Summary
本プロトコールは、同所性骨肉腫および肺転移病変を有するマウスモデルを生成するための脛骨内骨肉腫細胞注射を記載する。
Abstract
骨肉腫は、小児および青年において最も一般的な原発性骨癌であり、肺を最も一般的な転移部位とする。肺転移を有する骨肉腫患者の5年生存率は30%未満である。したがって、ヒトにおける骨肉腫の発症を模倣したマウスモデルの利用は、骨肉腫の発癌や肺転移の基本的なメカニズムを理解し、新規な治療法を開発する上で大きな意義を有する。ここでは、骨肉腫細胞の脛骨内注射 を介して原発性骨肉腫および肺転移マウスモデルを生成する詳細な手順が報告されている。生物発光またはX線ライブイメージングシステムと組み合わせることで、これらの生きたマウスモデルは、骨肉腫の成長および転移をモニターおよび定量化するために利用される。このモデルを確立するために、骨肉腫細胞を含む基底膜マトリックスをマイクロボリュームシリンジにロードし、麻酔をかけた後に各無胸腺マウスの1つの脛骨に注入した。原発性骨肉腫がIACUC承認プロトコルのサイズ制限に達したときにマウスを屠殺した。骨肉腫を有する脚と転移病変を有する肺を分離した。これらのモデルは、短い潜伏期間、急速な成長、重度の病変、および原発性および肺転移性病変の発症を監視する際の感受性によって特徴付けられる。したがって、これらは、骨肉腫の発癌および肺転移、腫瘍微小環境における特定の因子の機能およびメカニズムを探求し、 生体内での治療有効性を評価するための理想的なモデルである。
Introduction
骨肉腫は、小児および青年における最も一般的な原発性骨癌であり1,2であり、主に周囲の組織に浸潤し、患者が診断されると肺に転移することさえある。肺転移は骨肉腫治療の主な課題であり、肺転移を伴う骨肉腫患者の5年生存率は20%〜30%と低いままである3,4,5。しかし、原発性骨肉腫の5年生存率は、化学療法の導入により1970年代以降、約70%に上昇している6。したがって、骨肉腫の発がんや肺転移の根本的なメカニズムを理解し、新たな治療法を開発することが急務となっています。ヒトにおける骨肉腫の進行を最もよく模倣するマウスモデルの適用は、非常に重要である7。
骨肉腫動物モデルは、自発的、誘導された遺伝子工学、移植、および他の技術によって生成される。自発性骨肉腫モデルは、長い腫瘍形成時間、一貫性のない腫瘍発生率、低い罹患率、および安定性の悪さのためにめったに使用されない8,9。誘導性骨肉腫モデルは、自発性骨肉腫よりも入手しやすいが、誘導因子が骨肉腫の微小環境、病因、および病理学的特徴に影響を及ぼすため、誘導性骨肉腫モデルの適用は限定的である10。トランスジェニックモデルは、ヒトの生理学的および病理学的環境をよりよくシミュレートできるため、がんの病因を理解するのに役立ちます。しかしながら、トランスジェニック動物モデルはまた、トランスジェニック修飾の困難さ、長期的、および高コストのために、その限界を有する。さらに、p53およびRb遺伝子改変によって生成された最も広く受け入れられているトランスジェニック動物モデルでさえ、肉腫のわずか13.6%が四肢骨に発生した11、12。
移植は、その簡単な操作、安定した腫瘍形成速度、およびより良好な均質性のために、近年最も一般的に使用されている原発性および遠隔転移性癌モデル作製方法の1つである13。移植には、移植部位に応じた異所性移植および同所性移植が含まれる。骨肉腫異所性移植において、骨肉腫細胞は、動物の原発性骨肉腫部位(骨)の外側、一般に皮膚の下、皮下に注射される14。異所性移植は動物に手術を行う必要もなく簡単ですが、骨肉腫細胞が注入される部位は実際のヒト骨肉腫微小環境を表していません。骨肉腫同所性移植は、骨肉腫細胞が脛骨などの動物の骨に注入されるときである15、16。異所性移植片と比較して、同所性骨肉腫移植片は、短い潜伏期間、急速な成長、および強いびらん性の性質によって特徴付けられる。したがって、それらは骨肉腫関連研究のための理想的な動物モデルである17。
最も一般的に使用される動物は、マウス、イヌ、およびゼブラフィッシュである18、19。骨肉腫は犬の最も一般的な腫瘍の1つであるため、骨肉腫の自発的なモデルは、通常、犬歯で使用されます。しかしながら、このモデルの適用は、長い腫瘍形成時間、低い腫瘍形成率、劣悪な均質性、および安定性のために制限されている。ゼブラフィッシュは、その急速な再生のために、トランスジェニックまたはノックアウト腫瘍モデルを構築するためにしばしば使用される20。しかし、ゼブラフィッシュの遺伝子はヒトの遺伝子とは異なるため、その用途は限られています。
本研究は、無胸腺マウスにおける骨肉腫細胞の脛骨内注射 による 肺転移を伴う脛骨における原発性骨肉腫を作製するための詳細な手順、注意事項、および代表的な画像を説明する。この方法は、治療有効性評価のためにマウス脛骨における原発性骨肉腫を作成するために適用され、これは高い再現性を示した21、22。
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Protocol
すべての動物実験は、上海漢方医科大学の動物福祉委員会によって承認されました。4週齢の雄性BALB/c無胸腺マウスは、骨肉腫細胞の同所性注射の手術前に1週間順応させた。マウスを、SPF飼料および滅菌水への自由アクセスを伴う12時間の明暗サイクルにおいて、ケージあたり5匹のマウスを有する個々に換気されたマウスケージに飼育した。
1. 細胞の調製
- 骨肉腫細胞(143B-ルシフェラーゼ)注射当日、10cm細胞培養皿で培養した80%~90%コンフルエント細胞をPBS(pH7.4)で2回洗浄し、1.5mLの0.25%トリプシンで3分間トリプシン処理した。次いで、6mLの10%血清含有MEM培地を加えてトリプシンをクエンチし、細胞を15mL遠沈管に集めた。
注:143B-ルシフェラーゼ細胞株は、pLV-ルシフェラーゼベクター23でトランスフェクトした143B細胞株から得られる。 - 20 μLの細胞懸濁液を細胞計数プレートのチャンバーに吸引し、自動細胞カウンターを用いて細胞濃度を計算する( 材料表を参照)。
- 細胞を800 x g で室温で5分間遠心分離する。
- 上清をピペットで吸引し、細胞ペレットを8.5mg/mLの基底膜マトリックス(材料表を参照)に最終濃度2 x 107cells/mLまで再懸濁する。
- 細胞を氷の上に保ち、手術室に持って行きます。細胞は2時間以内に使用する必要があります。
注:不正確な注射用量を避けるために(例えば、シリンジ内のデッドスペースのために)、余分な細胞懸濁液が調製される(通常、細胞懸濁液の必要量の2倍)。基底膜マトリックスは、室温24を超える凝固特性を有するので、常に氷上に保持される。
2. 骨肉腫細胞の同所性注射手術
メモ: 手術ツールを 図 1 に示します。
- マウスを特定の病原体非含有条件下で飼育した。すべての手順は、滅菌ツールを備えた無菌キャビネットで行われました。
- マウスを2%イソフルランおよび98%酸素(酸素流量、2L /分)に曝露することによって麻酔する。
- 麻酔下での乾燥を防ぐために、少量の眼科用軟膏を目に塗布する。
メモ: 手順全体は、換気の良い場所で行ってください。骨肉腫細胞注射の前に、各マウスがつま先のピンチによる深い麻酔下にあることを確認してください。マウスにけいれんやジャークなどの応答がまだある場合は、上記の応答が消えるまでしばらく待ちます。 - 各マウスを仰臥位に保ちます。親指と人差し指でマウスの足首を持ち、70%エタノール綿棒で脛骨の注射部位を消毒します。
メモ:マウスの足首をしっかりと保持するには、親指と人差し指先の両方がその後の手順で非常に重要です。 - 各マウスの足首関節を外側に回転させて脛骨と腓骨を動かし、近位脛骨プラトー(脛骨の上部)が皮膚を通してはっきりと見えるまで膝関節を適切な位置に曲げます(図2A)。
- 針を1mLシリンジに取り付け、針先を注射部位に向けます。シリンジ針が脛骨の長軸に平行であることを確認してください。
- 経皮的に針を膝蓋骨靭帯を通して、または膝蓋骨靭帯に隣接して挿入し、皮膚/関節嚢を通過する。th0en、シリンジ(1/2〜3/4円)を回転させ、マイクロボリュームシリンジを用いて骨肉腫細胞注射のために脛骨プラットフォームを通って脛骨の遠位端(髄腔)に向かって穴をあけた(図2B、C)。
注:針先が正確であれば、脛骨の同時回転が穴あけ中に感じることができます。ニードリングが、針の約半分が脛骨に入るまで直接前方に押し出されるのではなく、シリンジの回転とともに前方に移動するようにしてください。
- 経皮的に針を膝蓋骨靭帯を通して、または膝蓋骨靭帯に隣接して挿入し、皮膚/関節嚢を通過する。th0en、シリンジ(1/2〜3/4円)を回転させ、マイクロボリュームシリンジを用いて骨肉腫細胞注射のために脛骨プラットフォームを通って脛骨の遠位端(髄腔)に向かって穴をあけた(図2B、C)。
- 注射針が髄管に顕著な動きをしたかどうかを確認して、掘削を確実に成功させます。
メモ:X線検査( 材料表を参照)を実行して、針の正しい位置を確認し、画像を収集します。 - 143B骨肉腫細胞懸濁液(ステップ1.5から)をマイクロボリュームシリンジにロードし、脛骨内の1mLシリンジを143B細胞ロードマイクロボリュームシリンジと交換する(図2D)。高圧をかけずに、約10μLの143B細胞懸濁液を各無胸腺マウスの脛骨(約2 x105 細胞)にゆっくりと注入する(針内の既存の溶液を無視する)。
- マイクロボリュームシリンジを取り外したら、綿棒で注射部位を20〜30秒間押します。
- 各マウスを清潔なケージに戻し、マウスが麻酔から完全に回復するまで(約10分間)注意深く監視します。
- X線イメージングシステムを用いて インビボでの 腫瘍増殖をモニターする。腫瘍体積(V)計算のためにノギスで毎週癌塊の長径(a)および短径(b)を測定する:V = 1/2 x a x b2。
注:マウスを2%イソフルランと98%の酸素にさらして麻酔します。マウスをX線画像化のために麻酔した。ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質標識骨肉腫細胞の脛骨内注射は、原発性および転移性骨肉腫病変の追跡を可能にする。
注:膝および肺転移の腫瘍増殖による骨肉腫を有するマウスの人道的エンドポイントは、以下の基準に基づいていた:(1)身体状態スコア、(2)体重減少閾値20%、(3)腫瘍の平均最大直径2cm、または(4)ひどく制限された動物の行動。
3. 病的検査(原発性・肺転移性骨肉腫検体の採取による分析)
- 骨肉腫細胞注射の6週間後、CO2 吸入のためにそれらを暴露した後に子宮頸部脱臼によりマウスを屠殺する。
- マウスを仰臥位に保ち、両方の後肢を伸ばします。
- 骨肉腫を患っている脚全体を鼠径部から分離する。
メモ: すべての脚が同じ解剖学的部位から離れていることを確認してください。 - 皮膚、筋肉、足部を除去して骨肉腫を負った脚の組織標本を作製し、その後、各マウスの標本を20mLホルマリン溶液(10%)で50mLチューブに24時間固定した後、10%EDTA溶液中で14日間脱灰し、時折緩衝液交換を行った。
- 標本をパラフィンに埋め込み、以前に発表された研究25に続いて組織学的検査のための切片を準備する。
- 肺を静かに分離し、20mLホルマリン溶液(10%)で満たされた50mLチューブに入れた。24時間後、各マウスの肺を70%エタノールを含む15mLチューブに移す。肺をパラフィンに埋め込んで、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色および免疫組織化学アッセイ25を行う。
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Representative Results
同所性(原発性)骨肉腫および転移性肺モデルの成功は、骨肉腫細胞の正確な同所性注射に依存する。ここでは、脛骨内骨肉腫細胞注入 による 同所性(原発性)骨肉腫モデルの開発に成功した。図 3A は、同所性(原発性)骨肉腫を有する代表的なマウスを示し、 図3B は、代表的な孤立した同所性(原発性)骨肉腫を示す。腫瘍体積をノギスで週に1回測定し、ステップ2.11に記載したように計算した(図3C)。 インビボでの 同所性(原発性)骨肉腫増殖を、X線および生物発光(注入された細胞をルシフェラーゼで標識したとき)ライブイメージングシステムの両方によって追跡した。 X線画像は、143B骨肉腫細胞注入後第1週から第6週にかけて得られた(図3D)。さらに、 インビボでの 同所性(原発性)骨肉腫増殖の像は、ルシフェラーゼ標識143B細胞をマウス脛骨に注入した後に得られた(図3E)。
ルシフェラーゼ標識骨肉腫細胞の脛骨内注射によって引き起こされる肺転移を、生物発光ライブイメージングシステムによって インビボで 追跡することに成功した(図4A)。単離された肺組織における転移性コロニーも実体顕微鏡下で可視化した(図4B)。転移性病変は、パラフィン包埋肺組織上のH&E染色によってさらに確認された(図4C)。
図1:手術器具(A)1mLスケールシリンジ。(B)マイクロボリュームシリンジ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:脛骨内注射手術の表現。 (a)無胸腺マウスの脛骨内注射部位。(B)付属の針を備えた滅菌1mLシリンジを、近位脛骨プラトー(脛骨の上部) を介して 遠位端に向かって脛骨に経皮的に挿入した。(C)掘削工程の側面図。シリンジ針は長脛骨軸(実線)に平行であった。(d)骨肉腫細胞搭載マイクロボリュームシリンジによる脛骨内注射。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスにおける骨肉腫増殖の可視化(A)成功したマウス同所性骨肉腫モデル。(b)単離された同所性骨肉腫。(c)腫瘍体積をノギスで測定し、以下の式を用いて計算した:腫瘍体積=0.5 x長径x短径x短径。エラーバーは標準偏差(n = 8)を表します。(d)X線画像は、異なる時間(1〜6週間)に同じマウスから得られた。(e)ルシフェラーゼ標識143B細胞をマウス脛骨に注射してから28日目に得られた画像。赤い矢印は、同所性(原発性)骨肉腫の発光強度を示した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:骨肉腫の肺転移 (a)ルシフェラーゼ標識した143B細胞をマウス脛骨に注射してから28日目 に得られた画像。赤い矢印は肺転移の発光強度を示した。(b)骨肉腫転移を有する単離された肺。赤い矢印は転移性コロニー(x20)を示した。(c)H&E染色は、肺組織における転移性病変を示した(スケールバー=200μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
骨肉腫細胞の同所性注射は、骨肉腫の発癌および発生における特定の因子の機能およびメカニズムを研究し、治療有効性を評価するための理想的なモデルである。腫瘍増殖の違いを避けるために、同じ数の80%〜90%コンフルエントのほとんどの活動性骨肉腫細胞を各マウスの脛骨に注意深く注入し、細胞トリプシン処理時間は細胞生存率に影響を与えることなく厳密に制御される。細胞凝集塊は細胞計数に影響を与え、不正確な細胞数が各マウスの脛骨に注入されるため、細胞凝集塊の形成を避けるために、細胞懸濁液をピペットで適切に上下に混合する必要があります。
考慮に入れなければならないもう一つの重要な側面は、骨肉腫細胞のための再懸濁溶液である。注入された細胞は、PBSまたは培養培地中ではなく基底膜マトリックス中に再懸濁される。さらに、高濃度の基底膜マトリックスはピペットで固定するのが難しく、正確な体積に影響を与えます。したがって、基底膜マトリックスの適切な濃度が必要となる26。骨肉腫細胞注入のために脛骨プラットフォームに穴を開けるために、ニードリングは、針の約半分が脛骨に入るまで直接前方に押し出されるのではなく、シリンジ回転と共に前進する。より詳細には、免疫不全マウスは、ヒト骨肉腫細胞27を用いて同所性骨肉腫モデルを確立するために適用される。一方、注射手順は、滅菌手術器具を用いて生物学的安全キャビネット内で行われる。マウスは麻酔と手術後に不安を経験することがあるので、マウスは術後最初の週に注意深く監視されなければならない。
蛍光タンパク質またはルシフェラーゼで標識された骨肉腫細胞の脛骨内注射は、光学画像化28を用いて原発性および転移性病変の追跡を可能にする。骨肉腫は、IACUC承認プロトコルのようにサイズ制限を超えて許可されることはありません。一方、潰瘍形成は巨大な腫瘍塊で起こる可能性があり、免疫組織化学的分析の失敗につながる可能性があります。原発性骨腫瘍および骨転移は、骨への固形腫瘍移植片の移植によって達成されることが最近報告されているが、動物は再現性のある成長を発症し、最終的には肺転移も発症した29。しかし、著者らは、新鮮または凍結保存された腫瘍断片を近位脛骨に直接移植し、開腹手術の欠点が潜在的な感染を引き起こし、腫瘍生着を発症することの失敗を示した。また、厳密な制御を伴わない移植腫瘍断片の体積は、産生された腫瘍体積に大きな差を生じることになり、 これは、生体内での治療有効性を評価するなどの以下の用途では困難である。ここでは、骨肉腫細胞の脛骨内注射 を介して 後の肺転移マウスモデルを用いて脛骨内原発性骨肉腫を樹立する簡便で再現可能な技術が報告されている。これは、ヒトにおける骨肉腫の臨床発達特性を最もよく模倣することの利点を示した。マイクロボリュームシリンジを使用して脛骨に直接注入される骨肉腫細胞の正確な数は、同一の腫瘍形成率(100%)および腫瘍体積を可能にする。この方法は、開放手術技術を使用して感染または死亡の可能性を回避し、注入された骨肉腫細胞が生物発光で標識された後、生物発光ライブイメージングシステムを使用して骨肉腫の成長および転移を生き生きと監視および定量することを可能にする。これにより、注入された骨肉腫細胞が血流に直接到達して肺に定着し、注入された骨肉腫細胞を基底膜マトリックスの適切な濃度で再懸濁することにより、肺塞栓症および/または偽陽性肺転移を形成するのを防ぐ。即時凝固支持体は、マウス脛骨に注入された後の基底膜マトリックス内の骨肉腫細胞を制限する。
別の文献は、乳癌細胞の心臓内接種または脛骨内接種による骨転移モデル樹立を報告している30;しかしながら、この文献で使用されている細胞は乳癌細胞であり、骨肉腫細胞とは異なる生物学的および臨床的特徴を有する。さらに、骨中の心臓内および脛骨内接種によって確立された癌モデルは、原発性癌病変からの癌細胞の播種によって形成される転移病変ではなく、癌細胞が直接コロニー形成するか、または血流を介して到達することによって形成される。
現在のプロトコルにはいくつかの制限があります。このプロトコールで使用されるマウスは、胸腺のない遺伝的免疫系欠損ヌードマウスであり、ヒト細胞を免疫学的に拒絶するのを防ぎ、免疫機能研究には適用できない前臨床試験で広く使用されている。さらに、すべての骨肉腫細胞株がこれらのモデルにおいて同じ関連性があるわけではなく、143B、MNNG、MG-63、およびU-2 OS細胞の腫瘍形成能力はSaos-2細胞よりも高いことを見出した。
結論として、同所性骨肉腫細胞注射によって生成された現在の原発性および肺転移性骨肉腫モデルは、腫瘍微小環境、骨肉腫の増殖および/または転移に対する治療薬の有効性を研究するための便利なツールである。さらに、遺伝子を特異的に標的とする遺伝子改変骨肉腫細胞の脛骨内注射により、これらのモデルは、骨肉腫の増殖および肺転移における重要な癌遺伝子および腫瘍抑制因子を探索するのに有用である。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、(1)中国の国家主要研究開発プログラム(2018YFC1704300および2020YFE0201600)、(2)国立自然科学財団(81973877および82174408)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
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