Summary
בדיקת הפרעות RNA בתפוקה גבוהה (RNAi) באמצעות מאגר של shRNA לנטי-ויראליים יכולה להיות כלי לאיתור מטרות קטלניות סינתטיות רלוונטיות מבחינה טיפולית בממאירות. אנו מספקים גישת סינון shRNA משולבת כדי לחקור את האפקטים האפיגנטיים בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML).
Abstract
הבנת מנגנוני המניע הרלוונטיים מבחינה קלינית של עמידות נרכשת לכימותרפיה היא חיונית להבהרת דרכים לעקוף את העמידות ולשפר את ההישרדות בחולים עם לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). לחלק קטן מהתאים הלוקמיים ששורדים את הכימותרפיה יש מצב אפיגנטי מפויס לסבול עלבון כימותרפי. חשיפה נוספת לכימותרפיה מאפשרת לתאים אלה המתמידים בתרופות להגיע למצב אפיגנטי קבוע, מה שמוביל לביטוי גנים משתנה, וכתוצאה מכך להתרבותן של אוכלוסיות עמידות לתרופות אלה ובסופו של דבר למחלה חוזרת או עקשן. לכן, זיהוי אפנון אפיגנטי המחייב הישרדות של תאים לוקמיים עמידים לתרופות הוא קריטי. אנו מפרטים פרוטוקול לזיהוי מודולטורים אפיגנטיים המתווכים את ההתנגדות לציטרבין האנלוגי הנוקלאוזידי (AraC) באמצעות סינון ספריית shRNA משולבת בקו תאי AML עמיד לציטרבין שנרכשו. הספרייה מורכבת מ-5,485 מבנים של shRNA המכוונים ל-407 גורמים אפיגנטיים אנושיים, מה שמאפשר סינון גורמים אפיגנטיים בתפוקה גבוהה.
Introduction
אפשרויות טיפוליות בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) נותרו ללא שינוי במשך כמעט חמשת העשורים האחרונים, כאשר ציטרבין (AraC) ואנתרציקלין הם אבן הפינה לטיפול במחלה. אחד האתגרים להצלחת הטיפול ב-AML הוא עמידותם של תאי גזע לוקמיים לכימותרפיה, מה שמוביל להישנות המחלה 1,2. ויסות אפיגנטי ממלא תפקיד חיוני בפתוגנזה של סרטן ובעמידות לתרופות, ומספר גורמים אפיגנטיים התגלו כמטרות טיפוליות מבטיחות 3,4,5. מנגנוני ויסות אפיגנטיים משפיעים על התפשטות והישרדות תחת חשיפה מתמשכת לתרופות כימותרפיות. מחקרים בממאירות שאינה המטולוגית דיווחו כי חלק קטן מהתאים המתגברים על השפעת התרופה עוברים שינויים אפיגנטיים שונים, וכתוצאה מכך הישרדותם של תאים אלה 6,7. עם זאת, תפקידם של גורמים אפיגנטיים בתיווך עמידות נרכשת לציטרבין ב-AML לא נחקר.
סינון בתפוקה גבוהה הוא גישה לגילוי תרופות שצברה חשיבות עולמית עם הזמן והפכה לשיטה סטנדרטית בהיבטים שונים לזיהוי מטרות פוטנציאליות במנגנונים תאיים, ליצירת פרופיל מסלולים וברמה המולקולרית 8,9. מושג הקטלניות הסינתטית כולל את האינטראקציה בין שני גנים שבהם ההפרעה של כל אחד מהגנים לבדה היא בת קיימא, אך של שני הגנים גורמת בו זמנית לאובדן הכדאיות10. ניצול קטלניות סינתטית בטיפול בסרטן יכול לסייע בזיהוי ואפיון מכניסטי של אינטראקציות גנטיות סינתטיות קטלניות חזקות11. אימצנו גישה קומבינטורית של בדיקת shRNA בתפוקה גבוהה עם קטלניות סינתטית כדי לזהות את הגורמים האפיגנטיים האחראים לעמידות ציטראבינית נרכשת ב-AML.
לוקמיה חריפה המונעת על ידי טרנסלוקציה כרומוזומלית של גן הלוקמיה המעורבת (MLL או KMT2A) ידועה כקשורה להישרדות לקויה בחולים. התוצרים הכימריים המתקבלים של סידור מחדש של גנים מסוג MLL , כלומר חלבוני היתוך MLL (MLL-FPs), יכולים להפוך תאי גזע/אב המטופויאטיים (HSPCs) לפיצוצים לוקמיים עם מעורבות של גורמים אפיגנטיים מרובים. הרגולטורים האפיגנטיים הללו מהווים רשת מורכבת המכתיבה את תחזוקת תוכנית הלוקמיה, ולכן עלולים ליצור מטרות טיפוליות פוטנציאליות. בהקשר זה, השתמשנו בקו התאים MV4-11 (המכיל את גן ההיתוך MLL MLL-AF4 עם מוטציית FLT3-ITD; המכונה MV4-11 P) כדי לפתח את קו התאים העמיד לציטראבין שנרכש, המכונה MV4-11 AraC R. קו התאים נחשף למינונים הולכים וגדלים של ציטרבין עם החלמה לסירוגין מהטיפול התרופתי, הידוע כחופשת סמים. הריכוז המעכב החצי-מקסימלי (IC50) הוערך על ידי בדיקת ציטוטוקסיות במבחנה .
השתמשנו בספריית ה-shRNA האפיגנטית המאוגנת (ראו טבלת חומרים) המונעת על ידי מקדם hEF1a עם עמוד שדרה pZIP lentiviral. ספריה זו כוללת shRNA המכוונים ל-407 גורמים אפיגנטיים. לכל גורם יש 5-24 shRNA, עם סך של 5,485 shRNA, כולל חמישה shRNA בקרה שאינם ממוקדים. פיגום ה-miR-30 "UltrmiR" שעבר שינוי עבר אופטימיזציה לביוגנזה של shRNA ראשוני יעיל ולביטוי12,13.
קווי המתאר של הניסוי הזה מתוארים באיור 1A. הפרוטוקול הנוכחי מתמקד בסינון RNAi באמצעות ספריית shRNA של גורמים אפיגנטיים בקו התאים MV4-11 AraC R (איור 1B), קו תאי השעיה. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לסנן כל ספרייה ממוקדת בכל קו תאים עמיד לתרופות לפי בחירתו. יש לציין כי פרוטוקול ההתמרה יהיה שונה עבור תאים חסידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עקוב אחר הנחיות הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית (IBSC) והשתמש במתקן המתאים לטיפול בנגיף הלנטי (BSL-2). כוח אדם צריך להיות מאומן כראוי בטיפול וסילוק של lentivirus. פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות הבטיחות הביולוגית של המכללה הרפואית הנוצרית, ולורה.
1. בחירת המקדם החזק ביותר להשגת ביטוי מתמשך וממושך של ה- shRNA
הערה: חיוני לבצע ניסוי התמרה באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים עם מקדמים שונים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים כדי לזהות את המקדם המספק ביטוי יציב וארוך טווח של shRNA בקו התאים שנבחר לניסוי. המקדמים הנפוצים ביותר למטרה זו הם hEF1α (גורם התארכות אנושי 1α), hCMV (ציטומגלווירוס אנושי) ומקדמי SSFV (נגיף יוצר מיקוד בטחול) המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (איור 2A).
- בצע את ספירת התאים באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן. השעו את תאי MV4-11 AraC R במדיום RPMI של 10% (RPMI עם 10% FBS בתוספת 100 פניצילין U/mL ו-100 סטרפטומיצין U/mL) המכילים 8 מיקרוגרם/מ"ל פוליברן. זרע 1 x 106 תאים ב 1.5 מ"ל של בינוני / באר של צלחת שש באר במשולש.
- הוסיפו כמויות שונות של לנטי-וירוסים מרוכזים (לדוגמה, 10 μL, 20 μL ו-40 μL, תלוי בטיטר של נגיפי הלנטי-וירוסים) לכל באר. סובבו בעדינות את הצלחת כדי לערבב את התכולה.
- בצע ספינפקציה על ידי צנטריפוגה ב 920 x g ב 37 °C במשך 90 דקות.
- מיד לדגום את הצלחות בחממת CO2 (5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס).
- שימו לב לביטוי ה-GFP לאחר 48 שעות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח התמרה מוצלחת.
- כימת את ביטוי ה-GFP על ידי ציטומטריית זרימה לאחר 72 שעות כדי להעריך את יעילות ההעתקה.
- תרבית את התאים במשך שבועיים בסך הכל ועקוב אחר ביטוי ה- GFP מעת לעת על ידי ציטומטריה של זרימה. הירידה בביטוי GFP הנמדדת על ידי עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת ואחוז תאי ה-GFP+ מצביעה על השתקת מקדם.
- מיין את תאי ה-GFP+ ביום ה-10 ותרבית את התאים במשך שבוע לאחר המיון. בדוק את הביטוי GFP מעת לעת במהלך התרבות.
- השתמש בתאים הלא מתורגמים כדי להגדיר את השער. אוכלוסייה שמעבר לסולם 1 x 101 לכיוון ימין על ציר ה-x נחשבת לאוכלוסייה חיובית עבור GFP.
- בחר את המקדם המציג ביטוי מתמשך של GFP בתרבית הממושכת של התאים.
2. הכנת ספריית shRNA של גורם אפיגנטי אנושי לנטיוויראלי מרוכז
- תרבית 293T תאים (במספר מעבר נמוך עם קצב התפשטות טוב) בשלוש מנות תרבית תאים של 10 ס"מ עם 8 מ"ל של 10 מ"ל בינוני DMEM (DMEM עם 10% FBS המכיל 100 פניצילין U/ml ו-100 U/ml סטרפטומיצין) בכל צלחת.
- ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 60%, החליפו את המדיום במדיום שלם.
- הכינו את תערובת הטרנספקציה (כמתואר בטבלה 1) המכילה מדיום ללא סרום, אריזות לנטי-ויראליות (psPAX2) ופלסמיד מעטפת (pMD2.G), פלסמידי ספרייה מרוכזים, ולבסוף, את ריאגנט הטרנספקציה.
- הקש על התערובת כדי לערבב אותה היטב ולדגום בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- מוסיפים את תערובת הטרנספקציה לתאי 293T ומערבבים בעדינות על ידי מערבולת הצלחות. דגירה של הצלחות בחממת CO2 (5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס). שנה את המדיום לאחר 24 שעות.
- לאחר 48 שעות, בדקו אם יש ביטוי GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח יעילות גבוהה של טרנספקציה בתאי 293T.
- אספו את חומרי העל של הנגיף לאחר 48 שעות, 60 שעות ו-72 שעות ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הוסיפו מדיום טרי (8 מ"ל) בכל נקודת זמן לאחר איסוף הנגיף.
- מאגר את הווירוס סופרנאטים. הנפח הכולל של הווירוסים המאוגדים יהיה: ~ 8 מ"ל / צלחת x 3 אוספים = ~ 24 מ"ל / צלחת; ~ 24 מ"ל / צלחת x 3 צלחות = ~ 72 מ"ל מתוך 3 צלחות.
- סנן את הווירוסים המאוגדים באמצעות מסנן 0.4 מיקרומטר.
- לקבלת טיטר גבוה של וירוסים, לרכז את הווירוסים המאוגדים על ידי ultracentrifugation. העבר את ה-supernatant של הנגיף המסונן לשני צינורות 70 Ti (32 מ"ל/שפופרת) וצנטריפוגה ב-18,000x גרם למשך שעתיים עם תאוצה איטית והאטה. השתמש ברוטור וצנטריפוגה מראש עד 4 °C (75 °F).
- מוציאים את הצינורות מהצנטריפוגה בעדינות ומסירים את הסופרנאטנט לחלוטין.
- באמצעות micropipette, בעדינות resuspened את הכדור ב 400 μL של DMEM (ללא FBS ואנטיביוטיקה). דגירה על הקרח במשך שעה אחת וערבבו את הכדורים משני הצינורות.
- Aliquot את הווירוסים ומקפיא ב -80 מעלות צלזיוס.
הערה: יש לשמור את הצינורות והווירוסים על הקרח בשלבים 2.10.-2.13. הימנעו מהקצפה תוך כדי החייאה חוזרת של הנגיף עם המדיום הפשוט. המדיום צריך להישמר ב 4 מעלות צלזיוס. - חישוב הריכוז (x) של הנגיף כדלהלן:
נפח כולל לפני ריכוז = 72 מ"ל (72,000 μL)
נפח לאחר ריכוז = 400 μL
הריכוז = 72,000/400 = 180x
3. הערכת יעילות ההתמרה של לנטי-וירוסים
- מתמרים תאי 293T עם הנגיף המרוכז בכמויות שונות (2 μL, 4 μL, 8 μL) כדי לאשר את ההכנה המוצלחת של lentiviruses.
הערה: אם וירוסים מרוכזים מראים יעילות התמרה גבוהה (>50%) בכמויות קטנות (1-2 μL), מומלץ לדלל את הנגיף המרוכז בכמויות הרצויות (100x עד 75x). - דיללו את הנגיף המרוכז ל-100x באמצעות DMEM (ללא FBS ואנטיביוטיקה) כדי לבצע ניסויי טיטרציה בקו התאים MV4-11 AraC R.
- זרע 1 x 106 תאים (MV4-11 AraC R קו תאים ב 1.5 מ"ל של 10% RPMI בינוני המכיל 8 מיקרוגרם / מ"ל פוליברן) בבאר אחת של צלחת שש בארות. הכן ארבע בארות להמרה עם כמויות שונות של וירוסים.
- הוסף ארבעה כרכים שונים (לדוגמה, 1 μL, 1.5 μL, 2 μL ו- 2.5 μL) של וירוסים 100x.
- בצע ספיניקציה על ידי צנטריפוגה של הלוח ב 920 x g במשך 90 דקות ב 37 °C (64 °F).
- לאחר 72 שעות, יש למדוד את אחוז תאי ה-GFP+ לפי ציטומטריית זרימה.
- קבע את נפח הווירוסים כדי להשיג יעילות התמרה של 30%. יעילות התמרה נמוכה זו נועדה להבטיח שילוב של shRNA יחיד לכל תא.
4. התמרה של ספריית shRNA אפיגנטית משולבת בקו התאים העמידים לתרופות
- שמור על קו תאי המטרה MV4-11 AraC R בצפיפות של 0.5 x 106 תאים/מ"ל. ודא שהתאים נמצאים בשלב הצמיחה האקספוננציאלי בתרבית.
- חשב את מספר התאים שיילקחו לניסוי כדלהלן בהתבסס על מספר האינטגרנטים הנגיפיים.
מספר התאים הנדרשים להתמרה = 5,485 (מספר shRNA) × 500 (ייצוג shRNA מתקפל) / 0.25 (MOI) = 10,982,000 ~ 11 x10 6 תאים - Resuspend 1.1 x 107 תאים ב 16 מ"ל של 10% RPMI בינוני.
- מוסיפים פוליברן (8 מיקרוגרם/מ"ל) ומערבבים היטב. לאחר מכן, הוסף את נפח הווירוסים הנדרש כדי לקבל יעילות התמרה של 30% כפי שחושב בסעיף הקודם.
- זרעו את כל התאים על צלחת בת שש בארות בצפיפות של 1 x 106 תאים/1.5 מ"ל של 10% מדיום RPMI לבאר.
- צנטריפוגה את הצלחת במשך 90 דקות ב 920 x g ב 37 °C (64 °F).
- הדגירו את הצלחת למשך הלילה בחממת CO2 (5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס).
- לאחר 24 שעות, לשנות את המדיום ולהעביר את התאים המתומרים לבקבוק T-75.
- לאחר 48 שעות, בדוק את ה- GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח התמרה מוצלחת.
- לאחר 72 שעות, הוסיפו את אחוז תאי ה-GFP+ על ידי ציטומטריית זרימה.
5. העשרת תאים חיוביים ל-GFP
הערה: הרחב את התאים המתומרים על-ידי עיבודם בצפיפות של 0.5 x 106 תאים/מ"ל למשך 5-7 ימים. תאים אלה הם אוכלוסייה מעורבת של מומרים ולא מתורגמים, שנבחרו על סמך GFP על ידי מיון, כפי שצוין בשלב הבא.
- בצע מיון זרימה של תאים שעברו התמרה GFP+ כאשר הגדרות מיון הזרימה מוגדרות כטוהר גבוה ותפוקה נמוכה. השתמש בתאים הלא מתורגמים כדי להגדיר את השער. אוכלוסייה שמעבר ל-1 x 102 ימינה נחשבת לאוכלוסייה חיובית.
- אספו את התאים הממוינים ב-5% RPMI (RPMI עם 5% FBS בתוספת 100 פניצילין U/mL ו-100 U/mL סטרפטומיצין).
- תרבית את התאים הממוינים במדיום RPMI של 10%.
- לאחר 72 שעות, בצע את ההערכה שלאחר המיון של אחוז תאי GFP+ כדי להבטיח יעילות מיון >95%.
הערה: הקפד לקבל ~ 3-5 x 106 GFP תאים חיוביים לאחר המיון כדי לקבל ייצוג של 450x עד ~ 500x של ספריית shRNA.
6. בדיקת נשירה לזיהוי גורמים אפיגנטיים המתווכים עמידות לתרופות
- תרבית ספריית ה-shRNA העבירה תאים ב-10% RPMI למשך עד 5 ימים. שמור בהקפאה של התאים המתומרים לניסויים עתידיים, במידת הצורך, לפני הטיפול התרופתי.
- צנטריפוגה 1 x 107 תאים בכפילויות ב 280 x g במשך 5 דקות ב 25 °C (76 °F). השליכו את הסופרנטנט, ואחסנו את הכדורים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. דגימות אלה ישמשו כהפניה הבסיסית לספריית ה-shRNA האפיגנטית.
- תרבית את התאים המתומרים הנותרים ככפילויות (R1 ו-R2), שכל אחד מהם נשמר בספירת תאים המספקת ייצוג של פי 500 של הספרייה.
- טפלו באחד הכפילויות עם התרופה (10 μM cytarabine) (R2) והשני ללא טיפול תרופתי (R1).
- שנה את המדיום עבור הצלוחיות עם ובלי התרופה כל 72 שעות. חזור על השינוי הבינוני פי 3 לחשיפה מצטברת לתרופות של 9 ימים.
- לאחר 9 ימים של טיפול תרופתי, בדוק את הכדאיות של התאים על ידי שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן.
- צנטריפוגה את התאים הנותרים ב 280 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בצעו החייאה של התאים ב-PBS סטרילי ושטפו את התאים. צנטריפוגה ב 280 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- השליכו את חומר העל ואחסנו את הכדורים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס לצורך מיצוי דנ"א.
7. הגברה של ה-shRNA המשולבים על ידי PCR
- חלץ דנ"א מתאי הבסיס המתומרים (T) (שלב 6.2.) ומהתאים שטופלו בתרופה (R2) ולא טופלו בתרופה (R1).
- בדוק את ריכוז הדגימה באמצעות פלואורומטר.
- חשב את כמות הדנ"א הנדרשת עבור PCR כדלקמן:
5,485 (לא. של shRNAs) × 500 (ייצוג shRNA) × 1 x 6.6−12 (g/דיפלואיד גנום) = 15 מיקרוגרם של DNA - הכפיפו את הדגימות לסבב הראשון של PCR.
הערה: תערובת תגובת ה-PCR מתוארת בטבלה 2 עם תנאי הרכיבה התרמית. פרטי הפריימרים מובאים בטבלה משלימה 1. - הגדר תגובות מרובות המכילות 850 ננוגרם של דנ"א לכל צינור (בסך הכל 43 תגובות).
הערה: הסיבוב הראשון של PCR מגביר את אזורי האגף של ה-shRNA וכתוצאה מכך גודל אמפליקון של 397 bp. - אגד את מוצרי ה-PCR וטהרו את מוצרי ה-PCR באמצעות 3-4 עמודות של ערכת טיהור ג'ל/PCR סטנדרטית.
הערה: הפרטים מפורטים בטבלה 3. - אלקט את המכפלה ב-50 μL של חיץ מכל עמודה ואגד את ה-elutes.
- לכמת את הדנ"א ולאחסן אותו בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.
הערה: הריאגנטים מסומנים בטבלה 4 עם תנאי הרוכב התרמי. ה-PCR בסיבוב השני משתמש בפריימרים עם רצף INDEX הנדרש לריבוב ב-NGS בתא זרימה יחיד. לכן, כל מדגם צריך להיות מתויג עם אינדקס אחר. רצפי פריימרים מופיעים בטבלה משלימה 1. - הגדר ארבע תגובות עם 500 ננוגרם של מוצר ה-PCR העיקרי בנפח תגובה כולל של 50 μL עבור כל דגימה ובקרה השלילית.
- טען את כל המוצר לאלקטרופורזה באמצעות ג'ל אגרוז TBE 2% ואשר את גודל הפס באמצעות סולם מולקולרי של 1 קילובייט. גודלו של האמפליקון הוא 399 bp.
- דמיינו את מוצרי ה-PCR במערכת תיעוד הג'ל.
- הוציאו את הרצועה הספציפית וטהרו באמצעות ערכת טיהור ג'ל.
הערה: חישובים לטיהור באמצעות הערכה מופיעים בטבלה 3. - Elute בכרך סופי של 30 μL של מאגר elution. הריכוז המשוער של כל אלואנט יהיה סביב 80-90 ננוגרם/מיקרול עם נפח כולל של 30 מיקרול'.
8. ריצוף וניתוח נתונים מהדור הבא
- רוצף את המוצר המטוהר בג'ל משלב 7.13. על רצף מהדור הבא (למשל, אילומינה) כדי לקבל את ספירת הקריאה עבור ה-shRNA המדולדלים.
- חתוך את רצפי המתאמים של קריאות FastQ שנוצרו באמצעות ערכת הכלים Fastx (גרסה 0.7).
- יישר את הקריאות המסוננות לרצפי ייחוס באמצעות יישור קשת Bowtie עם הפרמטר של מתן אפשרות לשני אי-התאמות. ודא שאורך הקריאה לאחר חיתוך המתאם הוא סביב 21 bp.
- טען את הקבצים באמצעות תוכנית Samtools (גרסה 1.9). השתמש באפשרות Flagstat וחשב את סיכום היישור.
- טען את קבצי fastQ החתוכים בתוכנת CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) יחד עם רצפי ה- shRNA הייחוסים בצורה של קבצי FASTA ובצע את הניתוח בהתאם להוראות.
- לחץ על הקישור התחל ניתוח ב- CC2.
- בחר את סוג המסך כמסכי הישרדות ונשירה. הגדר את מספר הקבוצות והקלד את השם עבור כל קבוצה.
- העלה את ספריית ההפניות בתבנית קובץ FASTA. הנתונים המועלים מעובדים. לחץ על כתובת ה- URL של הפלט כדי לקבל את התוצאות.
הערה: תוכנה זו משתמשת במודל בטא-בינומי עם מבחן t של סטודנט שונה כדי למדוד הבדלים ברמות sgRNA/shRNA, ואחריו בדיקת ההסתברות המשולבת של פישר כדי להעריך את המשמעות ברמת הגן. הוא מחשב את השינויים הכוללים המשוערים של יומן2 (Log2Fc) של shRNA עבור הגורמים האפיגנטיים בין הדגימות המטופלות (מועשרות/מדולדלות) לבין הדגימות הלא מטופלות (הבסיס) עם "ערכי p" ו-"FDR".
- ודא שערך ה- FDR הוא "שלילי" עבור מסך נשירה ו-"חיובי" עבור מסך הישרדות.
הערה: CC2 היא פלטפורמת ניתוח לספירת הקריאות וחישוב ייצוג הקפל (העשרה או דלדול) של shRNA בין דגימות. - זהה את ה-shRNA המועשר והמדולדל באופן משמעותי (FDR <0.05) מתוצאות ה-CC2.
הערה: ישנם 5-24 shRNA נגד כל גורם. בדוק את ערכי ה- FDR עבור כל אחד מה- shRNAs; שקול את ה- FDR, שהוא <0.01, וקח ממוצע עבור ה- shRNA שנבחרו. קחו למשל את 40 הלהיטים המובילים. התוויית הגרף עבור הגורמים שנבחרו בהתבסס על ערכים שליליים של Log2Fc או FDR. ודא של-shRNA שאינם ממוקדים יש גם ערכי FDR משמעותיים כדי להבטיח את האותנטיות של הנתונים מכיוון שהם משמשים כ-shRNA בקרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרימת העבודה הכוללת של הסינון מתוארת באיור 1A. ציטוטוקסיות במבחנה של MV4-11 AraC R (48 שעות) גילתה שה-IC50 לציטרבין ב-MV4-11 AraC R גבוה יותר מה-MV4-11 P (איור 1B). קו תאים זה שימש במחקר כמודל לסינון הגורמים האפיגנטיים האחראים לעמידות לציטראבין.
איור 2A מראה את המפות הווקטוריות הליניאריות של pZIP עם שלושה מקדמים שונים: hEF1α (גורם התארכות אנושי 1α), hCMV (נגיף ציטומגלווירוס אנושי) ו-SSFV (נגיף יוצר מיקוד בטחול), עם ה-shRNA המקושקש בתוך רצף ה-UltramiR. איור 2B ממחיש את המפה הווקטורית pZIP ששימשה בניסוי הספרייה ואת ה-shRNA המכוון לגורם האפיגנטי עם Zsgreen ו-puromycin כסמן הניתן לבחירה המונע על ידי מקדם hEF1a. וקטורים אלה שימשו בבחירת ניסוי המקדם החזק ביותר.
הבחירה של המקדם החזק ביותר כדי לקבל ביטוי עקבי וממושך בתאי המטרה מומחשת באיור 3. הכימות של GFP שנמדד על ידי MFI הראה יותר מ -90% יעילות התמרה בסוף 72 שעות ב- MV4-11 AraC R עבור כל שלושת היזמים. ההיסטוגרמה לביטוי GFP מראה אוכלוסייה הטרוגנית עבור hCMV אך הומוגנית במקרה של hEF1a ו-SFFV ביום 3 של ההתמרה (איור 3A). גרף העמודות מציג את ביטוי ה-GFP שמונע על-ידי שלושה מקדמים שונים (hEF1α, hCMV ו-SFFV) ביום 3 של ההעתקה ב-MV4-11 AraC R (איור 3B). GFP מונחה SFFV הראה ירידה ב-MFI ביום החמישי של ההעתקה (איור 3C). לא נצפתה ירידה ב-MFI במיון הפוסטים של קו ההורים MV4-11 המונע על-ידי HEF1a על-ידי GFP. לפיכך, מקדם hEF1a זוהה כמקדם מתאים לקו התא (איור 3D).
איור 4A ממחיש את יעילות הטרנספקציה של פלסמידי ספריית ה-shRNA המאוגדים בתאי 293T לאחר 48 שעות של טרנספקציה. ביטוי ה-GFP היה בהיר, והצביע על יעילות טרנספקציה טובה. לאחר איסוף הנגיף, יעילות ההעתקה של הנגיף המאוגד המוכן נבדקה בתאי 293T בשלושה ריכוזים שונים (2 μL, 4 μL ו-8 μL). ראינו שאפילו נגיף 2 μL הביא לאותה יעילות כמו זו של נגיף 8 μL, ובכך אישר את הטיטר הנגיפי הגבוה (איור 4B).
איור 5 ממחיש את התמרת הספרייה המשולבת בקו התאים MV4-11 AraC R ואת קביעתו של טיטר הלנטי-ויראלי. נגיף ה-lentivirus של ספריית ה-shRNA מדולל פי 100 ולאחר מכן נוסף לקו התאים MV4-11 AraC R בנפחים שונים (1 μL, 1.5 μL, 2 μL ו-2.5 μL). היעילות נבדקה בסוף 72 שעות. יעילות ההעתקה הייתה 30% עבור 2-2.5 מיקרול' של הנגיף, מה שאישר אינטגרציה של shRNA אחד לכל תא (איור 5A). התמרה עם 2.5μl של וירוס ספרייה מאגר ב 1.1 x 107 MV4-11 תאי AraC R הביאה ליעילות טרנסדוקציה של 30%. תאים חיוביים ל-GFP מוינו, המייצגים את ספריית ה-shRNA המאוגנת (איור 5B).
לאחר התמרת נגיף הלנטי האפיגנטי של shRNA בקו התאים MV4-11 AraC R, התאים החיוביים ל-GFP מוינו ביום 5 או ביום 7 (איור 6). תאים ממוינים אלה היו נתונים לחשיפה ממושכת לציטרבין במשך 9 ימים. הכדאיות נבדקה ביום התשיעי, והתאים נאספו לדנ"א. (איור 6א). גרף העמודות מראה את הירידה בקצב ההתפשטות של התאים המתומרים בנוכחות ציטרבין (איור 6B).
הדנ"א שחולץ מהדגימות היה נתון לשני סבבים של PCR, והמוצר הסופי של הג'ל המלוטש ייצג את ה-shRNA המועשר שכומת על ידי NGS. איור 7A מראה את אזורי הקישור של הפריימר המשמשים בסיבוב הראשון והשני של ה-PCR, שבהם הפריימרים העגולים הראשונים נקשרים לאזורי האגף של ה-shRNA המשולב, והפריימר הקדמי השני נקשר לרצף הלולאה. הפריימר ההפוך נקשר לאזור של הווקטור המוגברה בסיבוב הראשון של PCR. איור 7B ואיור 7C ממחישים את גודל הפס של מוצר ה-PCR בסוף ה-PCR בסוף ה-1 (397 bp) וב-PCR בסיבוב השני (399 bp), שהיה ג'ל-eluted, טוהר והוגש לניתוח NGS.
לאחר שהעבירו את הדנ"א להליך בקרת איכות סטנדרטי, הדגימות עובדו לניתוח NGS. השתמשנו ב-CRISPRCloud2, פלטפורמת ניתוח ידידותית למשתמש ומבוססת ענן לזיהוי shRNA מועשרים ומדולדלים בסינון shRNA המאוגד. איור 8 ממחיש את הייצוג של shRNA מועשרים או מדולדלים המכוונים לגורמים אפיגנטיים שיכולים לתווך עמידות לציטרבין ב-AML.
איור 1: מתווה ומודל של המחקר. (B) תאים הורים MV4-11 ותאים עמידים ל-AraC שטופלו בריכוזי ציטרבין הולכים וגדלים (0.1 μM עד 1000 μM) והערכת כדאיות על ידי בדיקת MTT. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2. המחשה של הווקטורים הליניאריים. (A) שלוש המפות הווקטוריות עם שלושה מקדמים שונים, hEF1α (גורם התארכות אנושי 1α), hCMV (ציטומגלווירוס אנושי) ו-SSFV (נגיף יוצר מיקוד בטחול), עם ה-shRNA המקושקש בתוך רצף ה-UltramiR. (B) המחשה של המפה הווקטורית ששימשה בניסוי הספרייה עם מקדם hEF1α וה-shRNA המכוון לגורם האפיגנטי עם Zsgreen ו-puromycin כסמן הניתן לבחירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: בחירה של המקדם החזק ביותר כדי לקבל ביטוי מתמשך וממושך של ה-shRNA. (A) חלקות זרימה מייצגות עבור GFP שמכומתות על ידי ציטומטריית זרימה בסוף 72 שעות עבור מקדמי hEF1a, hCMV ו-SFFV. hCMV מראה שיא הטרוגני, בעוד ש-hEF1a ו-SFFV מראים שיא הומוגני יחיד. (B) יעילות מקדם בקו התאים MV4-11 AraC R. (C) GFP מונחה SFFV מראה השתקה של GFP בתרבות ממושכת. (D) תאי GFP מונחי hEF1a מראים ביטוי מתמשך לאחר מיון התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: בדיקת היעילות של נגיף ה-shRNA lentivirus. (A) תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות מראות את יעילות הטרנספקציה של ספריית ה-shRNA המאוגנת שעברה טרנספקציה ב-293T בסוף 48 שעות באמצעות הגדלה של פי 10. (B) יעילות ההעתקה של הנגיף המאוגד הוערכה בתאי 293T עם נפחי וירוסים משתנים (2μL, 4μL ו-8μL) באמצעות הגדלה של פי 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: התמרת ספרייה מאוגדת בקו תאי המטרה וקביעת קו תאי lentiviral titer. (A) MV4-11 AraC R מומרים בנפחים משתנים של וירוסים (1μL, 1.5μL, 2μL ו-2.5μL). היעילות נבדקה בסוף 72 שעות (B) התמרה של נגיף הספרייה המאוגדת בתאי 1 x 107 MV4-11 AraC R כדי להשיג יעילות התמרה של 30%, ולאחר מכן מיון של תאים חיוביים ל-GFP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: בדיקת נשירה לזיהוי גורמים אפיגנטיים המתווכים עמידות לתרופות. תאים נגועים בספרייה היו נתונים לחשיפה ממושכת לציטרבין במשך 9 ימים, ולאחר מכן בדקו את הכדאיות ואספו את התאים למיצוי DNA. (B) הפחתת הכדאיות לחשיפה ממושכת לציטרבין בקווי תאים עמידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: הכנת האמפליקונים המייצגים את ה-shRNA המשולב. (A) אזורי הקישור של הפריימר המשמשים בסיבוב הראשון והשני של ה-PCR, כאשר הפריימרים העגולים ה-1 נקשרים לאזורי האגף של ה-shRNA המשולב והפריימר הקדמי השני נקשר לרצף הלולאה. ההיפוך נקשר לאזור באזור הווקטורי המוגבר ב-PCR הראשון. (B) המחשה של גודל הפס של מוצר ה-PCR בסוף הסיבוב הראשון של ה-PCR (397 bp). (C) מוצר ה-PCR בסיבוב השני (399bp) עבר ג'ל-eluted, טוהר וניתן עבור NGS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: ההקרנה יוצרת את קו התאים AML (קו התאים MV-4-11 Ara-C R). לאחר שהעבירו את הדנ"א להליך בקרת איכות סטנדרטי, הדגימות עובדו לניתוח NGS. השתמשנו ב-CRISPRCloud2, פלטפורמת ניתוח ידידותית למשתמש ומבוססת ענן, כדי לזהות shRNA מועשרים ומדולדלים בסינון ה-shRNA המאוגד. האיור מייצג shRNAs מועשרים או מדולדלים המכוונים לגורמים אפיגנטיים שיכולים לתווך עמידות לציטרבין ב-AML. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: הכנת תערובת פלסמיד טרנספקציה (חישוב לצלחת 10 ס"מ) אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: תערובת תגובת PCR עבור 1st סיבוב של PCR אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: חישובים לטיהור המוצרים של 1st of PCR אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 4: תערובת תגובת PCR לסיבוב השני של PCR אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרעות RNA (RNAi) נמצאות בשימוש נרחב למחקרי גנומיקה פונקציונליים, הכוללים בדיקות siRNA ו-shRNA. היתרון של shRNA הוא שהם יכולים להיות משולבים בווקטורים של פלסמידים ולשלב אותם בדנ"א הגנומי, וכתוצאה מכך ביטוי יציב, ולכן, פגיעה ממושכת יותר של ה-mRNA של המטרה. הקרנה משולבת של ספריית shRNA היא חזקה וחסכונית בהשוואה למסכים המערכים הקונבנציונליים (siRNA). זיהוי החיוניות של סוג מסוים של חלבונים במסך רחב-גנום יכול להיות מסורבל. גישות סינון ממוקדות יכולות לחשוף את החיוניות של חלבונים בודדים להישרדות תאים סרטניים או לעמידות לתרופות בתוך המעמד הספציפי עם רעש מופחת. פרוטוקול זה מדגיש את מסך ה-RNAi של גורמים אפיגנטיים כדי לחקור גנים חיוניים ולא חיוניים באופן שיטתי, והוא מדגים את השימוש בגישה זו כפלטפורמה פונקציונלית המאפשרת זיהוי של מטרות האחראיות לעמידות לתרופות AML.
טכנולוגיה רבת עוצמה זו דורשת אמצעי זהירות מסוימים בתכנון ובביצוע הניסויים. הראשון הוא הבחירה של מקדמים שאינם עוברים השתקה משמעותית במהלך תרבית התאים לביטוי של shRNA מכיוון שהביטוי החזק שלהם הוא קריטי להפלת גנים של מטרה. שנית, לשמירה על ייצוג ה-shRNA (מספר התאים המתומרים עם כל shRNA) יש חשיבות מיוחדת. לאורך כל מסך ה-shRNA, ייצוג ממוצע של >500 תאים לכל מבנה shRNA מגביר את הפוטנציאל לזיהוי ה-shRNA הגורמים להשפעות פנוטיפיות.
אסטרטגיית הסינון של RNAi היא מסך צמיחה תחרותי; לכן, חשוב לוודא שתאי היעד נמצאים בשלב הגדילה הלוגריתמית ולא נפגשים יתר על המידה במהלך המסך כדי למזער את אובדן הייצוג הנגרם על ידי צמיחה מוגבלת. זה אידיאלי לשמור על התאים ב 50%-70% מפגש כדי למזער וריאציות ניסיוניות. אנו ממליצים לשמור על כמות עקבית של מדיה, סרה, סופרנאטורים ויראליים, תרופות וכלי פלסטיק מתרביות רקמה עבור כל שכפולי המסכים כדי להפחית את השונות הניסויית.
מומלץ לבצע ניסויי פיילוט כדי לייעל את יעילות ההעתקה של נגיף הלנטי כדי לחשב את נפח הנגיפים הנדרשים כדי להשיג אינטגרציה אחת של shRNA לכל תא. כדי להשיג אינטגרציה זו של shRNA אחד לכל תא, יעילות ההעתקה צריכה להיות פחות מ -30%. מכיוון שהכמות, של וירוסים כדי לקבל 30% תאים מותמרים עשויה להשתנות בין קווי התאים המשמשים לניסויים, נדרש ניסוי סטנדרטיזציה עבור כל קו תאים. יעילות ההתמרה יכולה להיות מושפעת גם מתנאי תרביות התאים ומקצב התפשטות התאים. לפיכך, יש לקבוע טיטרים פונקציונליים בניסוי הפיילוט תוך שימוש באותם תנאים בהם נעשה שימוש בניסוי ההקרנה. שמירה על 3-6 שכפולים תמיד רצויה כדי לקבל להיטים מובהקים סטטיסטית.
שני החששות העיקריים של גישת הסינון של shRNA הם ההשפעות מחוץ למטרה ויעילות ההדחה המשתנה של shRNA16. ניתן להתגבר על אלה באמצעות מספר shRNA של כל גן. התאמת מערכת החיסון הפרוקריוטית CRISPR-Cas9 בתאי יונקים אפשרה עריכת גנום קלה, יעילה וחסכונית בתאים אנושיים בתרבית. מערכת זו נוצלה באופן נרחב לביצוע בדיקות גנטיות כלל-גנומיות הדומות לאלה שבוצעו באמצעות shRNA. ניתן לעקוב אחר גורלם של תאים בעלי רצף RNA (sgRNA) מסוים בעל מדריך יחיד באמצעות ריצוף עמוק. המערך הניסיוני המתואר כאן יכול לשמש גם לסינון קריספר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים ואין להם מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה ממומן בחלקו על ידי מענק המחלקה לביוטכנולוגיה BT/PR8742/AGR/36/773/2013 ל-SRV; והמחלקה לביוטכנולוגיה של הודו BT/COE/34/SP13432/2015 והמחלקה למדע וטכנולוגיה, הודו: EMR/2017/003880 עד P.B. RVS ו-P.B. נתמכים על ידי Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 ו-IA/S/15/1/501842, בהתאמה. S.D. נתמך על ידי מלגת CSIR-UGC, ו- S.I. נתמך על ידי מלגת מחקר בכירה של ICMR. אנו מודים לאבהירופ באגצ'י, לסנדיה ראני ולצוות מתקן הליבה של CSCR Flow Cytometry על עזרתם. אנו מודים גם ל- MedGenome Inc. על העזרה בריצוף בתפוקה גבוהה ובניתוח נתונים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P.
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
