Summary
Bu protokol, ortopik osteosarkom ve pulmoner metastaz lezyonlarını taşıyan fare modelleri oluşturmak için intratibia osteosarkom hücre enjeksiyonunu tanımlamaktadır.
Abstract
Osteosarkom, çocuklarda ve ergenlerde en sık görülen primer kemik kanseridir ve akciğerler en sık metastatik bölgedir. Pulmoner metastazı olan osteosarkomlu hastaların beş yıllık sağkalım oranı %30'dan azdır. Bu nedenle, insanlarda osteosarkom gelişimini taklit eden fare modellerinin kullanılması, osteosarkom karsinogenezi ve pulmoner metastazın temel mekanizmasını anlamak ve yeni terapötikler geliştirmek için büyük önem taşımaktadır. Burada, osteosarkom hücrelerinin intratibia enjeksiyonu yoluyla primer osteosarkom ve pulmoner metastaz fare modellerini oluşturmak için ayrıntılı prosedürler bildirilmiştir. Biyolüminesans veya X-ışını canlı görüntüleme sistemi ile birlikte, bu canlı fare modelleri, osteosarkom büyümesini ve metastazını izlemek ve ölçmek için kullanılır. Bu modeli oluşturmak için, osteosarkom hücrelerini içeren bir bazal membran matrisi mikro hacimli bir şırıngaya yüklendi ve anestezi uygulandıktan sonra her bir atimik farenin bir tibiasına enjekte edildi. Fareler, birincil osteosarkom IACUC onaylı protokolde boyut sınırlamasına ulaştığında kurban edildi. Osteosarkom taşıyan bacaklar ve metastaz lezyonu olan akciğerler ayrıldı. Bu modeller kısa bir inkübasyon süresi, hızlı büyüme, ciddi lezyonlar ve primer ve pulmoner metastatik lezyonların gelişimini izlemede duyarlılık ile karakterizedir. Bu nedenle, bunlar osteosarkom karsinogenezi ve pulmoner metastaz, tümör mikroçevresi spesifik faktörlerin fonksiyonlarını ve mekanizmalarını araştırmak ve in vivo terapötik etkinliği değerlendirmek için ideal modellerdir.
Introduction
Osteosarkom, çocuklarda ve ergenlerde en sık görülen primer kemik kanseridir1,2, esas olarak çevre dokuya sızar ve hatta hastalar teşhis edildiğinde akciğerlere metastaz yapar. Pulmoner metastaz osteosarkom tedavisi için temel zorluktur ve pulmoner metastazı olan osteosarkomlu hastaların beş yıllık sağkalım oranı %20-%30 gibi düşük bir seviyededir3,4,5. Bununla birlikte, primer osteosarkomun beş yıllık sağkalım oranı, kemoterapinin başlaması nedeniyle 1970'lerden bu yana yaklaşık% 70'e yükselmiştir6. Bu nedenle, yeni tedaviler geliştirmek için osteosarkom karsinogenezi ve pulmoner metastazın temel mekanizmasını anlamak acilen gereklidir. İnsanlarda osteosarkom ilerlemesini en iyi taklit eden fare modellerinin uygulanması büyük önem taşımaktadır7.
Osteosarkom hayvan modelleri spontan, indüklenmiş genetik mühendisliği, transplantasyon ve diğer tekniklerle üretilir. Spontan osteosarkom modeli, tümör oluşum süresinin uzaması, tümör oluşum hızının tutarsız olması, düşük morbidite ve düşük stabilite nedeniyle nadiren kullanılmaktadır 8,9. İndüklenmiş osteosarkom modelinin elde edilmesi spontan osteosarkomdan daha erişilebilir olmasına rağmen, indükleyici faktör mikroçevreyi, patogenezi ve osteosarkomun patolojik özelliklerini etkileyeceğinden indüklenmiş osteosarkom modelinin uygulanması sınırlıdır10. Transgenik modeller, insan fizyolojik ve patolojik ortamlarını daha iyi simüle edebildikleri için kanserlerin patogenezini anlamaya yardımcı olmaktadır; Bununla birlikte, transgenik hayvan modelleri, transgenik modifikasyonun zorluğu, uzun vadeli ve yüksek maliyeti nedeniyle sınırlamalara sahiptir. Dahası, p53 ve Rb gen modifikasyonu ile üretilen en yaygın kabul gören transgenik hayvan modellerinde bile, dört ekstremite kemiğinde sarkomun sadece% 13.6'sımeydana geldi 11,12.
Transplantasyon, basit manevrası, stabil tümör oluşum hızı ve daha iyi homojenliği nedeniyle son yıllarda en sık kullanılan primer ve uzak metastatik kanser modeli üreten yöntemlerden biridir13. Transplantasyon, heterotopik transplantasyonu ve transplantasyon bölgelerine göre ortotopik transplantasyonu içerir. Osteosarkom heterotopik transplantasyonunda, osteosarkom hücreleri, hayvanların primer osteosarkom bölgelerinin (kemik) dışına, genellikle deri altına, deri altından enjekte edilir14. Heterotopik transplantasyon, hayvanlarda ameliyat yapmaya gerek kalmadan basit olmasına rağmen, osteosarkom hücrelerinin enjekte edildiği bölgeler gerçek insan osteosarkom mikro ortamını temsil etmemektedir. Osteosarkom ortotopik transplantasyonu, osteosarkom hücrelerinin tibia15,16 gibi hayvanların kemiklerine enjekte edilmesidir. Heterotopik greftlerle karşılaştırıldığında, ortotopik osteosarkom greftleri kısa bir kuluçka süresi, hızlı büyüme ve güçlü eroziv doğa ile karakterizedir; bu nedenle, osteosarkomla ilgili çalışmalar için ideal hayvan modelleridir17.
En sık kullanılan hayvanlar fareler, köpekler ve zebra balığıdır18,19. Osteosarkomun spontan modeli genellikle köpeklerde kullanılır, çünkü osteosarkom köpeklerde en sık görülen tümörlerden biridir. Bununla birlikte, bu modelin uygulanması uzun tümör oluşum süresi, düşük tümörigenez hızı, zayıf homojenlik ve stabilite nedeniyle sınırlıdır. Zebra balıkları genellikle hızlı üremeleri nedeniyle transgenik veya nakavt tümör modelleri oluşturmak için kullanılır20. Ancak zebra balığı genleri insan genlerinden farklıdır, bu nedenle uygulamaları sınırlıdır.
Bu çalışma, atimik farelerde osteosarkom hücrelerinin intratibia enjeksiyonu yoluyla pulmoner metastaz ile tibiadaki primer osteosarkomun üretilmesi için ayrıntılı prosedürleri, önlemleri ve temsili görüntüleri açıklamaktadır. Bu yöntem, terapötik etkinlik değerlendirmesi için fare tibiasında primer osteosarkomu oluşturmak için uygulandı ve bu da yüksek tekrarlanabilirlikgösterdi 21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Şangay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi hayvan refahı komitesi tarafından onaylandı. Dört haftalık erkek BALB / c atimik fareler, osteosarkom hücrelerinin ortopik enjeksiyonu için ameliyattan bir hafta önce iklimlendirildi. Fareler, SPF beslemesine ve steril suya ad libitum erişimi olan 12 saatlik açık / karanlık bir döngüde kafes başına beş fare ile ayrı ayrı havalandırılan fare kafeslerine yerleştirildi.
1. Hücrelerin hazırlanması
- Osteosarkom hücresi (143B-Luciferaz) enjeksiyonu gününde, 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında kültürlenmiş %80-90 oranında kaynayan hücreleri PBS (pH 7.4) ile iki kez yıkayın ve 1.5 mL'lik %0.25 tripsin ile 3 dakika boyunca tripsize edin. Daha sonra, tripsini söndürmek için 6 mL% 10 serum içeren MEM ortamı ekleyin ve hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
NOT: 143B-Lusiferaz hücre hattı, pLV-lusiferaz vektörü23 ile 143B hücre hattı transfectinden elde edilir. - Hücre sayma plakasının odasına 20 μL hücre süspansiyonunu aspire edin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın (bkz.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüj yapın.
- Süpernatantı bir pipetle aspire edin ve hücre peletini 8.5 mg/mL'lik bir bazal membran matrisinde (bakınız Malzeme Tablosu) 2 x 107 hücre/mL'lik son konsantrasyona kadar yeniden askıya alın.
- Hücreleri buz üzerinde tutarak, onları ameliyathaneye getirin. Hücreler 2 saat içinde kullanılmalıdır.
NOT: Yanlış enjeksiyon dozlarını önlemek için (örneğin, şırıngalardaki ölü alan nedeniyle), ekstra bir hücre süspansiyonu hazırlanır (genellikle gerekli hücre süspansiyonu hacminin iki katı). Bodrum membran matrisi, oda sıcaklığı24'ün üzerinde pıhtılaşma özelliğine sahip olduğu için her zaman buz üzerinde tutulur.
2. Osteosarkom hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu için cerrahi
NOT: Ameliyat aletleri Şekil 1'de gösterilmiştir.
- Fareler spesifik patojensiz koşullarda yetiştirildi. Tüm prosedürler steril aletlerle aseptik bir dolapta yapıldı.
- Fareleri% 2 izofluran ve% 98 oksijene (oksijen akış hızı, 2 L / dak) maruz bırakarak anestezi yapın.
- Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere az miktarda oftalmik merhem uygulayın.
NOT: Tüm prosedürü iyi havalandırılan bir alanda gerçekleştirin. Osteosarkom hücre enjeksiyonundan önce, her farenin bir ayak parmağı sıkışmasıyla derin anestezi altında olduğundan emin olun; farenin hala seğirme veya sarsıntı gibi yanıtları varsa, yukarıdaki yanıtlar kaybolana kadar uzun süre bekleyin. - Her fareyi sırtüstü pozisyonda tutun. Başparmak ve işaret parmağını kullanarak farenin ayak bileğini tutun ve tibianın enjeksiyon bölgesini %70 etanol çubuğu ile dezenfekte edin.
NOT: Fare ayak bileğini sıkıca tutmak için, hem başparmak hem de işaret parmak uçları sonraki prosedürler için büyük önem taşır. - Tibia ve fibulayı hareket ettirmek için her farenin ayak bileği eklemini dışa doğru döndürün ve proksimal tibia platosu (tibianın üst kısmı) deriden açıkça görülebilene kadar diz eklemini uygun bir konuma getirin (Şekil 2A).
- İğneyi 1 mL'lik bir şırıngaya takın ve iğne ucunu enjeksiyon bölgesine doğru doğrultun. Şırınga iğnesinin tibianın uzun eksenine paralel olduğundan emin olun.
- İğneyi deri / eklem kapsülünden geçerken patellar ligamentin içinden veya bitişiğinden perkütan olarak yerleştirin; th0en, mikro hacimli bir şırınga ile osteosarkom hücre enjeksiyonu için tibia platformundan tibianın (medüller boşluk) distal ucuna doğru bir delik açmak için şırıngayı (1/2 ila 3/4 daire) döndürün (Şekil 2B, C).
NOT: İğne ucu doğruysa, tibianın eşzamanlı dönüşü delme sırasında hissedilebilir. İğnenin, iğnenin yaklaşık yarısı tibiada olana kadar doğrudan ileri itilmek yerine şırınga dönüşü ile ileriye doğru hareket ettiğinden emin olun.
- İğneyi deri / eklem kapsülünden geçerken patellar ligamentin içinden veya bitişiğinden perkütan olarak yerleştirin; th0en, mikro hacimli bir şırınga ile osteosarkom hücre enjeksiyonu için tibia platformundan tibianın (medüller boşluk) distal ucuna doğru bir delik açmak için şırıngayı (1/2 ila 3/4 daire) döndürün (Şekil 2B, C).
- Başarılı bir sondaj sağlamak için şırınga iğnesinin medüller kanala belirgin bir hareket yapıp yapmadığını kontrol edin.
NOT: İğnenin doğru konumunu onaylamak ve görüntüleri toplamak için bir X-ışını muayenesi yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız). - 143B osteosarkom hücre süspansiyonunu (adım 1.5'ten itibaren) mikro hacimli bir şırıngaya yükleyin ve tibiadaki 1 mL şırıngayı 143B hücre yüklü mikro hacimli şırınga ile değiştirin (Şekil 2D). Yüksek basınç uygulamadan her bir atimik farenin tibiasına (yaklaşık 2 x 105 hücre) 143B hücre süspansiyonunun ~ 10 μL'sini (iğnede önceden var olan çözeltiyi göz ardı edin) yavaşça enjekte edin.
- Mikro hacimli şırınga çıkarıldığında enjeksiyon bölgesini 20-30 s pamuklu çubukla bastırın.
- Her fareyi temiz bir kafese geri koyun ve fare anesteziden tamamen kurtulana kadar (yaklaşık 10 dakika) yakından izleyin.
- Bir X-ışını görüntüleme sistemi kullanarak tümör büyümesini in vivo olarak izleyin. Tümör hacmi (V) hesaplaması için bir kumpas ile her hafta kanser kütlesinin daha uzun çapını (a) ve kısa çapını (b) ölçün: V = 1/2 x a x b2.
NOT: Fareleri% 2 izofluran ve% 98 oksijene maruz bırakarak anestezi yapın. Fareler röntgen görüntüleme için anestezi altına alındı. Lusiferaz veya floresan protein etiketli osteosarkom hücrelerinin intratibia enjeksiyonu, primer ve metastatik osteosarkom lezyonlarının izlenmesini sağlar.
NOT: Diz ve akciğer metastazı tümör büyümesine bağlı osteosarkomlu farelerin insancıl sonlanım noktaları aşağıdaki kriterlere dayanıyordu: (1) Vücut Kondisyon Skoru, (2) %20 kilo verme eşiği, (3) 2 cm'lik tümörlerin ortalama maksimum çapı veya (4) ciddi şekilde sınırlı hayvan davranışı.
3. Patolojik inceleme (analiz için primer ve pulmoner metastatik osteosarkom örneği toplanması)
- Osteosarkom hücre enjeksiyonundan altı hafta sonra, fareleri CO2 inhalasyonu için maruz bıraktıktan sonra servikal çıkık ile feda edin.
- Fareyi sırtüstü pozisyonda tutun ve her iki arka bacağı da gerin.
- Osteosarkom taşıyan tüm bacakları kasık bölgesinden ayırın.
NOT: Tüm bacakların aynı anatomik bölgeden ayrıldığından emin olun. - Deri, kaslar ve ayakları çıkararak osteosarkom taşıyan bacakların histolojik örneğini hazırlayın ve ardından her farenin örneğini 24 saat boyunca 20 mL formalin çözeltisi (% 10) ile 50 mL'lik bir tüpte sabitleyin, ardından ara sıra tampon değişimi ile 14 gün boyunca% 10 EDTA çözeltisinde dekalsifikasyon yapın.
- Örneği parafin içine yerleştirin ve daha önce yayınlanmış çalışma25'i takiben histolojik inceleme için bölümler hazırlayın.
- Akciğerleri yavaşça ayırın ve 20 mL formalin çözeltisi (% 10) ile doldurulmuş 50 mL'lik bir tüpe koyun. 24 saat sonra, her farenin akciğerlerini% 70 etanol içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hematoksilin ve Eozin (H & E) boyama ve immünohistokimya testi25 için akciğerleri parafine gömün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı ortotopik (primer) osteosarkom ve metastatik pulmoner modeller, osteosarkom hücrelerinin doğru ortotopik enjeksiyonuna bağlıdır. Burada intratibiyal osteosarkom hücre enjeksiyonu ile ortotopik (primer) osteosarkom modeli başarıyla geliştirilmiştir. Şekil 3A , ortotopik (birincil) osteosarkom taşıyan temsili bir fareyi ve Şekil 3B , temsili izole edilmiş bir ortotopik (birincil) osteosarkomu göstermektedir. Tümör hacmi haftada bir kez kumpas ile ölçüldü ve adım 2.11'de açıklandığı gibi hesaplandı (Şekil 3C). Ortotopik (primer) osteosarkom büyümesi in vivo olarak hem X-ışını hem de biyolüminesans (enjekte edilen hücreler lusiferaz ile etiketlendiğinde) canlı görüntüleme sistemi tarafından izlendi. X-ışını görüntüleri, 143B osteosarkom hücre enjeksiyonundan sonraki ilk haftadan altıncı haftaya kadar elde edildi (Şekil 3D). Ayrıca, in vivo ortotopik (primer) osteosarkom büyümesinin görüntüsü, lusiferaz etiketli 143B hücreleri fare tibiasına enjekte edildikten sonra elde edildi (Şekil 3E).
Lusiferaz işaretli osteosarkom hücrelerinin intratibiyal enjeksiyonunun neden olduğu pulmoner metastazı, biyolüminesans canlı görüntüleme sistemi ile in vivo olarak başarıyla izlendi (Şekil 4A). İzole akciğer dokularındaki metastatik koloniler de stereomikroskop altında görselleştirildi (Şekil 4B). Metastatik lezyonlar parafin gömülü akciğer dokularında H&E boyaması ile doğrulandı (Şekil 4C).
Resim 1: Cerrahi Aletler (A) 1 mL ölçekli şırınga. (B) Mikro hacimli şırınga. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İntratibiyal enjeksiyon cerrahisinin gösterimi. (A) Atimik farenin intratibiyal enjeksiyon bölgesi. (B) Refakatçi iğneli steril 1 mL'lik bir şırınga, proksimal tibia platosu (tibianın tepesi) aracılığıyla distal uca doğru tibia içine perkütan olarak yerleştirildi. (C) Sondaj işleminin yanal görünümü. Şırınga iğnesi uzun tibia eksenine (katı çizgi) paraleldi. (D) Osteosarkom hücresi yüklü mikro hacimli şırınga ile intratibial enjeksiyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farelerde osteosarkom büyümesinin görselleştirilmesi . (A) Başarılı fare ortotopik osteosarkom modeli. (B) İzole ortopik osteosarkom. (C) Tümör hacmi bir kumpas ile ölçüldü ve aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı: tümör hacmi = 0.5 x daha uzun çap x kısa çap x kısa çap. Hata çubukları standart sapma anlamına gelir (n = 8). (D) X-ışını görüntüleri aynı fareden farklı bir zamanda (1-6 haftadan itibaren) elde edildi. (E) Lusiferaz etiketli 143B hücrelerinin fare tibiasına enjekte edilmesinden sonraki 28. günde elde edilen görüntü. Kırmızı oklar ortotopik (primer) osteosarkomun lüminesans yoğunluğunu gösterdi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Osteosarkomun pulmoner metastazı. (A) Lusiferaz etiketli 143B hücrelerinin fare tibiasına enjekte edilmesinden sonraki 28. günde elde edilen görüntü. Kırmızı oklar pulmoner metastazın lüminesans yoğunluğunu gösterdi. (B) Osteosarkom metastazı olan izole akciğerler. Kırmızı oklar metastatik kolonileri gösteriyordu (x20). (C) H&E boyaması akciğer dokularında metastatik lezyonlar gösterdi (ölçek çubuğu = 200 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osteosarkom hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu, osteosarkom karsinogenezindeki spesifik faktörlerin fonksiyon ve mekanizmasını incelemek ve terapötik etkinliği değerlendirmek için gelişmek için ideal bir modeldir. Tümör büyümesindeki farklılıkları önlemek için, aynı sayıda% 80 -% 90 oranında akan aktif osteosarkom hücrelerinin çoğu, her farenin tibiasına dikkatlice enjekte edilir ve hücre tripsinizasyon süresi, hücre canlılığını etkilemeden sıkı bir şekilde kontrol edilir. Hücre kümeleri, her farenin tibiasına yanlış hücre sayımlarının enjekte edilmesine yol açan hücre sayımını etkilediğinden, hücre kümelerinin oluşumunu önlemek için hücre süspansiyonunun bir pipetle uygun şekilde yukarı ve aşağı karıştırılması gerekir.
Dikkate alınması gereken bir diğer kritik husus, osteosarkom hücreleri için resüspanse edilmiş çözeltidir. Enjekte edilen hücreler, PBS veya kültür ortamı yerine bir bazal membran matrisinde yeniden askıya alınır. Ayrıca, yüksek konsantrasyonda bir bazal membran matrisinin pipetlenmesi zordur ve doğru hacmi etkiler; Bu nedenle, uygun bir bazal membran matrisi konsantrasyonu gereklidir26. Osteosarkom hücre enjeksiyonu için tibia platformundan bir delik açmak için, iğneleme, iğnenin yaklaşık yarısı tibiada olana kadar doğrudan ileri itilmek yerine şırınga rotasyonu ile ileriye doğru hareket eder. Daha spesifik olarak, immün yetmezlikli fareler, insan osteosarkom hücrelerini kullanarak ortopik bir osteosarkom modeli oluşturmak için uygulanır27. Bu arada, enjeksiyon prosedürü steril cerrahi aletler kullanılarak biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilir. Fareler anestezi ve ameliyattan sonra huzursuzluk yaşayabileceğinden, fareler ameliyat sonrası ilk haftada yakından izlenmelidir.
Floresan protein veya lusiferaz ile etiketlenmiş osteosarkom hücrelerinin intratibia enjeksiyonu, optik görüntüleme kullanılarak primer ve metastatik lezyonların izlenmesini sağlar28. Osteosarkoma, IACUC onaylı protokolde olduğu gibi boyut sınırının ötesine asla izin verilmez; Bu arada, ülserasyonlar muazzam büyüklükte tümör kütlesinde ortaya çıkabilir ve bu da başarısız immünohistokimyasal analizlere yol açabilir. Her ne kadar primer kemik tümörleri ve kemik metastazının son zamanlarda solid tümör greftinin kemiğe implantasyonu ile elde edildiği bildirilmiş olsa da, hayvanlarda tekrarlanabilir büyüme ve akciğer metastazı gelişti29; Bununla birlikte, yazarlar doğrudan taze veya kriyokorunmuş tümör parçalarını proksimal tibiaya implante ettiler, bu da açık cerrahinin dezavantajının potansiyel enfeksiyona ve tümör engraftmanının gelişememesine neden olduğunu gösterdi. Ayrıca, sıkı kontrol olmaksızın implante edilen tümör fragmanlarının hacmi, üretilen tümör hacminde, terapötik etkinliğin in vivo olarak değerlendirilmesi gibi sonraki uygulamada zor olan önemli bir farklılığa neden olacaktır. Burada, osteosarkom hücrelerinin intratibia enjeksiyonu yoluyla intratibia primer osteosarkomunu, daha sonraki pulmoner metastaz fare modelleri ile kurmak için basit ve tekrarlanabilir bir teknik bildirilmiştir. Bu, insanlarda osteosarkomun klinik gelişim özelliklerini en iyi şekilde taklit etmenin avantajlarını gösterdi; Mikro hacimli şırınga kullanılarak tibia içine enjekte edilen osteosarkom hücrelerinin doğru sayıları, aynı tümör oluşum hızına (% 100) ve tümör hacmine izin verir. Yöntem, açık cerrahi teknikleri kullanarak enfeksiyon ve hatta ölüm olasılıklarından kaçınmayı ve enjekte edilen osteosarkom hücreleri biyolüminesans ile etiketlendikten sonra biyolüminesans canlı görüntüleme sistemini kullanarak osteosarkom büyümesini ve metastazını canlı olarak izlemeye ve ölçmeye izin verir. Bu, enjekte edilen osteosarkom hücrelerinin doğrudan kan dolaşımına ulaşmasını ve pulmoner emboli ve / veya yanlış pozitif pulmoner metastaz oluşturmak için akciğerlerde kolonize olmasını önler, enjekte edilen osteosarkom hücrelerini uygun bazal membran matriksi konsantrasyonunda resüpüle ederek bodrum membran matriksi oda sıcaklığının üzerinde pıhtılaşma özelliğine sahiptir. Anında pıhtılaşma, fare tibiasına enjekte edildikten sonra bazal membran matrisi içindeki osteosarkom hücrelerini destekler ve kısıtlar.
Başka bir literatürde meme kanseri hücrelerinin intrakardiyak aşılaması veya intratibiyal aşılama ile kemik metastazı modelinin oluşturulmasıbildirilmiştir 30; ancak bu literatürde kullanılan hücreler, osteosarkom hücreleri ile farklı biyolojik ve klinik özelliklere sahip meme kanseri hücreleridir; ayrıca kemikte hem intrakardiyak hem de intratibiyal aşılama ile kurulan kanser modelleri, kanser hücresinin primer kanser lezyonlarından yayılımı ile oluşan metastaz lezyonlarından ziyade, kanser hücresinin doğrudan kolonize olması veya kan dolaşımına ulaşması ile oluşur.
Mevcut protokolün birkaç sınırlaması vardır. Bu protokolde kullanılan fareler, insan hücrelerini immünolojik olarak reddetmelerini önleyen timussuz genetik bağışıklık sistemi kusurlu çıplak farelerdir ve bağışıklık fonksiyonel araştırmaları için geçerli olmayan klinik öncesi çalışmalarda yaygın olarak kullanılırlar. Ayrıca, tüm osteosarkom hücre hatlarının bu modellerde aynı şekilde ilişkili olmadığını ve 143B, MNNG, MG-63 ve U-2 OS hücrelerinin tümörigenez yeteneklerinin Saos-2 hücrelerinden daha yüksek olduğunu bulduk.
Sonuç olarak, ortotopik osteosarkom hücre enjeksiyonu ile üretilen mevcut primer ve pulmoner metastatik osteosarkom modelleri, tümör mikroçevresini, terapötiklerin osteosarkom büyümesi ve / veya metastazı üzerindeki etkinliğini incelemek için kullanışlı araçlardır. Ek olarak, spesifik olarak bir geni hedef alan genetiği değiştirilmiş osteosarkom hücrelerinin intratibia enjeksiyonu ile, modeller osteosarkom büyümesinde ve pulmoner metastazda anahtar onkogenleri ve tümör baskılayıcıları araştırmak için yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, (1) Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2018YFC1704300 ve 2020YFE0201600), (2) Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973877 ve 82174408) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
References
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Yang, C., et al. Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).
- Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).
- Zhang, B., et al. The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51 (2020).
- Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation. Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).
- Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases. Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).
- Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets. Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).
- Mason, N. J. Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).
- Cobb, L. M. Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man. British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).
- Walkley, C. R., et al. Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease. Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).
- Entz-Werlé, N., et al. Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease. Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Chang, J., et al. MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).
- Maloney, C., et al. Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model. Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected]. Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).
- Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).
- Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement. The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. Zebrafish as a model for human osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).
- Hu, S., et al. Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation. International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).
- Chang, J., et al. Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 7605 (2017).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).
- Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
- Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone. Journal of Visualized Experiments. (163), e61313 (2020).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
