغ 2 سم ، أو (4) سلوك حيواني محدود للغاية.

3. الفحص المرضي (جمع عينة الساركوما العظمية النقيلية الأولية والرئوية للتحليل)

  1. بعد ستة أسابيع من حقن خلايا الساركوما العظمية ، ضحى بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم بعد تعريضها لاستنشاق CO2 .
  2. حافظ على الماوس في وضع ضعيف وقم بتمديد كل من الأطراف الخلفية.
  3. افصل الساقين بالكامل اللتين تحملان الساركوما العظمية عن المنطقة الأربية.
    ملاحظة: تأكد من فصل جميع الأرجل عن نفس الموقع التشريحي.
  4. قم بإعداد العينة النسيجية للأرجل التي تحمل الساركوما العظمية عن طريق إزالة الجلد والعضلات والقدمين ، ثم قم بإصلاح عينة كل فأر في أنبوب 50 مل مع محلول الفورمالين 20 مل (10٪) لمدة 24 ساعة ، يليه إزالة الكلس في محلول EDTA بنسبة 10٪ لمدة 14 يوما مع تغيير المخزن المؤقت من حين لآخر.
  5. تضمين العينة في البارافين وإعداد أقسام للفحص النسيجي بعد العمل المنشور سابقا25.
  6. افصل الرئتين بلطف وضعهما في أنبوب سعة 50 مل مملوء بمحلول فورمالين سعة 20 مل (10٪). بعد 24 ساعة ، انقل رئتي كل فأر إلى أنبوب 15 مل مع 70٪ من الإيثانول. تضمين الرئتين في البارافين لتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) والكيمياء النسيجية المناعية25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تعتمد الساركوما العظمية الناجحة (الأولية) والنماذج الرئوية النقيلية على الحقن التقويمي الدقيق لخلايا الساركوما العظمية. هنا ، تم تطوير نموذج الساركوما العظمية (الأولية) عن طريق حقن خلايا الساركوما العظمية داخل الظنبوب بنجاح. يوضح الشكل 3A ساركوما عظمية تمثيلية تحمل الساركوما العظمية (الأولية)، ويبين الشكل 3B ساركوما عظمية معزولة (أولية) تمثيلية. تم قياس حجم الورم مرة واحدة في الأسبوع باستخدام الفرجار وحسابه كما هو موضح في الخطوة 2.11 (الشكل 3C). تم تتبع نمو الساركوما العظمية (الأولية) في الجسم الحي بواسطة كل من الأشعة السينية والتلألؤ الحيوي (عندما تم تصنيف الخلايا المحقونة باللوسيفيراز) نظام التصوير الحي. تم الحصول على صور الأشعة السينية من الأسبوع الأول إلى الأسبوع السادس بعد حقن خلايا الساركوما العظمية 143B (الشكل 3D). علاوة على ذلك ، تم الحصول على صورة نمو الساركوما العظمية (الأولية) في الجسم الحي بعد حقن لوسيفيراز المسمى 143B الخلايا في ساق الفأر (الشكل 3E).

تم تتبع الانبثاث الرئوي الناجم عن الحقن داخل الظنبوب لخلايا الساركوما العظمية المسماة luciferase بنجاح في الجسم الحي بواسطة نظام تصوير حي للتلألؤ الحيوي (الشكل 4A). كما تم تصور المستعمرات النقيلية في أنسجة الرئة المعزولة تحت المجهر المجسم (الشكل 4B). تم تأكيد الآفات النقيلية بشكل أكبر من خلال تلطيخ H & E على أنسجة الرئة المضمنة في البارافين (الشكل 4C).

Figure 1
الشكل 1: أدوات الجراحة. (أ) حقنة مقياس 1 مل. (ب) حقنة صغيرة الحجم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تمثيل جراحة الحقن داخل الظنبوب. (أ) موقع الحقن داخل الظنبوب لفأر أثيمي. (ب) تم إدخال حقنة معقمة سعة 1 مل مع إبرة مصحوبة عن طريق الجلد في الساق باتجاه الطرف البعيد عبر هضبة الساق القريبة (أعلى الساق). (ج) عرض جانبي لعملية الحفر. كانت إبرة المحقنة موازية لمحور الساق الطويل (الخط الصلب). (د) الحقن داخل الساق باستخدام حقنة صغيرة الحجم محملة بخلية الساركوما العظمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تصور نمو الساركوما العظمية في الفئران . (أ) نموذج الساركوما العظمية التقويمية الناجحة للفئران. (ب) الساركوما العظمية العظمية المعزولة. (ج) تم قياس حجم الورم باستخدام الفرجار وحسابه باستخدام الصيغة التالية: حجم الورم = 0.5 × قطر أطول × قطر قصير × قطر قصير. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (n = 8). (د) تم الحصول على صور الأشعة السينية من نفس الماوس في وقت مختلف (من 1-6 أسابيع). (ه) صورة تم الحصول عليهافي اليوم 28 بعد حقن لوسيفيراز المسمى 143B الخلايا في ساق الفأر. أشارت الأسهم الحمراء إلى شدة تلألؤ الساركوما العظمية (الأولية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: ورم خبيث رئوي من الساركوما العظمية. (أ) صورة تم الحصول عليهافي اليوم 28 بعد حقن لوسيفيراز المسمى 143B الخلايا في الساق الفأر. أشارت الأسهم الحمراء إلى شدة التلألؤ للنقائل الرئوية. (ب) الرئتين المعزولتين مع نقائل الساركوما العظمية. أشارت الأسهم الحمراء إلى المستعمرات النقيلية (x20). (C) أظهر تلطيخ H & E آفات نقلية في أنسجة الرئة (شريط المقياس = 200 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الحقن التقويمي لخلايا الساركوما العظمية هو نموذج مثالي لدراسة وظيفة وآلية عوامل محددة في تسرطن الساركوما العظمية وتطويرها لتقييم الفعالية العلاجية. لتجنب الاختلافات في نمو الورم ، يتم حقن معظم خلايا الساركوما العظمية النشطة بنسبة 80٪ -90٪ تلتقي بنفس العدد بعناية في ساق كل فأر ، ويتم التحكم بدقة في وقت التربسين الخلوي دون التأثير على بقاء الخلية. نظرا لأن كتل الخلايا تؤثر على عد الخلايا مما يؤدي إلى حقن أعداد خلايا غير دقيقة في ساق كل فأر ، يجب خلط تعليق الخلية بشكل مناسب لأعلى ولأسفل مع ماصة لتجنب تكوين كتل الخلايا.

جانب حاسم آخر يجب مراعاته هو الحل المعاد تعليقه لخلايا الساركوما العظمية. يتم إعادة تعليق الخلايا المحقونة في مصفوفة غشاء قبو بدلا من PBS أو وسط الثقافة. علاوة على ذلك ، فإن التركيز العالي لمصفوفة الغشاء السفلي يمثل تحديا في الماصة ويؤثر على الحجم الدقيق ؛ وبالتالي ، يلزم تركيز مناسب لمصفوفة الغشاء السفلي26. لحفر ثقب من خلال منصة الساق لحقن خلايا الساركوما العظمية ، تتحرك الإبر إلى الأمام مع دوران المحقنة بدلا من دفعها مباشرة إلى الأمام حتى يكون حوالي نصف الإبرة في الساق. وبشكل أكثر تحديدا ، يتم تطبيق الفئران التي تعاني من نقص المناعة لإنشاء نموذج الساركوما العظمية العظمية باستخدام خلايا الساركوما العظمية البشرية27. وفي الوقت نفسه ، يتم إجراء إجراء الحقن في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام أدوات جراحية معقمة. نظرا لأن الفئران قد تعاني من عدم الارتياح بعد التخدير والجراحة ، يجب مراقبة الفئران عن كثب في الأسبوع الأول بعد الجراحة.

يتيح حقن داخل الظنبوب لخلايا الساركوما العظمية الموسومة بالبروتين الفلوري أو اللوسيفيراز تتبع الآفات الأولية والنقيلية باستخدام التصوير البصري28. لا يسمح أبدا بالساركوما العظمية خارج حد الحجم كما هو الحال في البروتوكول المعتمد من IACUC ؛ وفي الوقت نفسه ، قد تحدث تقرحات في كتلة الورم ذات الحجم الهائل ، مما قد يؤدي إلى فشل التحليلات الكيميائية المناعية. على الرغم من أن أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام قد تم الإبلاغ عنها مؤخرا عن طريق زرع طعم الورم الصلب في العظام ، وطورت الحيوانات نموا قابلا للتكرار ، وكذلك ورم خبيث في الرئة في نهاية المطاف29 ؛ ومع ذلك ، قام المؤلفون مباشرة بزرع شظايا ورم جديدة أو محفوظة بالتبريد في الساق القريبة ، والتي أظهرت أن عيوب الجراحة المفتوحة تسببت في عدوى محتملة وفشل في تطوير تطعيم الورم. علاوة على ذلك ، فإن حجم شظايا الورم المزروعة دون رقابة صارمة سيؤدي إلى اختلاف كبير في حجم الورم المنتج ، وهو أمر صعب في متابعة التطبيق ، مثل تقييم الفعالية العلاجية في الجسم الحي. هنا ، يتم الإبلاغ عن تقنية بسيطة وقابلة للتكرار لإنشاء الساركوما العظمية الأولية داخل الظنبوب مع نماذج فأر خبيثة رئوية لاحقة عن طريق حقن داخل الظنبوب لخلايا الساركوما العظمية. أظهر هذا مزايا أفضل محاكاة لخصائص التطور السريري للساركوما العظمية في البشر. أرقام دقيقة من خلايا الساركوما العظمية التي يتم حقنها مباشرة في الساق باستخدام حقنة صغيرة الحجم تسمح بمعدل تكوين ورم متطابق (100٪) وحجم الورم. تضمن هذه الطريقة تجنب احتمالات العدوى أو حتى الموت باستخدام تقنيات الجراحة المفتوحة والسماح بمراقبة حيوية وقياس نمو الساركوما العظمية وورم خبيث باستخدام نظام التصوير الحي للتلألؤ الحيوي بعد تسمية خلايا الساركوما العظمية المحقونة بالتلألؤ الحيوي. هذا يمنع خلايا الساركوما العظمية المحقونة من الوصول مباشرة إلى مجرى الدم والاستعمار في الرئتين لتشكيل انسداد رئوي و / أو ورم خبيث رئوي إيجابي كاذب عن طريق إعادة تعليق خلايا الساركوما العظمية المحقونة بتركيز مناسب من مصفوفة الغشاء السفلي لأن مصفوفة الغشاء السفلي لها خاصية التخثر فوق درجة حرارة الغرفة. يدعم التخثر الفوري ويقيد خلايا الساركوما العظمية داخل مصفوفة الغشاء السفلي بعد حقنها في ساق الفأر.

وقد أبلغت أدبيات أخرى عن إنشاء نموذج ورم خبيث في العظام عن طريق التلقيح داخل القلب أو التلقيح داخل الساق لخلايا سرطان الثدي30; ومع ذلك ، فإن الخلايا المستخدمة في هذه الأدبيات هي خلايا سرطان الثدي ، والتي لها خصائص بيولوجية وسريرية مختلفة مع خلايا الساركوما العظمية. علاوة على ذلك ، يتم تشكيل كل من نماذج السرطان داخل القلب والتلقيح داخل الظنبوب في العظام عن طريق استعمار الخلايا السرطانية مباشرة أو الوصول إليها عبر مجرى الدم بدلا من آفات الانبثاث التي يشكلها انتشار الخلايا السرطانية من الآفات السرطانية الأولية.

هناك العديد من القيود على البروتوكول الحالي. الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول هي الفئران الوراثية التي تشوب الجهاز المناعي الفئران العارية بدون الغدة الصعترية التي تمنعها من رفض الخلايا البشرية من الناحية المناعية وتستخدم على نطاق واسع في التجارب قبل السريرية ، والتي لا تنطبق على البحوث الوظيفية المناعية. علاوة على ذلك ، وجدنا أنه ليس كل خطوط خلايا الساركوما العظمية ذات صلة متطابقة في هذه النماذج ، وأن قدرات تكوين الأورام في خلايا 143B و MNG و MG-63 و U-2 OS أعلى من خلايا Saos-2.

في الختام ، فإن نماذج الساركوما العظمية النقيلية الأولية والرئوية الحالية الناتجة عن حقن خلايا الساركوما العظمية العظمية هي أدوات مفيدة لدراسة البيئة الدقيقة للورم ، وفعالية العلاجات على نمو الساركوما العظمية و / أو الانبثاث. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال الحقن داخل الساق لخلايا الساركوما العظمية المعدلة وراثيا التي تستهدف الجين على وجه التحديد ، فإن النماذج مفيدة لاستكشاف الجينات السرطانية الرئيسية ومثبطات الورم في نمو الساركوما العظمية والانبثاث الرئوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية منافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من (1) البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2018YFC1704300 و 2020YFE0201600) ، (2) المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة (81973877 و 82174408).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic cell counter Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd IC1000 Counting cells
Anesthesia machine Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd R500IP The Equipment of Anesthesia mice
BALB/c athymic mice Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. / animal
Basement Membrane Matrix Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd 356234, BD, Matrigel re-suspende cells
Bioluminescence imaging system Shanghai Baitai Technology Co., Ltd Vieworks tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase
Centrifuge tube (15 mL) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, Corning Centrifuge the cells
isoflurane Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd VETEASY Anesthesia mice
MEM media Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd LM-E1141 Cell culture medium
Micro-volume syringe Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd 0-50 μL Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline Beyotime Biotechnology ST447 wash the human osteosarcoma cells
1ml syringes Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd 20200411 drilling
143B cell line ATCC CRL-8303 osteosarcoma cell line
Trypsin (0.25%) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 25200056, Gibco trypsin treatment of cells
Trypan blue Beyotime Biotechnology ST798 Staining cells to assess activity
vector (pLV-luciferase) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd VL3613 Plasmid
Lipofectamine 2000 Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 11668027,Thermo fisher Plasmid transfection reagent
X-ray imaging system Brook (Beijing) Technology Co., Ltd FX PRO X-ray images were obtained to detect tumor growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
  2. Yang, C., et al. Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).
  3. Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).
  4. Zhang, B., et al. The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51 (2020).
  5. Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation. Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).
  6. Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases. Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).
  7. Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
  8. Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets. Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).
  9. Mason, N. J. Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).
  10. Cobb, L. M. Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man. British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).
  11. Walkley, C. R., et al. Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease. Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).
  12. Entz-Werlé, N., et al. Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease. Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).
  13. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
  14. Chang, J., et al. MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).
  15. Maloney, C., et al. Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model. Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
  16. Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
  17. Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected]. Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).
  18. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).
  19. Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement. The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).
  20. Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. Zebrafish as a model for human osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).
  21. Hu, S., et al. Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation. International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).
  22. Chang, J., et al. Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 7605 (2017).
  23. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  24. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).
  25. Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
  26. Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
  27. Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
  28. Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
  29. Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone. Journal of Visualized Experiments. (163), e61313 (2020).
  30. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 176،
حقن الساركوما العظمية داخل الظنبوب لتوليد الساركوما العظمية العظمية ونماذج الفئران الخبيثة الرئوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J., Zhao, F., Sun, X., Ma,… More

Chang, J., Zhao, F., Sun, X., Ma, X., Zhi, W., Yang, Y. Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models. J. Vis. Exp. (176), e63072, doi:10.3791/63072 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter