Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Intratibia-Osteosarkom-Zellinjektion zur Generierung von Mausmodellen mit orthotopen Osteosarkom- und Lungenmetastasenläsionen.
Abstract
Das Osteosarkom ist der häufigste primäre Knochenkrebs bei Kindern und Jugendlichen, wobei die Lunge die häufigste metastasierende Stelle ist. Die Fünf-Jahres-Überlebensrate von Osteosarkom-Patienten mit Lungenmetastasen beträgt weniger als 30%. Daher ist die Verwendung von Mausmodellen, die die Osteosarkomentwicklung beim Menschen nachahmen, von großer Bedeutung für das Verständnis des grundlegenden Mechanismus der Osteosarkomkarzinogenese und Lungenmetastasierung zur Entwicklung neuartiger Therapeutika. Hier werden detaillierte Verfahren berichtet, um die primären Osteosarkom- und Lungenmetastasen-Mausmodelle über die Intratibia-Injektion von Osteosarkom-Zellen zu erzeugen. In Kombination mit dem Biolumineszenz- oder Röntgen-Live-Imaging-System werden diese lebenden Mausmodelle verwendet, um das Wachstum und die Metastasierung von Osteosarkomen zu überwachen und zu quantifizieren. Um dieses Modell zu etablieren, wurde eine Basalmembranmatrix, die Osteosarkomzellen enthielt, in eine Mikrovolumenspritze geladen und nach der Anästhesie in eine Tibia jeder athymischen Maus injiziert. Die Mäuse wurden geopfert, als das primäre Osteosarkom die Größenbeschränkung im IACUC-genehmigten Protokoll erreichte. Die Beine mit Osteosarkom und die Lunge mit Metastasenläsionen wurden getrennt. Diese Modelle zeichnen sich durch eine kurze Inkubationszeit, schnelles Wachstum, schwere Läsionen und Empfindlichkeit bei der Überwachung der Entwicklung primärer und pulmonaler metastasierender Läsionen aus. Daher sind dies ideale Modelle, um die Funktionen und Mechanismen spezifischer Faktoren in der Osteosarkom-Karzinogenese und Lungenmetastasierung, der Tumormikroumgebung und der Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit in vivo zu untersuchen.
Introduction
Das Osteosarkom ist der häufigste primäre Knochenkrebs bei Kindern und Jugendlichen1,2, der hauptsächlich das umliegende Gewebe infiltriert und sogar in die Lunge metastasiert, wenn die Patienten diagnostiziert werden. Lungenmetastasen sind die größte Herausforderung für die Osteosarkom-Therapie, und die Fünf-Jahres-Überlebensrate von Osteosarkom-Patienten mit Lungenmetastasen bleibt so niedrig wie 20% -30% 3,4,5. Die Fünf-Jahres-Überlebensrate des primären Osteosarkoms ist jedoch seit den 1970er Jahren aufgrund der Einführung der Chemotherapie auf etwa 70% gestiegen6. Daher ist es dringend notwendig, den grundlegenden Mechanismus der Osteosarkom-Karzinogenese und Lungenmetastasierung zu verstehen, um neuartige Therapien zu entwickeln. Die Anwendung von Mausmodellen, die das Fortschreiten des Osteosarkoms beim Menschen am besten nachahmen, ist von großer Bedeutung7.
Die Osteosarkom-Tiermodelle werden durch spontane, induzierte Gentechnik, Transplantation und andere Techniken erzeugt. Das Modell des spontanen Osteosarkoms wird aufgrund der langen Tumorbildungszeit, der inkonsistenten Tumorauftretensrate, der geringen Morbidität und der schlechten Stabilität selten verwendet 8,9. Obwohl das induzierte Osteosarkommodell zugänglicher ist als das spontane Osteosarkom, ist die Anwendung des induzierten Osteosarkommodells begrenzt, da der induzierende Faktor die Mikroumgebung, die Pathogenese und die pathologischen Merkmale des Osteosarkoms10 beeinflusst. Transgene Modelle helfen, die Pathogenese von Krebs zu verstehen, da sie die physiologischen und pathologischen Umgebungen des Menschen besser simulieren können; Die transgenen Tiermodelle haben jedoch auch ihre Grenzen aufgrund der Schwierigkeit, der langfristigen und der hohen Kosten der transgenen Modifikation. Darüber hinaus traten selbst in den am weitesten verbreiteten transgenen Tiermodellen, die durch p53- und Rb-Genmodifikation erzeugt wurden, nur 13,6% des Sarkoms in den vier Gliedmaßenknochenauf 11,12.
Die Transplantation ist aufgrund ihres einfachen Manövers, der stabilen Tumorbildungsrate und der besseren Homogenität in den letzten Jahren eine der am häufigsten verwendeten primären und fernmetastasierenden Krebsmodell-produzierenden Methoden13. Die Transplantation umfasst die heterotope Transplantation und die orthotope Transplantation entsprechend den Transplantationsstellen. Bei der heterotopen Osteosarkomtransplantation werden die Osteosarkomzellen außerhalb der primären Osteosarkomstellen (Knochen) der Tiere, üblicherweise unter die Haut, subkutan14 injiziert. Obwohl die heterotope Transplantation unkompliziert ist, ohne dass eine Operation an Tieren durchgeführt werden muss, stellen die Stellen, an denen die Osteosarkomzellen injiziert werden, nicht die tatsächliche Mikroumgebung des menschlichen Osteosarkoms dar. Osteosarkom orthotope Transplantation ist, wenn die Osteosarkom-Zellen in die Knochen der Tiere, wie Tibia15,16, injiziert werden. Im Vergleich zu den heterotopen Transplantaten zeichnen sich orthotope Osteosarkomtransplantate durch eine kurze Inkubationszeit, schnelles Wachstum und starke erosive Natur aus; Daher sind sie ideale Tiermodelle für osteosarkombezogene Studien17.
Die am häufigsten verwendeten Tiere sind Mäuse, Hunde und Zebrafische18,19. Das spontane Modell des Osteosarkoms wird normalerweise bei Hunden verwendet, da das Osteosarkom einer der häufigsten Tumoren bei Hunden ist. Die Anwendung dieses Modells ist jedoch aufgrund der langen Tumorbildungszeit, der niedrigen Tumorentstehungsrate, der schlechten Homogenität und Stabilität begrenzt. Zebrafische werden aufgrund ihrer schnellen Reproduktion häufig zur Konstruktion transgener oder Knockout-Tumormodelleverwendet 20. Aber Zebrafischgene unterscheiden sich von menschlichen Genen, so dass ihre Anwendungen begrenzt sind.
Diese Arbeit beschreibt die detaillierten Verfahren, Vorsichtsmaßnahmen und repräsentativen Bilder zur Erzeugung des primären Osteosarkoms in der Tibia mit pulmonaler Metastasierung durch Intratibia-Injektion von Osteosarkom-Zellen in athymischen Mäusen. Diese Methode wurde angewendet, um das primäre Osteosarkom in Maus-Tibia für die therapeutische Wirksamkeitsbewertung zu erzeugen, die eine hohe Reproduzierbarkeitzeigte 21,22.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Tierschutzkomitee der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine genehmigt. Vier Wochen alte männliche BALB / c-athymische Mäuse wurden eine Woche lang vor der Operation zur orthotopen Injektion von Osteosarkomzellen akklimatisiert. Die Mäuse wurden in individuell belüfteten Mäusekäfigen mit fünf Mäusen pro Käfig in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit Ad-libitum-Zugang zu SPF-Futter und sterilem Wasser untergebracht.
1. Vorbereitung der Zellen
- Am Tag der Injektion von Osteosarkomzellen (143B-Luciferase) waschen Sie 80% -90% konfluierende Zellen, die in einer 10 cm Zellkulturschale kultiviert wurden, zweimal mit PBS (pH 7,4) und trypsinisieren Sie mit 1,5 ml 0,25% Trypsin für 3 min. Dann fügen Sie 6 ml 10% serumhaltige MEM-Medien hinzu, um das Trypsin abzuschrecken, und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
HINWEIS: 143B-Luciferase-Zelllinie wird aus 143B-Zelllinientransfekt mit pLV-Luciferase-Vektor23 erhalten. - Saugen Sie 20 μL Zellsuspension in die Zellzählkammer und berechnen Sie die Zellkonzentration mit einem automatischen Zellzähler (siehe Materialtabelle).
- Zentrifen Sie die Zellen bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Zellpellet in einer 8,5 mg/ml-Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle) auf eine Endkonzentration von 2 x 107 Zellen/ml.
- Halten Sie die Zellen auf Eis und bringen Sie sie in den Operationssaal. Die Zellen sind innerhalb von 2 h zu verwenden.
HINWEIS: Um ungenaue Injektionsdosen zu vermeiden (z. B. aufgrund des Totraums in Spritzen), wird eine zusätzliche Zellsuspension hergestellt (normalerweise das Doppelte des erforderlichen Zellsuspensionsvolumens). Die Basalmembranmatrix wird die ganze Zeit auf Eis gehalten, da sie oberhalb der Raumtemperatur24 eine Gerinnungseigenschaft aufweist.
2. Operation zur orthotopen Injektion der Osteosarkomzellen
HINWEIS: Die chirurgischen Werkzeuge sind in Abbildung 1 dargestellt.
- Mäuse wurden unter bestimmten pathogenfreien Bedingungen aufgezogen. Alle Verfahren wurden in einem aseptischen Schrank mit sterilen Werkzeugen durchgeführt.
- Betäuben Sie die Mäuse, indem Sie sie 2% Isofluran und 98% Sauerstoff (Sauerstoffdurchfluss, 2 L/min) aussetzen.
- Tragen Sie eine kleine Menge Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
HINWEIS: Führen Sie den gesamten Vorgang in einem gut belüfteten Bereich durch. Stellen Sie vor der Injektion von Osteosarkomzellen sicher, dass jede Maus durch eine Zehenprise unter tiefer Narkose steht. Wenn die Maus immer noch Antworten wie Zucken oder Ruckeln hat, warten Sie lange, bis die obigen Antworten verschwinden. - Halten Sie jede Maus in Rückenlage. Halten Sie den Knöchel der Maus mit Daumen und Zeigefinger fest und desinfizieren Sie die Injektionsstelle der Tibia mit einem 70% igen Ethanolabstrich.
HINWEIS: Um den Mausknöchel fest zu halten, sind sowohl der Daumen als auch die Zeigefingerspitzen für die nachfolgenden Verfahren von großer Bedeutung. - Drehen Sie das Sprunggelenk jeder Maus nach außen, um die Tibia und das Wadenbein zu bewegen, und beugen Sie das Kniegelenk in eine geeignete Position, bis das proximale Tibiaplateau (die Oberseite der Tibia) durch die Haut deutlich sichtbar ist (Abbildung 2A).
- Befestigen Sie die Nadel an einer 1-ml-Spritze und richten Sie die Nadelspitze auf die Injektionsstelle. Stellen Sie sicher, dass sich die Spritzennadel parallel zur Längsachse der Tibia befindet.
- Führen Sie die Nadel perkutan durch oder neben dem Patellaband ein, während sie durch die Haut- / Gelenkkapsel geht; th0en, drehen Sie die Spritze (1/2 bis 3/4-Kreis), um ein Loch durch die Tibia-Plattform in Richtung des distalen Endes der Tibia (Markhöhle) für die Osteosarkom-Zellinjektion mit einer Mikrovolumenspritze zu bohren (Abbildung 2B,C).
HINWEIS: Die gleichzeitige Rotation der Tibia kann während des Bohrens gefühlt werden, wenn die Nadelspitze genau ist. Stellen Sie sicher, dass sich die Vernadelung mit der Spritzenrotation vorwärts bewegt, anstatt direkt nach vorne gedrückt zu werden, bis sich etwa die Hälfte der Nadel in der Tibia befindet.
- Führen Sie die Nadel perkutan durch oder neben dem Patellaband ein, während sie durch die Haut- / Gelenkkapsel geht; th0en, drehen Sie die Spritze (1/2 bis 3/4-Kreis), um ein Loch durch die Tibia-Plattform in Richtung des distalen Endes der Tibia (Markhöhle) für die Osteosarkom-Zellinjektion mit einer Mikrovolumenspritze zu bohren (Abbildung 2B,C).
- Prüfen Sie, ob die Spritzennadel eine markante Bewegung in den Markkanal gemacht hat, um ein erfolgreiches Bohren zu gewährleisten.
HINWEIS: Führen Sie eine Röntgenuntersuchung durch (siehe Materialtabelle), um die richtige Position der Nadel zu bestätigen und die Bilder zu sammeln. - Laden Sie die 143B-Osteosarkom-Zellsuspension (ab Schritt 1.5) in eine Mikrovolumenspritze und ersetzen Sie die 1-ml-Spritze in der Tibia durch die 143B-Zellladungsspritze (Abbildung 2D). Injizieren Sie langsam ~ 10 μL (ignorieren Sie bereits vorhandene Lösung in der Nadel) der 143B-Zellsuspension in die Tibia jeder athymischen Maus (ca. 2 x 105 Zellen), ohne hohen Druck auszuüben.
- Drücken Sie die Injektionsstelle mit einem Wattestäbchen für 20-30 s, wenn die Mikrovolumenspritze entfernt wird.
- Legen Sie jede Maus zurück in einen sauberen Käfig und überwachen Sie sie genau, bis sich die Maus vollständig von der Narkose erholt hat (ca. 10 min).
- Überwachen Sie das Tumorwachstum in vivo mit einem Röntgenbildgebungssystem. Messen Sie den längeren Durchmesser (a) und den kurzen Durchmesser (b) der Krebsmasse jede Woche mit einem Bremssattel für die Berechnung des Tumorvolumens (V): V = 1/2 x a x b2.
HINWEIS: Anästhesieren Sie die Mäuse, indem Sie sie 2% Isofluran und 98% Sauerstoff aussetzen. Die Mäuse wurden für die Röntgenbildgebung betäubt. Die Intratibia-Injektion von Luciferase- oder fluoreszierenden Protein-markierten Osteosarkom-Zellen ermöglicht die Verfolgung von primären und metastasierten Osteosarkom-Läsionen.
HINWEIS: Humane Endpunkte der Mäuse mit Osteosarkom aufgrund des Tumorwachstums der Knie- und Lungenmetastasen basierten auf den folgenden Kriterien: (1) Body Condition Score, (2) Gewichtsverlustschwelle von 20%, (3) durchschnittlicher maximaler Durchmesser von Tumoren von 2 cm oder (4) stark eingeschränktes Tierverhalten.
3. Pathologische Untersuchung (Sammeln von primären und pulmonalen metastasierenden Osteosarkomproben zur Analyse)
- Sechs Wochen nach der Injektion von Osteosarkomzellen die Mäuse durch Zervixdislokation opfern, nachdem Sie sie für die CO 2-Inhalation ausgesetzt haben.
- Halten Sie die Maus in Rückenlage und dehnen Sie beide Hintergliedmaßen.
- Trennen Sie die ganzen Beine, die ein Osteosarkom tragen, vom Leistenbereich.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Beine von derselben anatomischen Stelle getrennt sind. - Bereiten Sie die histologische Probe der Beine mit Osteosarkom vor, indem Sie die Haut, Muskeln und Füße entfernen, und fixieren Sie dann die Probe jeder Maus in einem 50-ml-Röhrchen mit 20 ml Formalinlösung (10%) für 24 h, gefolgt von einer Entkalkung in 10% EDTA-Lösung für 14 Tage mit gelegentlichem Pufferwechsel.
- Betten Sie die Probe in Paraffin ein und bereiten Sie Abschnitte für die histologische Untersuchung nach bereits veröffentlichten Arbeitenvor 25.
- Trennen Sie die Lungen vorsichtig und geben Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen, das mit 20 ml Formalinlösung (10%) gefüllt ist. Nach 24 h die Lungen jeder Maus in eine 15-ml-Röhre mit 70% Ethanol überführen. Betten Sie die Lunge in Paraffin für Hämatoxylin und Eosin (H & E) -Färbung und Immunhistochemie-Assay25.
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Representative Results
Erfolgreiche orthotope (primäre) Osteosarkom- und metastasierende Lungenmodelle hängen von der genauen orthotopen Injektion von Osteosarkomzellen ab. Hier wurde erfolgreich ein orthotopes (primäres) Osteosarkom-Modell mittels intratibialer Osteosarkom-Zellinjektion entwickelt. Abbildung 3A zeigt eine repräsentative Maus mit orthotopem (primärem) Osteosarkom, und Abbildung 3B zeigt ein repräsentatives isoliertes orthotopes (primäres) Osteosarkom. Das Tumorvolumen wurde einmal wöchentlich mit einem Bremssattel gemessen und wie in Schritt 2.11 beschrieben berechnet (Abbildung 3C). Das orthotope (primäre) Osteosarkomwachstum in vivo wurde sowohl durch das Röntgen- als auch durch das Biolumineszenz- (wenn die injizierten Zellen mit Luciferase markiert wurden) Live-Bildgebungssystem verfolgt. Die Röntgenbilder wurden von der ersten Woche bis zur sechsten Woche nach der 143B Osteosarkom-Zellinjektion aufgenommen (Abbildung 3D). Darüber hinaus wurde das Bild des orthotopen (primären) Osteosarkomwachstums in vivo erhalten, nachdem Luciferase-markierte 143B-Zellen in die Tibia der Maus injiziert wurden (Abbildung 3E).
Die pulmonale Metastasierung, die durch die intratibielle Injektion von Luciferase-markierten Osteosarkom-Zellen verursacht wurde, wurde in vivo durch ein Biolumineszenz-Lebendbildgebungssystem erfolgreich verfolgt (Abbildung 4A). Die metastasierenden Kolonien in den isolierten Lungengeweben wurden ebenfalls unter dem Stereomikroskop sichtbar gemacht (Abbildung 4B). Die metastasierenden Läsionen wurden durch H & E-Färbung auf paraffineingebettetem Lungengewebe weiter bestätigt (Abbildung 4C).
Abbildung 1: Operationswerkzeuge. (A) Spritze im Maßstab 1 ml. b) Mikrovolumenspritze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Darstellung der intratibialen Injektionsoperation. (A) Die intratibiale Injektionsstelle einer athymischen Maus. (B) Eine sterile 1-ml-Spritze mit einer begleiteten Nadel wurde perkutan über das proximale Tibiaplateau (die Oberseite der Tibia) zum distalen Ende in die Tibia eingeführt. (C) Eine seitliche Sicht auf den Bohrprozess. Die Spritzennadel war parallel zur langen Tibia-Achse (durchgezogene Linie). (D) Intratibiale Injektion mit einer mit Osteosarkomzellen beladenen Mikrovolumenspritze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Visualisierung des Osteosarkomwachstums bei Mäusen . (A) Erfolgreiches orthotopes Osteosarkommodell der Maus. (B) Isoliertes orthotopes Osteosarkom. (C) Das Tumorvolumen wurde mit einem Bremssattel gemessen und nach folgender Formel berechnet: Tumorvolumen = 0,5 x längerer Durchmesser x kurzer Durchmesser x kurzer Durchmesser. Fehlerbalken stehen für Standardabweichung (n = 8). (D) Röntgenbilder wurden von derselben Maus zu einem anderen Zeitpunkt (von 1-6 Wochen) aufgenommen. (E) Bild, das am 28. Tag nach der Injektion von Luciferase-markierten 143B-Zellen in die Tibia der Maus erhalten wurde. Die roten Pfeile zeigten die Lumineszenzintensität des orthotopen (primären) Osteosarkoms an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Pulmonale Metastasierung des Osteosarkoms. (A) Bild, das am 28. Tag nach der Injektion von Luciferase-markierten 143B-Zellen in die Tibia der Maus aufgenommen wurde. Die roten Pfeile zeigten die Lumineszenzintensität der Lungenmetastasierung an. (B) Die isolierten Lungen mit Osteosarkom metastasieren. Die roten Pfeile zeigten die metastasierenden Kolonien (x20) an. (C) Die H&E-Färbung zeigte metastasierende Läsionen im Lungengewebe (Skalenbalken = 200 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die orthotope Injektion von Osteosarkomzellen ist ein ideales Modell, um die Funktion und den Mechanismus spezifischer Faktoren bei der Karzinogenese des Osteosarkoms zu untersuchen und die therapeutische Wirksamkeit zu bewerten. Um Unterschiede im Tumorwachstum zu vermeiden, werden die meisten aktiven Osteosarkomzellen bei 80% -90% Konfluent mit der gleichen Anzahl vorsichtig in die Tibia jeder Maus injiziert, und die Zelltrypsinisierungszeit wird streng kontrolliert, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Da Zellklumpen die Zellzählung beeinflussen, was dazu führt, dass ungenaue Zellzahlen in die Tibia jeder Maus injiziert werden, muss die Zellsuspension entsprechend mit einer Pipette auf und ab gemischt werden, um die Bildung von Zellklumpen zu vermeiden.
Ein weiterer kritischer Aspekt, der berücksichtigt werden muss, ist die resuspendierte Lösung für Osteosarkomzellen. Die injizierten Zellen werden in einer Basalmembranmatrix statt in PBS oder Kulturmedium resuspendiert. Darüber hinaus ist eine hohe Konzentration der Basalmembranmatrix schwierig zu pipettieren und beeinflusst das genaue Volumen; Daher ist eine angemessene Konzentration der Basalmembranmatrixerforderlich 26. Um ein Loch durch die Tibia-Plattform für die Osteosarkom-Zellinjektion zu bohren, bewegt sich die Vernadelung mit der Spritzenrotation nach vorne, anstatt direkt nach vorne gedrückt zu werden, bis sich etwa die Hälfte der Nadel in der Tibia befindet. Insbesondere werden immundefiziente Mäuse angewendet, um ein orthotopes Osteosarkommodell unter Verwendung menschlicher Osteosarkomzellenzu etablieren 27. Währenddessen wird das Injektionsverfahren in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen chirurgischen Werkzeugen durchgeführt. Da Mäuse nach Anästhesie und Operation Unbehagen verspüren können, müssen die Mäuse in der ersten Woche nach der Operation engmaschig überwacht werden.
Die Intratibia-Injektion von Osteosarkomzellen, die mit fluoreszierendem Protein oder Luciferase markiert sind, ermöglicht die Verfolgung von primären und metastatischen Läsionen mittels optischer Bildgebung28. Osteosarkom ist niemals über die Größenbeschränkung hinaus erlaubt, wie im IACUC-genehmigten Protokoll; In der Zwischenzeit können Ulzerationen in enormer Tumormasse auftreten, die zu fehlgeschlagenen immunhistochemischen Analysen führen können. Obwohl kürzlich berichtet wurde, dass die primären Knochentumoren und Knochenmetastasen durch die Implantation eines soliden Tumortransplantats in den Knochen erreicht wurden, entwickelten die Tiere ein reproduzierbares Wachstum sowie schließlich Lungenmetastasen29; Die Autoren implantierten jedoch direkt frische oder kryokonservierte Tumorfragmente in die proximale Tibia, was zeigte, dass der Nachteil der offenen Operation eine mögliche Infektion und ein Versagen der sich entwickelnden Tumortransplantation verursachte. Darüber hinaus führt das Volumen der implantierten Tumorfragmente ohne strenge Kontrolle zu einem signifikanten Unterschied im produzierten Tumorvolumen, was bei der anschließenden Anwendung, wie der Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit in vivo, schwierig ist. Hier wird eine einfache und reproduzierbare Technik berichtet, um das primäre Intratibia-Osteosarkom mit späteren Lungenmetastasen-Mausmodellen über Intratibia-Injektion von Osteosarkom-Zellen zu etablieren. Dies zeigte die Vorteile der besten Nachahmung der klinischen Entwicklungsmerkmale des Osteosarkoms beim Menschen; genaue Anzahl von Osteosarkomzellen, die direkt in Tibia injiziert werden, mit einer Mikrovolumenspritze, die eine identische Tumorbildungsrate (100%) und Tumorvolumen ermöglicht. Die Methode stellt sicher, dass die Möglichkeit einer Infektion oder sogar des Todes durch offene Operationstechniken vermieden wird und eine lebhafte Überwachung und Quantifizierung des Osteosarkomwachstums und der Metastasierung mit dem Biolumineszenz-Live-Imaging-System ermöglicht wird, nachdem die injizierten Osteosarkomzellen mit Biolumineszenz markiert wurden. Dies verhindert, dass die injizierten Osteosarkomzellen direkt in den Blutkreislauf gelangen und sich in der Lunge ansiedeln, um Lungenembolien und / oder falsch-positive Lungenmetastasen zu bilden, indem die injizierten Osteosarkomzellen in angemessener Konzentration der Basalmembranmatrix resuspendiert werden, da die Basalmembranmatrix die Eigenschaft hat, oberhalb der Raumtemperatur zu koagieren. Die sofortige Koagulation unterstützt und begrenzt Osteosarkomzellen innerhalb der Basalmembranmatrix, nachdem sie in die Tibia der Maus injiziert wurden.
Eine andere Literatur hat über die Etablierung des Knochenmetastasenmodells durch intrakardiale Inokulation oder intratratibiale Impfung von Brustkrebszellenberichtet 30; Zellen, die in dieser Literatur verwendet werden, sind jedoch Brustkrebszellen, die unterschiedliche biologische und klinische Eigenschaften mit Osteosarkomzellen haben; Darüber hinaus werden sowohl die intrakardiale als auch die intratratibiale Impfung etablierte Krebsmodelle im Knochen durch Krebszellen gebildet, die direkt kolonisieren oder durch den Blutkreislauf gelangen, anstatt Metastasenläsionen, die durch die Verbreitung von Krebszellen aus den primären Krebsläsionen gebildet werden.
Es gibt mehrere Einschränkungen des aktuellen Protokolls. Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind genetische Immunsystemdefekt-Nacktmäuse ohne Thymus, die verhindern, dass sie menschliche Zellen immunologisch abstoßen, und werden häufig in präklinischen Studien verwendet, die nicht für die immunfunktionelle Forschung anwendbar sind. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass nicht alle Osteosarkom-Zelllinien in diesen Modellen identisch relevant sind und die Tumorgenesefähigkeiten von 143B-, MNNG-, MG-63- und U-2-OS-Zellen höher sind als die Saos-2-Zellen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegenden primären und pulmonalen metastasierenden Osteosarkommodelle, die durch orthotope Osteosarkom-Zellinjektion erzeugt werden, praktische Werkzeuge sind, um die Tumormikroumgebung, die Wirksamkeit von Therapeutika auf das Wachstum und / oder die Metastasierung von Osteosarkomen zu untersuchen. Darüber hinaus sind die Modelle durch die Intratibia-Injektion der genetisch veränderten Osteosarkomzellen, die speziell auf ein Gen abzielen, hilfreich, um die wichtigsten Onkogene und Tumorsuppressoren beim Osteosarkomwachstum und bei der Lungenmetastasierung zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse von (1) National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 und 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 und 82174408) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
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