Summary
Det föreliggande protokollet beskriver intratibia osteosarkomcellinjektion för att generera musmodeller med ortotopisk osteosarkom och lungmetastasskador.
Abstract
Osteosarkom är den vanligaste primära bencancern hos barn och ungdomar, med lungor som den vanligaste metastatiska platsen. Femårsöverlevnaden för osteosarkompatienter med lungmetastaser är mindre än 30%. Därför är användningen av musmodeller som efterliknar osteosarkomutvecklingen hos människor av stor betydelse för att förstå den grundläggande mekanismen för osteosarkomcancerframkallande och lungmetastas för att utveckla nya terapier. Här rapporteras detaljerade procedurer för att generera de primära osteosarkom- och lungmetastasmusmodellerna via intratibiainjektion av osteosarkomceller. I kombination med bioluminescens- eller röntgensystemet för levande avbildning används dessa levande musmodeller för att övervaka och kvantifiera osteosarkomtillväxt och metastasering. För att etablera denna modell laddades en basalmembranmatris innehållande osteosarkomceller i en mikrovolymspruta och injicerades i en tibia av varje atymisk mus efter att ha sövts. Mössen offrades när den primära osteosarkom nådde storleksbegränsningen i det IACUC-godkända protokollet. Benen som bar osteosarkom och lungorna med metastasskador separerades. Dessa modeller kännetecknas av en kort inkubationsperiod, snabb tillväxt, svåra lesioner och känslighet vid övervakning av utvecklingen av primära och lungmetastatiska lesioner. Därför är dessa idealiska modeller för att utforska funktionerna och mekanismerna för specifika faktorer i osteosarkomcancerframkallande och lungmetastas, tumörmikromiljön och utvärdera den terapeutiska effekten in vivo.
Introduction
Osteosarkom är den vanligaste primära bencancer hos barn och ungdomar 1,2, som huvudsakligen infiltrerar den omgivande vävnaden och till och med metastaserar till lungorna när patienterna diagnostiseras. Lungmetastasering är den största utmaningen för osteosarkombehandling, och femårsöverlevnaden för osteosarkompatienter med lungmetastas förblir så låg som 20%-30%3,4,5. Femårsöverlevnaden för primär osteosarkom har dock ökat till cirka 70% sedan 1970-talet på grund av införandet av kemoterapi6. Därför är det brådskande att förstå den grundläggande mekanismen för osteosarkomcancerframkallande och lungmetastaser för att utveckla nya terapier. Tillämpningen av musmodeller som bäst efterliknar osteosarkomprogressionen hos människor är av stor betydelse7.
Osteosarkomdjurmodellerna genereras av spontan, inducerad genteknik, transplantation och andra tekniker. Den spontana osteosarkommodellen används sällan på grund av den långa tumörbildningstiden, inkonsekvent tumörförekomst, låg sjuklighet och dålig stabilitet 8,9. Även om den inducerade osteosarkommodellen är mer tillgänglig att erhålla än den spontana osteosarkom, är tillämpningen av den inducerade osteosarkommodellen begränsad eftersom den inducerande faktorn kommer att påverka mikromiljön, patogenesen och patologiska egenskaper hos osteosarkom10. Transgena modeller hjälper till att förstå patogenesen av cancer eftersom de bättre kan simulera de mänskliga fysiologiska och patologiska miljöerna; De transgena djurmodellerna har emellertid också sina begränsningar på grund av svårigheten, långsiktigheten och de höga kostnaderna för transgen modifiering. Dessutom, även i de mest accepterade transgena djurmodellerna som genereras av p53 och Rb genmodifiering, inträffade endast 13,6% sarkom i de fyra extremitetsbenen 11,12.
Transplantation är en av de vanligaste primära och avlägsna metastatiska cancermodellproducerande metoderna de senaste åren på grund av dess enkla manövrering, stabila tumörbildningshastighet och bättre homogenitet13. Transplantation inkluderar heterotopisk transplantation och ortotopisk transplantation enligt transplantationsställena. Vid osteosarkom heterotoptransplantation injiceras osteosarkomcellerna utanför djurens primära osteosarkomställen (ben), vanligtvis under huden, subkutant14. Även om den heterotopiska transplantationen är enkel utan att behöva utföra kirurgi hos djur, representerar de platser där osteosarkomcellerna injiceras inte den faktiska humana osteosarkommikromiljön. Osteosarkom ortotopisk transplantation är när osteosarkomcellerna injiceras i djurens ben, såsom tibia15,16. Jämfört med heterotopiska transplantat kännetecknas ortotopiska osteosarkomtransplantat av en kort inkubationsperiod, snabb tillväxt och stark erosiv natur; därför är de idealiska djurmodeller för osteosarkomrelaterade studier17.
De vanligaste djuren är möss, hundar ochzebrafiskar 18,19. Den spontana modellen av osteosarkom används vanligtvis hos hundar eftersom osteosarkom är en av de vanligaste tumörerna hos hundar. Tillämpningen av denna modell är emellertid begränsad på grund av den långa tumörbildningstiden, den låga tumorigeneshastigheten, dålig homogenitet och stabilitet. Zebrafiskar används ofta för att konstruera transgena eller knockout tumörmodeller på grund av deras snabba reproduktion20. Men zebrafiskgener skiljer sig från mänskliga gener, så deras tillämpningar är begränsade.
Detta arbete beskriver detaljerade procedurer, försiktighetsåtgärder och representativa bilder för att producera primär osteosarkom i tibia med lungmetastas via intratibia injektion av osteosarkomceller i athymiska möss. Denna metod användes för att skapa primär osteosarkom i musens skenben för terapeutisk effektutvärdering, vilket visade en hög reproducerbarhet21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av djurskyddskommittén vid Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. Fyra veckor gamla manliga BALB/c-atymiska möss acklimatiserades i en vecka före operationen för ortotopisk injektion av osteosarkomceller. Möss inrymdes i individuellt ventilerade mössburar med fem möss per bur i en 12-timmars ljus / mörk cykel med ad libitum tillgång till SPF-foder och sterilt vatten.
1. Beredning av celler
- På dagen för osteosarkomcell (143B-Luciferase) injektion, tvätta 80% -90% sammanflytande celler odlade i en 10 cm cellodlingsskål två gånger med PBS (pH 7,4) och trypsinisera med 1,5 ml 0,25% trypsin i 3 min. Tillsätt sedan 6 ml 10% seruminnehållande MEM-media för att släcka trypsinet och samla cellerna i ett 15 ml centrifugrör.
OBS: 143B-Luciferas cellinje erhålls från 143B cellinjetransfekt med pLV-luciferasvektor23. - Aspirera 20 μL cellsuspension i cellräkningsplattans kammare och beräkna cellkoncentrationen med hjälp av en automatisk cellräknare (se Materialtabell).
- Centrifugera cellerna vid 800 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten med en pipett och återsuspendera cellpelleten i en 8,5 mg / ml basalmembranmatris (se materialtabell) till en slutlig koncentration av 2 x 107 celler / ml.
- Håll cellerna på is, ta dem till operationsrummet. Cellerna ska användas inom 2 timmar.
OBS: För att undvika felaktiga injektionsdoser (till exempel på grund av det döda utrymmet i sprutor) bereds en extra cellsuspension (vanligtvis två gånger den erforderliga volymen cellsuspension). Basalmembranmatrisen hålls på is hela tiden eftersom den har koagulationsegenskap över rumstemperatur24.
2. Kirurgi för ortotopisk injektion av osteosarkomcellerna
OBS: Operationsverktygen visas i figur 1.
- Möss uppföddes under specifika patogenfria förhållanden. Alla procedurer gjordes i ett aseptiskt skåp med sterila verktyg.
- Bedöva mössen genom att utsätta dem för 2% isofluran och 98% syre (syreflödeshastighet, 2 L / min).
- Applicera en liten mängd oftalmisk salva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
OBS: Utför hela proceduren i ett välventilerat område. Innan osteosarkomcellinjektion, se till att varje mus är under djup anestesi med en tåklämma; om musen fortfarande har svar, till exempel ryck eller ryck, vänta länge tills ovanstående svar försvinner. - Håll varje mus i ryggläge. Håll musens fotled med tummen och pekfingret och desinficera injektionsstället för tibia med en 70% etanolpinne.
OBS: För att hålla musens fotled hårt är både tummen och pekfingertopparna av stor betydelse för de efterföljande procedurerna. - Rotera fotleden på varje mus utåt för att flytta skenbenet och fibulan och böj knäleden till ett lämpligt läge tills den proximala tibiaplatån (toppen av tibia) är tydligt synlig genom huden (Figur 2A).
- Fäst nålen på en 1 ml spruta och rikta nålspetsen mot injektionsstället. Se till att sprutnålen är parallell med tibias långa axel.
- Perkutant sätt in nålen genom eller intill patellarligamentet när den går genom huden / ledkapseln; th0en, rotera sprutan (1/2 till 3/4-cirkel) för att borra ett hål genom tibiaplattformen mot den distala änden av tibia (medullary cavity) för osteosarkomcellinjektion med en mikrovolymspruta (Figur 2B,C).
OBS: Samtidig rotation av skenbenet kan kännas under borrning om nålspetsen är korrekt. Se till att nålen rör sig framåt med sprutrotationen snarare än att skjutas direkt framåt tills ungefär hälften av nålen är i skenbenet.
- Perkutant sätt in nålen genom eller intill patellarligamentet när den går genom huden / ledkapseln; th0en, rotera sprutan (1/2 till 3/4-cirkel) för att borra ett hål genom tibiaplattformen mot den distala änden av tibia (medullary cavity) för osteosarkomcellinjektion med en mikrovolymspruta (Figur 2B,C).
- Kontrollera om sprutnålen gjorde en framträdande rörelse in i medullärkanalen för att säkerställa framgångsrik borrning.
OBS: Utför en röntgenundersökning (se Materialtabell) för att bekräfta nålens korrekta position och samla in bilderna. - Ladda 143B osteosarkomcellsuspension (från steg 1.5) i en mikrovolymspruta och ersätt 1 ml spruta i skenbenet med den 143B cellbelastade mikrovolymsprutan (Figur 2D). Injicera långsamt ~ 10 μL (ignorera befintlig lösning i nålen) av 143B cellsuspension i varje athymisk mus skenben (ca 2 x 105 celler) utan att applicera högt tryck.
- Tryck på injektionsstället med en bomullspinne i 20-30 s när mikrovolymsprutan avlägsnas.
- Sätt tillbaka varje mus i en ren bur och övervaka noggrant tills musen är helt återställd från anestesi (ca 10 min).
- Övervaka tumörtillväxten in vivo med hjälp av ett röntgenavbildningssystem. Mät den längre diametern (a) och den korta diametern (b) av cancermassan varje vecka med en bromsok för beräkning av tumörvolym (V): V = 1/2 x a x b2.
OBS: Bedöva mössen genom att utsätta dem för 2% isofluran och 98% syre. Mössen bedövades för röntgenavbildning. Intratibia injektion av luciferas eller fluorescerande protein märkta osteosarkomceller möjliggör spårning av primära och metastatiska osteosarkom lesioner.
OBS: Humana endpoints för möss med osteosarkom på grund av tumörtillväxt i knä och lungmetastas baserades på följande kriterier: (1) Body Condition Score, (2) viktminskningströskel på 20%, (3) genomsnittlig maximal diameter för tumörer på 2 cm eller (4) allvarligt begränsat djurbeteende.
3. Patologisk undersökning (insamling av primär- och lungmetastatiskt osteosarkomprov för analys)
- Sex veckor efter osteosarkomcellinjektion, offra mössen genom cervikal dislokation efter att ha utsatt dem för CO 2-inandning.
- Håll musen i ryggläge och sträck båda bakbenen.
- Separera hela benen som bär osteosarkom från inguinalområdet.
OBS: Se till att alla ben är separerade från samma anatomiska plats. - Förbered det histologiska provet av ben som bär osteosarkom genom att ta bort huden, musklerna och fötterna och fixera sedan provet av varje mus i ett 50 ml rör med 20 ml formalinlösning (10%) i 24 timmar, följt av avkalkning i 10% EDTA-lösning i 14 dagar med tillfällig buffertförändring.
- Bädda in provet i paraffin och förbered sektioner för histologisk undersökning efter tidigare publicerat arbete25.
- Separera försiktigt lungorna och lägg dem i ett 50 ml rör fyllt med 20 ml formalinlösning (10%). Efter 24 timmar, överför lungorna på varje mus till ett 15 ml rör med 70% etanol. Bädda in lungorna i paraffin för hematoxylin och Eosin (H & E) färgning och immunohistokemianalys25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrika ortotopiska (primära) osteosarkom och metastatiska lungmodeller beror på den exakta ortotopiska injektionen av osteosarkomceller. Här utvecklades en ortotopisk (primär) osteosarkommodell via intratibial osteosarkomcellinjektion framgångsrikt. Figur 3A visar en representativ mus som bär ortotopisk (primär) osteosarkom, och figur 3B visar en representativ isolerad ortotopisk (primär) osteosarkom. Tumörvolymen mättes en gång i veckan med bromsok och beräknades enligt beskrivningen i steg 2.11 (figur 3C). Den ortotopiska (primära) osteosarkomtillväxten in vivo spårades av både röntgen- och bioluminescensen (när de injicerade cellerna märktes med luciferas) levande avbildningssystem. Röntgenbilderna erhölls från den första veckan till den sjätte veckan efter 143B osteosarkomcellinjektion (figur 3D). Vidare erhölls bilden av ortotopisk (primär) osteosarkomtillväxt in vivo efter att luciferas märkta 143B-celler injicerades i musens skenben (Figur 3E).
Lungmetastasen orsakad av den intratibiella injektionen av luciferasmärkta osteosarkomceller spårades framgångsrikt in vivo av ett bioluminescens levande avbildningssystem (Figur 4A). De metastatiska kolonierna i de isolerade lungvävnaderna visualiserades också under stereomikroskopet (figur 4B). De metastatiska lesionerna bekräftades ytterligare genom H&E-färgning på paraffininbäddade lungvävnader (figur 4C).
Figur 1: Kirurgiska verktyg. (A) 1 ml skala spruta. (B) Spruta med mikrovolym. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representation av intratibial injektionskirurgi. (A) Det intratibiala injektionsstället för en atymisk mus. (B) En steril 1 ml spruta med en åtföljande nål sattes perkutant in i skenbenet mot den distala änden via den proximala tibiaplatån (toppen av skenbenet). (C) En sidovy av borrningsprocessen. Sprutnålen var parallell med den långa tibiaaxeln (heldragen linje). (D) Intratibial injektion med osteosarkomcellbelastad mikrovolymspruta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Visualisering av osteosarkomtillväxten hos möss. (A) Framgångsrik mus ortotopisk osteosarkommodell. (B) Isolerad ortotopisk osteosarkom. (C) Tumörvolymen mättes med en bromsok och beräknades med följande formel: tumörvolym = 0,5 x längre diameter x kort diameter x kort diameter. Felstaplar står för standardavvikelse (n = 8). (D) Röntgenbilder erhölls från samma mus vid en annan tidpunkt (från 1-6 veckor). (E) Bild erhållen den 28: e dagen efter luciferas märkt 143B-celler injicerades i musens skenben. De röda pilarna indikerade luminiscensintensiteten hos den ortotopiska (primära) osteosarkom. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Lungmetastas av osteosarkom. (A) Bild erhållen den 28: e dagen efter luciferas märkt 143B-celler injicerades i musens tibia. De röda pilarna indikerade luminescensintensiteten hos lungmetastasen. (B) De isolerade lungorna med osteosarkommetastaser. De röda pilarna indikerade de metastatiska kolonierna (x20). (C) H&E-färgning visade metastaserande lesioner i lungvävnader (skalstång = 200 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ortotopisk injektion av osteosarkomceller är en idealisk modell för att studera funktionen och mekanismen hos specifika faktorer vid osteosarkomcancerframkallande och utveckling för att utvärdera den terapeutiska effekten. För att undvika skillnader i tumörtillväxt injiceras de flesta aktiva osteosarkomceller vid 80% -90% sammanflytande med samma antal försiktigt i skenbenet hos varje mus, och cellens trypsiniseringstid kontrolleras strikt utan att påverka cellens livskraft. Eftersom cellklumpar påverkar cellräkningen vilket leder till att felaktiga cellnummer injiceras i skenbenet på varje mus, måste cellsuspensionen blandas på lämpligt sätt upp och ner med en pipett för att undvika bildandet av cellklumpar.
En annan kritisk aspekt som måste beaktas är den resuspenderade lösningen för osteosarkomceller. De injicerade cellerna resuspenderas i en basalmembranmatris istället för i PBS eller odlingsmedium. Dessutom är en hög koncentration av basalmembranmatris utmanande att pipetteras och påverkar den exakta volymen; således krävs en lämplig koncentration av basalmembranmatris26. För att borra ett hål genom tibiaplattformen för injektion av osteosarkomceller rör sig nålen framåt med sprutrotationen snarare än att skjutas direkt framåt tills ungefär hälften av nålen är i skenbenet. Mer specifikt appliceras immunbristmöss för att upprätta en ortotopisk osteosarkommodell med användning av humana osteosarkomceller27. Under tiden utförs injektionsproceduren i biologiskt säkerhetsskåp med sterila kirurgiska verktyg. Eftersom möss kan uppleva oro efter anestesi och operation, måste mössen övervakas noggrant den första veckan efter operationen.
Intratibia injektion av osteosarkomceller märkta med fluorescerande protein eller luciferas möjliggör spårning av primära och metastatiska lesioner med hjälp av optisk avbildning28. Osteosarkom är aldrig tillåtet utöver storleksgränsen som i det IACUC-godkända protokollet; Under tiden kan sår uppstå i enorm tumörmassa, vilket kan leda till misslyckade immunohistokemiska analyser. Även om de primära bentumörerna och benmetastaserna nyligen har rapporterats uppnås genom implantation av fast tumörtransplantat i ben, och djuren utvecklade reproducerbar tillväxt, liksom lungmetastaser så småningom29; Författarna implanterade emellertid direkt färska eller kryokonserverade tumörfragment i den proximala tibia, vilket visade nackdelen med öppen kirurgi orsakade potentiell infektion och misslyckande med att utveckla tumörengraftment. Dessutom kommer volymen av implanterade tumörfragment utan strikt kontroll att resultera i en signifikant skillnad i producerad tumörvolym, vilket är svårt att följa applicering, såsom utvärdering av den terapeutiska effekten in vivo. Här rapporteras en enkel och reproducerbar teknik för att etablera intratibia primär osteosarkom med senare lungmetastasmusmodeller via intratibiainjektion av osteosarkomceller. Detta visade fördelarna med att bäst efterlikna de kliniska utvecklingsegenskaperna hos osteosarkom hos människor; exakt antal osteosarkomceller som injiceras direkt i tibia med hjälp av mikrovolymspruta som möjliggör identisk tumörbildningshastighet (100%) och tumörvolym. Metoden säkerställer att man undviker möjligheterna till infektion eller till och med död med hjälp av öppna kirurgiska tekniker och möjliggör livlig övervakning och kvantifiering av osteosarkomtillväxt och metastasering med hjälp av bioluminescensens levande avbildningssystem efter att de injicerade osteosarkomcellerna är märkta med bioluminescens. Detta förhindrar att de injicerade osteosarkomcellerna direkt når blodomloppet och koloniserar i lungorna för att bilda lungemboli och / eller falskt positiv lungmetastas genom att återanvända de injicerade osteosarkomcellerna i lämplig koncentration av basalmembranmatrisen eftersom basalmembranmatrisen har egenskapen att koagulera över rumstemperatur. Den omedelbara koagulationen stöder och begränsar osteosarkomceller i basalmembranmatrisen efter att ha injicerats i musens skenben.
En annan litteratur har rapporterat etablering av benmetastasmodellen genom intrakardiell ympning eller intratibiell ympning av bröstcancerceller30; Celler som används i denna litteratur är emellertid bröstcancerceller, som har olika biologiska och kliniska egenskaper med osteosarkomceller; Dessutom bildas både de intrakardiella och de intratibiella inokuleringsetablerade cancermodellerna i ben genom att cancerceller koloniserar direkt eller når genom blodomloppet snarare än metastaseringsskador som bildas av cancercellspridning från de primära cancerskadorna.
Det finns flera begränsningar i det aktuella protokollet. Möss som används i detta protokoll är genetiska immunsystemdefekt nakna möss utan tymus som hindrar dem från att immunologiskt avvisa mänskliga celler och används ofta i prekliniska prövningar, som inte är tillämpliga för immunfunktionell forskning. Vidare fann vi att inte alla osteosarkomcellinjer är identiskt relevanta i dessa modeller, och tumörigenesförmågorna hos 143B, MNNG, MG-63 och U-2 OS-celler är högre än Saos-2-cellerna.
Sammanfattningsvis är de nuvarande primära och pulmonella metastatiska osteosarkommodellerna som genereras av ortotopisk osteosarkomcellinjektion praktiska verktyg för att studera tumörmikromiljön, effekten av terapier på osteosarkomtillväxt och / eller metastasering. Dessutom, genom intratibia injektion av de genetiskt modifierade osteosarkomcellerna som specifikt riktar sig mot en gen, är modellerna till hjälp för att utforska de viktigaste onkogenerna och tumörsuppressorerna i osteosarkomtillväxt och lungmetastasering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från (1) National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 och 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 och 82174408).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
References
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Yang, C., et al. Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).
- Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).
- Zhang, B., et al. The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51 (2020).
- Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation. Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).
- Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases. Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).
- Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets. Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).
- Mason, N. J. Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).
- Cobb, L. M. Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man. British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).
- Walkley, C. R., et al. Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease. Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).
- Entz-Werlé, N., et al. Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease. Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Chang, J., et al. MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).
- Maloney, C., et al. Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model. Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected]. Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).
- Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).
- Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement. The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. Zebrafish as a model for human osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).
- Hu, S., et al. Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation. International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).
- Chang, J., et al. Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 7605 (2017).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).
- Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
- Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone. Journal of Visualized Experiments. (163), e61313 (2020).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
