Summary
El cribado de interferencia de ARN (ARNi) de alto rendimiento utilizando un grupo de shRNAs lentivirales puede ser una herramienta para detectar dianas letales sintéticas terapéuticamente relevantes en neoplasias malignas. Proporcionamos un enfoque de detección de ARNt agrupado para investigar los efectores epigenéticos en la leucemia mieloide aguda (LMA).
Abstract
Comprender los mecanismos impulsores clínicamente relevantes de la quimiorresistencia adquirida es crucial para dilucidar las formas de eludir la resistencia y mejorar la supervivencia en pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA). Una pequeña fracción de las células leucémicas que sobreviven a la quimioterapia tienen un estado epigenético preparado para tolerar el insulto quimioterapéutico. La exposición adicional a la quimioterapia permite que estas células persistentes de medicamentos alcancen un estado epigenético fijo, lo que conduce a una expresión génica alterada, lo que resulta en la proliferación de estas poblaciones resistentes a los medicamentos y, finalmente, en una recaída o enfermedad refractaria. Por lo tanto, es fundamental identificar las modulaciones epigenéticas que requieren la supervivencia de las células leucémicas resistentes a los medicamentos. Detallamos un protocolo para identificar moduladores epigenéticos que median la resistencia a la citarabina analógica de nucleósidos (AraC) utilizando el cribado de la biblioteca de SHRNA agrupado en una línea celular de LMA adquirida resistente a la citarabina. La biblioteca consta de 5.485 construcciones de shRNA dirigidas a 407 factores epigenéticos humanos, lo que permite la detección del factor epigenético de alto rendimiento.
Introduction
Las opciones terapéuticas en la leucemia mieloide aguda (LMA) se han mantenido sin cambios durante casi las últimas cinco décadas, con la citarabina (AraC) y las antraciclinas como la piedra angular para el tratamiento de la enfermedad. Uno de los desafíos para el éxito de la terapia con LMA es la resistencia de las células madre leucémicas a la quimioterapia, lo que lleva a la recaída de la enfermedad 1,2. La regulación epigenética juega un papel vital en la patogénesis del cáncer y la resistencia a los medicamentos, y varios factores epigenéticos han surgido como objetivos terapéuticos prometedores 3,4,5. Los mecanismos reguladores epigenéticos afectan la proliferación y la supervivencia bajo la exposición continua a fármacos quimioterapéuticos. Los estudios en neoplasias malignas no hematológicas han informado que una pequeña fracción de células que superan el efecto del fármaco sufren diversas modificaciones epigenéticas, lo que resulta en la supervivencia de esas células 6,7. Sin embargo, no se ha explorado el papel de los factores epigenéticos en la mediación de la resistencia adquirida a la citarabina en la LMA.
El cribado de alto rendimiento es un enfoque para el descubrimiento de fármacos que ha ganado importancia global con el tiempo y se ha convertido en un método estándar en diferentes aspectos para identificar objetivos potenciales en mecanismos celulares, para el perfil de vías y a nivel molecular 8,9. El concepto de letalidad sintética implica la interacción entre dos genes donde la perturbación de cualquiera de los genes por sí sola es viable, pero de ambos genes simultáneamente resulta en la pérdida de viabilidad10. Explotar la letalidad sintética en el tratamiento del cáncer podría ayudar a identificar y caracterizar mecánicamente interacciones genéticas letales sintéticas robustas11. Hemos adoptado un enfoque combinatorio de cribado de shRNA de alto rendimiento con letalidad sintética para identificar los factores epigenéticos responsables de la resistencia adquirida a la citarabina en la LMA.
Se sabe que las leucemias agudas impulsadas por la translocación cromosómica del gen de la leucemia de linaje mixto (MLL o KMT2A) se asocian con una supervivencia deficiente en los pacientes. Los productos quiméricos resultantes de los reordenamientos del gen MLL , es decir, las proteínas de fusión MLL (MLL-FPs), pueden transformar las células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en blastos leucémicos con la participación de múltiples factores epigenéticos. Estos reguladores epigenéticos constituyen una red complicada que dicta el mantenimiento del programa de leucemia y, por lo tanto, podrían formar potenciales dianas terapéuticas. En este contexto, utilizamos la línea celular MV4-11 (que alberga el gen de fusión MLL MLL-AF4 con la mutación FLT3-ITD; denominada MV4-11 P) para desarrollar la línea celular resistente a la citarabina adquirida, denominada MV4-11 AraC R. La línea celular fue expuesta a dosis crecientes de citarabina con recuperación intermitente del tratamiento farmacológico, conocido como vacaciones de drogas. La concentración inhibitoria medio máxima (IC50) se evaluó mediante ensayo de citotoxicidad in vitro .
Se utilizó la biblioteca de shRNA epigenética agrupada (ver Tabla de Materiales) impulsada por el promotor hEF1a con una columna vertebral lentiviral pZIP. Esta biblioteca comprende shRNAs dirigidos a 407 factores epigenéticos. Cada factor tiene de 5 a 24 shRNAs, con un total de 5.485 shRNAs, incluyendo cinco shRNAs de control no objetivo. El andamio miR-30 "UltrmiR" modificado ha sido optimizado para una biogénesis y expresión eficientes de shRNA primario12,13.
El esquema de este experimento se ilustra en la Figura 1A. El protocolo actual se centra en el cribado de ARNi utilizando la biblioteca de ARNt shRNA del factor epigenético en la línea celular MV4-11 AraC R (Figura 1B), una línea celular en suspensión. Este protocolo se puede utilizar para examinar cualquier biblioteca dirigida en cualquier línea celular resistente a los medicamentos de su elección. Cabe señalar que el protocolo de transducción será diferente para las células adherentes.
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Protocol
Siga las pautas del Comité Institucional de Bioseguridad (IBSC) y use la instalación adecuada para manejar el lentivirus (BSL-2). El personal debe estar debidamente capacitado en el manejo y eliminación de lentivirus. Este protocolo sigue las pautas de bioseguridad de Christian Medical College, Vellore.
1. Selección del promotor más potente para obtener una expresión persistente y prolongada de los shRNAs
NOTA: Es imprescindible realizar un experimento de transducción utilizando vectores lentivirales con diferentes promotores que expresan proteínas de fluorescencia para identificar el promotor que proporciona una expresión estable y a largo plazo de shRNAs en la línea celular seleccionada para el experimento. Los promotores más utilizados para este propósito son los promotores hEF1α (factor de elongación humana 1α), hCMV (citomegalovirus humano) y SSFV (virus formador de foco del bazo) que expresan la proteína de fluorescencia verde (GFP) (Figura 2A).
- Realice el recuento de celdas mediante el método de exclusión de azul tripano. Suspender las células MV4-11 AraC R en medio RPMI al 10% (RPMI con FBS al 10% suplementado con penicilina 100 U/mL y estreptomicina 100 U/mL) que contengan 8 μg/mL de polibreno. Sembrar 1 x 106 células en 1.5 mL de medio/pocillo de una placa de seis pocillos en triplicados.
- Agregue diferentes volúmenes de lentivirus concentrados (por ejemplo, 10 μL, 20 μL y 40 μL dependiendo del título de los lentivirus) a cada pozo. Agite suavemente la placa para mezclar el contenido.
- Realizar la espinfección por centrifugación a 920 x g a 37 °C durante 90 min.
- Incubar inmediatamente las placas en una incubadora de CO2 (5% CO2 a 37 °C).
- Observe la expresión de GFP después de 48 h bajo un microscopio de fluorescencia para garantizar una transducción exitosa.
- Cuantificar la expresión de GFP por citometría de flujo después de 72 h para evaluar la eficiencia de transducción.
- Cultive las células durante un total de 2 semanas y controle la expresión de GFP periódicamente mediante citometría de flujo. La reducción en la expresión de GFP medida por la intensidad media de fluorescencia y el porcentaje de células GFP+ indican silenciamiento promotor.
- Clasifique las células GFP + en el día 10 y cultive las células durante 1 semana después de la clasificación. Compruebe la expresión GFP periódicamente durante la referencia cultural.
- Utilice las celdas no transducidas para establecer la puerta. Una población más allá de la escala 1 x10 1 hacia la derecha en el eje x se considera una población positiva para GFP.
- Elija el promotor que muestre una expresión persistente de GFP en el cultivo prolongado de las células.
2. Preparación de la biblioteca de shRNA del factor epigenético humano lentiviral agrupado
- Cultivo de células 293T (a un número de paso bajo con una buena tasa de proliferación) en tres placas de cultivo celular de 10 cm con 8 mL de medio DMEM al 10% (DMEM con FBS al 10% que contiene 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina) en cada placa.
- Una vez que las células alcancen el 60% de confluencia, reemplace el medio con un medio completo.
- Prepare la mezcla de transfección (como se describe en la Tabla 1) que contenga medio libre de suero, empaque de lentiviral (psPAX2) y plásmido de envoltura (pMD2.G), plásmidos de biblioteca agrupados y, finalmente, el reactivo de transfección.
- Toca la mezcla para mezclarla bien e incuba a temperatura ambiente durante 15 min.
- Agregue la mezcla de transfección a las células 293T y mezcle suavemente girando las placas. Incubar las placas en una incubadora de CO2 (5% CO2 a 37 °C). Cambiar el medio después de 24 h.
- Después de 48 h, verifique la expresión de GFP bajo un microscopio de fluorescencia para garantizar una alta eficiencia de transfección en las células 293T.
- Recoja los sobrenadantes del virus después de 48 h, 60 h y 72 h y guárdelos a 4 °C. Agregue un medio fresco (8 ml) en cada punto de tiempo después de recolectar el virus.
- Agrupar los sobrenadantes del virus. El volumen total de los virus agrupados será: ~8 mL/placa x 3 colecciones= ~24 mL/placa; ~24 mL/placa x 3 placas = ~72 mL de 3 placas.
- Filtre los virus agrupados con el filtro de 0,4 μm.
- Para obtener un título alto de virus, concentre los virus agrupados por ultracentrifugación. Transfiera el sobrenadante del virus filtrado a dos tubos de 70 Ti (32 ml/tubo) y centrífuga a 18.000x g durante 2 h con aceleración y desaceleración lentas. Utilice un rotor y una centrífuga preenfriados a 4 °C.
- Saque los tubos de la centrífuga suavemente y retire el sobrenadante por completo.
- Usando una micropipeta, resusped suavemente el pellet en 400 μL de DMEM (sin FBS y antibióticos). Incubar en el hielo durante 1 h y mezclar los pellets de ambos tubos.
- Alícuota los virus y congela a -80 °C.
NOTA: Los tubos y los virus deben mantenerse en hielo durante los pasos 2.10.-2.13. Evite la espuma mientras resuspende el virus con el medio simple. El medio debe mantenerse a 4 °C. - Calcule la concentración (x) de virus de la siguiente manera:
Volumen total antes de la concentración = 72 ml (72.000 μL)
Volumen después de la concentración = 400 μL
La concentración = 72.000/400= 180x
3. Estimación de la eficiencia de transducción de lentivirus
- Transducir células 293T con el virus concentrado en diferentes volúmenes (2 μL, 4 μL, 8 μL) para confirmar la preparación exitosa de lentivirus.
NOTA: Si los virus concentrados muestran altas eficiencias de transducción (>50%) en pequeños volúmenes (1-2 μL), es aconsejable diluir el virus concentrado en las cantidades deseadas (100x a 75x). - Diluir el virus concentrado a 100x con DMEM (sin FBS y antibióticos) para realizar experimentos de titulación en la línea celular MV4-11 AraC R.
- Sembrar 1 x 106 celdas (línea celular MV4-11 AraC R en 1.5 mL de medio RPMI al 10% que contiene polibreno 8 μg/mL) en un pocillo de una placa de seis pocillos. Prepare cuatro pocillos para la transducción con diferentes volúmenes de virus.
- Agregue cuatro volúmenes diferentes (por ejemplo, 1 μL, 1.5 μL, 2 μL y 2.5 μL) de virus 100x.
- Realizar la espinfección por centrifugación de la placa a 920 x g durante 90 min a 37 °C.
- Después de 72 h, mida el porcentaje de células GFP+ por citometría de flujo.
- Determinar el volumen de los virus para obtener una eficiencia de transducción del 30%. Esta baja eficiencia de transducción es para garantizar la integración de shRNA único por célula.
4. Transducción de la biblioteca epigenética agrupada de SHRNA en la línea celular resistente a los medicamentos
- Mantener la línea celular objetivo MV4-11 AraC R a una densidad de 0,5 x 106 celdas/ml. Asegúrese de que las células estén en la fase de crecimiento exponencial en cultivo.
- Calcule el número de células que se tomarán para el experimento como se indica a continuación en función del número de integrantes virales.
Número de células requeridas para la transducción = 5,485 (número de shRNAs) × 500 (representación de shRNA doble) / 0.25 (MOI) = 10,982,000 ~ 11 x 106 células - Resuspend 1.1 x 107 celdas en 16 mL de medio RPMI al 10%.
- Añadir polibreno (8 μg/mL) y mezclar bien. Luego, agregue el volumen requerido de virus para obtener una eficiencia de transducción del 30% como se calculó en la sección anterior.
- Sembrar todas las células en una placa de seis pocillos a una densidad de 1 x 106 celdas/1.5 mL de medio RPMI al 10% por pozo.
- Centrifugar la placa durante 90 min a 920 x g a 37 °C.
- Incubar la placa durante la noche en una incubadora de CO2 (5% de CO2 a 37 °C).
- Después de 24 h, cambie el medio y transfiera las células transducidas a un matraz T-75.
- Después de 48 h, verifique el GFP bajo un microscopio de fluorescencia para garantizar una transducción exitosa.
- Después de 72 h, cuantificar el porcentaje de células GFP+ por citometría de flujo.
5. Enriquecimiento de células GFP positivas
NOTA: Expanda las células transducidas cultivándolas a una densidad de 0,5 x 106 células/ml durante 5-7 días. Estas células son una población mixta de transducidos y no transducidos, seleccionados en función de GFP por clasificación, como se menciona en el siguiente paso.
- Realice la clasificación de flujo de células transducidas GFP + con los ajustes de clasificación de flujo establecidos como de alta pureza y bajo rendimiento. Utilice las celdas no transducidas para establecer la puerta. Una población más allá de 1 x 102 hacia la derecha se considera una población positiva.
- Recolectar las células clasificadas en RPMI al 5% (RPMI con FBS al 5% suplementado con penicilina 100 U/mL y estreptomicina 100 U/mL).
- Cultive las células clasificadas en un medio RPMI al 10%.
- Después de 72 h, realice la estimación posterior a la clasificación del porcentaje de células GFP + para garantizar una eficiencia de clasificación >95%.
NOTA: Asegúrese de obtener ~ 3-5 x 106 celdas positivas GFP después de la clasificación para obtener una representación de 450x a ~ 500x de la biblioteca shRNA.
6. Detección de abandono para identificar los factores epigenéticos que median la resistencia a los medicamentos
- Cultive las células transducidas por la biblioteca de shRNA en 10% RPMI durante un máximo de 5 días. Criopreservar las células transducidas para futuros experimentos, si es necesario, antes del tratamiento farmacológico.
- Centrífuga 1 x 107 celdas por duplicado a 280 x g durante 5 min a 25 °C. Deseche el sobrenadante y guarde los gránulos a -80 °C. Estas muestras servirán como referencia de referencia para la biblioteca epigenética de SHRNA.
- Cultive las células transducidas restantes como duplicadas (R1 y R2), cada una mantenida en un recuento de células que proporciona una representación 500x de la biblioteca.
- Trate uno de los duplicados con el fármaco (10 μM de citarabina) (R2) y el otro sin el tratamiento farmacológico (R1).
- Cambie el medio para los matraces con y sin el medicamento cada 72 h. Repita el cambio medio 3 veces para una exposición acumulativa al medicamento de 9 días.
- Después de 9 días de tratamiento farmacológico, verifique la viabilidad de las células mediante el método de exclusión de azul de tripano.
- Centrifugar las celdas restantes a 280 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspend las células en PBS estéril y lave las células. Centrifugadora a 280 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante y almacene los gránulos a -80 °C para la extracción de ADN.
7. Amplificación de los shRNAs integrados por PCR
- Extraer ADN de las células basales transducidas (T) (paso 6.2.) y de las células tratadas con el fármaco (R2) y no tratadas con el fármaco (R1).
- Compruebe la concentración de la muestra con un fluorómetro.
- Calcule la cantidad de ADN requerida para la PCR de la siguiente manera:
5.485 (no. de shRNAs) × 500 (representación de shRNA) × 1 x 6.6−12 (g/genoma diploide) = 15 μg de ADN - Someter las muestras a la primera ronda de PCR.
NOTA: La mezcla de reacción de PCR se muestra en la Tabla 2 con las condiciones del termociclador. Los detalles de los cebadores se proporcionan en la Tabla suplementaria 1. - Configure múltiples reacciones que contengan 850 ng de ADN por tubo (para un total de 43 reacciones).
NOTA: La primera ronda de PCR amplifica las regiones flanqueantes del shRNA dando como resultado un tamaño de amplicón de 397 pb. - Agrupe los productos de PCR y purifique los productos de PCR utilizando 3-4 columnas de un kit de purificación de gel / PCR estándar.
NOTA: Los detalles se proporcionan en la Tabla 3. - Elute el producto en 50 μL de tampón de cada columna y agrupe los elutes.
- Cuantificar el ADN y almacenarlo a -20 °C.
NOTA: Los reactivos se tabulan en la Tabla 4 con las condiciones del termociclador. La PCR de segunda ronda utiliza los cebadores con la secuencia INDEX requerida para la multiplexación en NGS en una celda de flujo único. Por lo tanto, cada muestra debe etiquetarse con un índice diferente. Las secuencias de imprimación se proporcionan en la Tabla suplementaria 1. - Configure cuatro reacciones con 500 ng del producto primario de PCR en un volumen de reacción total de 50 μL para cada muestra y el control negativo.
- Cargue todo el producto para electroforesis utilizando gel de agarosa TBE al 2% y confirme el tamaño de la banda utilizando una escalera molecular de 1 kb. El tamaño del amplicón es de 399 pb.
- Visualice los productos de PCR en el sistema de documentación del gel.
- Elimine la banda específica y purifique con un kit de purificación en gel.
NOTA: Los cálculos para la purificación con el kit se proporcionan en la Tabla 3. - Elute en un volumen final de 30 μL de tampón de elución. La concentración aproximada de cada eluyente será de alrededor de 80-90 ng/μL con un volumen total de 30 μL.
8. Secuenciación de próxima generación y análisis de datos
- Secuencia el producto purificado en gel a partir del paso 7.13. en un secuenciador de próxima generación (por ejemplo, Illumina) para obtener el recuento de lectura para los shRNAs agotados.
- Recorte las secuencias de adaptadores de las lecturas FastQ generadas mediante el kit de herramientas Fastx (versión 0.7).
- Alinee las lecturas filtradas con secuencias de referencia utilizando un alineador Bowtie con el parámetro de permitir dos desajustes. Asegúrese de que la longitud de lectura después del recorte del adaptador sea de alrededor de 21 pb.
- Cargue los archivos utilizando el programa Samtools (versión 1.9). Utilice la opción Flagstat y calcule el resumen de alineación.
- Cargue los archivos fastQ recortados en el software CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) junto con las secuencias shRNA de referencia en forma de archivos FASTA y realice el análisis según las instrucciones.
- Haga clic en el enlace Iniciar análisis en el CC2.
- Seleccione el tipo de pantalla como pantallas supervivencia y abandono. Establezca el número de grupos y escriba el nombre de cada grupo.
- Cargue la biblioteca de referencia en formato de archivo FASTA. Los datos cargados se procesan. Haga clic en la URL de salida para obtener los resultados.
NOTA: Este software utiliza un modelo beta-binomial con una prueba t de Student modificada para medir las diferencias en los niveles de sgRNA / shRNA, seguido de la prueba de probabilidad combinada de Fisher para estimar la significación a nivel de gen. Calcula los cambios totales estimados delog 2 veces (Log2Fc) de shRNAs para los factores epigenéticos entre las muestras tratadas (enriquecidas/agotadas) y las no tratadas (línea de base) con "valores p" y "valores FDR".
- Asegúrese de que el valor de FDR sea "Negativo" para una pantalla de abandono y "Positivo" para una pantalla de supervivencia.
NOTA: CC2 es una plataforma de análisis para contar las lecturas y calcular la representación de pliegues (enriquecimiento o agotamiento) de shRNAs entre muestras. - Identifique los shRNAs significativamente enriquecidos y agotados (FDR <0.05) a partir de los resultados de CC2.
NOTA: Hay 5-24 shRNAs contra cada factor. Compruebe los valores de FDR para cada uno de los shRNAs; considere el FDR, que es <0.01, y tome un promedio para los SHRNA seleccionados. Considere los 40 mejores éxitos. Grafique el gráfico para los factores seleccionados en función de los valores negativos de Log2Fc o FDR. Asegúrese de que los shRNAs no dirigidos también tengan valores FDR significativos para garantizar la autenticidad de los datos, ya que sirven como shRNAs de control.
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Representative Results
El flujo de trabajo de filtrado general se muestra en la Figura 1A. La citotoxicidad in vitro del MV4-11 AraC R (48 h) reveló que el IC50 a citarabina en el MV4-11 AraC R era mayor que el MV4-11 P (Figura 1B). Esta línea celular se utilizó en el estudio como modelo para el cribado de los factores epigenéticos responsables de la resistencia a la citarabina.
La Figura 2A muestra los mapas vectoriales pZIP linealizados con tres promotores diferentes: hEF1α (factor de elongación humana 1α), hCMV (citomegalovirus humano) y SSFV (virus formador de foco del bazo), con el shRNA revuelto dentro de la secuencia UltramiR. La Figura 2B ilustra el mapa vectorial pZIP utilizado en el experimento de la biblioteca y el shRNA dirigido al factor epigenético con Zsgreen y puromicina como el marcador seleccionable impulsado por el promotor hEF1a. Estos vectores se utilizaron en la selección del experimento promotor más potente.
La selección del promotor más potente para obtener una expresión consistente y prolongada en las células diana se ilustra en la Figura 3. La cuantificación de GFP medida por MFI mostró una eficiencia de transducción de más del 90% al final de 72 h en MV4-11 AraC R para los tres promotores. El histograma para la expresión de GFP muestra una población heterogénea para hCMV pero homogénea en el caso de hEF1a y SFFV en el día 3 de transducción (Figura 3A). El gráfico de barras muestra la expresión de GFP impulsada por tres promotores diferentes (hEF1α, hCMV y SFFV) en el día 3 de transducción en MV4-11 AraC R (Figura 3B). La GFP impulsada por SFFV mostró una reducción en la IMF en el día 5 de transducción (Figura 3C). No se observó una disminución en la MFI en la clasificación posterior a la línea parental MV4-11 transducida por GFP impulsada por hEF1a. Así, el promotor hEF1a fue identificado como un promotor adecuado para la línea celular (Figura 3D).
La Figura 4A ilustra la eficiencia de transfección de los plásmidos de biblioteca de SHRNA agrupados en 293 células T después de 48 h de transfección. La expresión de GFP fue brillante, lo que indica una buena eficiencia de transfección. Después de la recolección del virus, la eficiencia de transducción del virus agrupado preparado se verificó en células 293T en tres concentraciones diferentes (2 μL, 4 μL y 8 μL). Observamos que incluso el virus de 2 μL resultó en la misma eficiencia que la del virus de 8 μL, confirmando así el alto título viral (Figura 4B).
La Figura 5 ilustra la transducción de biblioteca agrupada en la línea celular MV4-11 AraC R y la determinación del título lentiviral. El lentivirus de biblioteca shRNA agrupado se diluyó 100x y luego se agregó a la línea celular MV4-11 AraC R en diferentes volúmenes (1 μL, 1.5 μL, 2 μL y 2.5 μL). La eficiencia se comprobó al final de las 72 h. La eficiencia de transducción fue del 30% para 2-2,5 μL del virus, confirmando una integración de shRNA por célula (Figura 5A). La transducción con 2,5 μl de virus de biblioteca agrupado en células AraC R de 1,1 x 107 MV4-11 dio como resultado una eficiencia de transducción del 30%. Se clasificaron las células GFP positivas, que representan la biblioteca de SHRNA agrupada (Figura 5B).
Después de la transducción del lentivirus epigenético shRNA agrupado en la línea celular MV4-11 AraC R, las células GFP positivas se clasificaron el día 5 o el día 7 (Figura 6). Estas células clasificadas fueron sometidas a una exposición prolongada a la citarabina durante 9 días. La viabilidad se verificó en el día 9, y las células se recolectaron para el ADN. (Figura 6A). El gráfico de barras muestra la reducción en la tasa de proliferación de las células transducidas en presencia de citarabina (Figura 6B).
El ADN extraído de las muestras se sometió a dos rondas de PCR, y el producto final eluido en gel representó los shRNAs enriquecidos cuantificados por NGS. La Figura 7A muestra las regiones de unión del cebador utilizado en la 1ª y la 2ª ronda de PCR, donde los cebadores de 1ª ronda se unen a las regiones flanqueantes del shRNA integrado, y el 2º cebador delantero se une a la secuencia de bucle. El cebador inverso se une a una región del vector amplificado en la 1ª ronda de PCR. La Figura 7B y la Figura 7C ilustran el tamaño de la banda del producto de PCR al final de la 1ª (397 pb) y la 2ª ronda de PCR (399 pb), que fue eluido en gel, purificado y enviado para el análisis NGS.
Después de someter el ADN a un procedimiento de control de calidad estándar, las muestras se procesaron para el análisis NGS. Utilizamos CRISPRCloud2, una plataforma de análisis fácil de usar y basada en la nube para identificar shRNAs enriquecidos y agotados en la detección de shRNA agrupada. La Figura 8 ilustra la representación de shRNAs enriquecidos o agotados dirigidos a factores epigenéticos que podrían mediar la resistencia a la citarabina en la LMA.
Figura 1: Esquema y modelo del estudio. (A) Ilustración de la visión general del flujo de trabajo. (B) Células parentales mV4-11 y resistentes a AraC tratadas con concentraciones crecientes de citarabina (0,1 μM a 1000 μM) y viabilidad evaluada por ensayo MTT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ilustración de los vectores linealizados. (A) Los tres mapas vectoriales con tres promotores diferentes, hEF1α (factor de elongación humana 1α), hCMV (citomegalovirus humano) y SSFV (virus formador de foco del bazo), con el shRNA revuelto dentro de la secuencia UltramiR. (B) Ilustración del mapa vectorial utilizado en el experimento de biblioteca con el promotor hEF1α y el shRNA dirigido al factor epigenético con Zsgreen y puromicina como marcador seleccionable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Selección del promotor más potente para obtener la expresión persistente y prolongada de los shRNAs. (A) Diagramas de flujo representativos para GFP cuantificados por citometría de flujo al final de 72 h para promotores hEF1a, hCMV y SFFV. hCMV muestra un pico heterogéneo, mientras que hEF1a y SFFV muestran un solo pico homogéneo. (B) Eficiencia del promotor en la línea celular MV4-11 AraC R. (C) La GFP impulsada por SFFV muestra silenciamiento de la GFP en cultivos prolongados. (D) Las células GFP impulsadas por hEF1a muestran una expresión sostenida después de la clasificación de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comprobación de la eficiencia del lentivirus de ARNt shRNA agrupado preparado. (A) Las imágenes de microscopía de fluorescencia muestran la eficiencia de transfección de la biblioteca de ARNt de shRNA agrupada transfectada en 293T al final de 48 h utilizando un aumento de 10x. (B) La eficiencia de transducción del virus agrupado se evaluó en células 293T con volúmenes de virus variables (2μL, 4μL y 8μL) utilizando un aumento de 10x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Transducción de biblioteca agrupada en la línea celular objetivo y determinación del título lentiviral. (A) Línea celular MV4-11 AraC R transducida con volúmenes variables de virus (1μL, 1.5μL, 2μL y 2.5μL). La eficiencia se comprobó al final de 72 h. (B) Transducción del virus biblioteca agrupado en 1 x 107 células MV4-11 AraC R para lograr una eficiencia de transducción del 30%, luego clasificación de células GFP positivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Cribado de abandono para identificar los factores epigenéticos que median la resistencia a los medicamentos. (A) Ilustración esquemática del tratamiento farmacológico para el enriquecimiento de células resistentes. Las células infectadas por la biblioteca se sometieron a una exposición prolongada a citarabina durante 9 días, seguidas de la comprobación de la viabilidad y la recolección de las células para la extracción de ADN. (B) Reducción de la viabilidad a la exposición prolongada a citarabina en líneas celulares resistentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Preparación de los amplicones que representan el shRNA integrado. (A) Las regiones de unión del cebador utilizadas en la 1ª y la 2ª ronda de PCR, donde los cebadores de la 1ª ronda se unen a las regiones flanqueantes del shRNA integrado y el segundo cebador delantero se une a la secuencia de bucle. El reverso se une a una región de la región vectorial amplificada en la 1ª PCR. (B) Ilustración del tamaño de la banda del producto de PCR al final de la 1ª ronda de PCR (397 pb). (C) El producto de PCR de 2ª ronda (399bp) fue eluido en gel, purificado y administrado para NGS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Resultados de cribado en la línea celular de LMA (línea celular MV-4-11 Ara-C R). Después de someter el ADN a un procedimiento de control de calidad estándar, las muestras se procesaron para el análisis NGS. Utilizamos CRISPRCloud2, una plataforma de análisis fácil de usar y basada en la nube, para identificar shRNAs enriquecidos y agotados en la detección de shRNA agrupada. La figura representa shRNAs enriquecidos o agotados dirigidos a factores epigenéticos que podrían mediar la resistencia a la citarabina en la LMA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Preparación de la mezcla de plásmidos de transfección (Cálculo para placa de 10 cm) Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Mezcla de reacción de PCR para1ª Ronda de PCR Haga clic aquí para descargar esta Tabla.
Tabla 3: Cálculos para la purificación de los productos de 1ª de PCR Haga clic aquí para descargar esta Tabla.
Tabla 4: Mezcla de reacción de PCR para la 2ª Ronda de PCR Haga clic aquí para descargar esta Tabla.
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Discussion
La interferencia de ARN (ARNi) se utiliza ampliamente para estudios de genómica funcional, que incluyen la detección de siRNA y shRNA. El beneficio de los shRNA es que pueden incorporarse a vectores plásmidos e integrarse en el ADN genómico, lo que resulta en una expresión estable y, por lo tanto, un derribo más prolongado del ARNm objetivo. Un cribado de biblioteca de shRNA agrupado es robusto y rentable en comparación con los cribados convencionales (siRNA). Identificar la esencialidad de una clase específica de proteínas en una pantalla de todo el genoma puede ser engorroso. Los enfoques de detección dirigidos pueden revelar la esencialidad de las proteínas individuales para la supervivencia de las células cancerosas o la resistencia a los medicamentos dentro de la clase específica con ruido reducido. Este protocolo destaca el cribado de ARNi de factores epigenéticos para interrogar sistemáticamente genes esenciales y no esenciales, y demuestra el uso de este enfoque como una plataforma funcional que permite la identificación de dianas responsables de la resistencia a los medicamentos contra la LMA.
Esta poderosa tecnología exige ciertas precauciones en el diseño y ejecución de los experimentos. La primera es la elección de promotores que no se someten a un silenciamiento significativo durante el cultivo celular para la expresión de shRNAs, ya que su expresión robusta es crítica para la eliminación de genes diana. En segundo lugar, el mantenimiento de la representación de shRNA (el número de células transducidas con cada shRNA) es de particular importancia. A lo largo de la pantalla de shRNA, una representación promedio de >500 células por construcción de shRNA aumenta el potencial para identificar los shRNAs que causan efectos fenotípicos.
La estrategia de detección de ARNi es una pantalla de crecimiento competitivo; por lo tanto, es fundamental asegurarse de que las células objetivo estén en la fase de crecimiento logarítmico y no sobreconfluentes durante el cribado para minimizar la pérdida de representación causada por el crecimiento restringido. Es ideal para mantener las células en 50%-70% de confluencia para minimizar las variaciones experimentales. Recomendamos mantener lotes consistentes de medios, sueros, sobrenadantes virales, medicamentos y artículos de plástico de cultivo de tejidos para todas las réplicas de pantalla para reducir la variación experimental.
Es recomendable realizar experimentos piloto para optimizar la eficiencia de transducción del lentivirus para calcular el volumen de virus necesarios para lograr una integración de shRNA por célula. Para lograr esta integración de un shRNA por célula, la eficiencia de transducción debe ser inferior al 30%. Como la cantidad de virus para obtener un 30% de células transducidas puede variar entre las líneas celulares utilizadas para los experimentos, se requiere un experimento de estandarización para cada línea celular. Las eficiencias de transducción también pueden verse influenciadas por las condiciones de cultivo celular y la tasa de proliferación celular. Por lo tanto, los títulos funcionales deben determinarse en la prueba piloto utilizando las mismas condiciones utilizadas en la prueba de detección. Mantener 3-6 réplicas siempre es recomendable para obtener aciertos estadísticamente significativos.
Las dos principales preocupaciones del enfoque de detección de shRNA son los efectos fuera del objetivo y las eficiencias variables de derribo de los shRNAs16. Estos se pueden superar mediante el uso de múltiples shRNAs de cada gen. La adaptación del sistema inmune procariota CRISPR-Cas9 en células de mamíferos ha permitido una edición del genoma fácil, eficiente y rentable en células humanas cultivadas. Este sistema ha sido ampliamente explotado para realizar cribados genéticos de todo el genoma similares a los realizados utilizando shRNA. El destino de las células que albergan una secuencia particular de ARN de guía única (sgRNA) se puede monitorear mediante secuenciación profunda. La configuración experimental descrita aquí también se puede utilizar para la detección de CRISPR.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses y nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio está financiado en parte por una subvención del Departamento de Biotecnología BT/PR8742/AGR/36/773/2013 a SRV; y Departamento de Biotecnología de la India BT/COE/34/SP13432/2015 y Departamento de Ciencia y Tecnología de la India: EMR/2017/003880 a P.B. RVS y P.B. cuentan con el apoyo de Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842, respectivamente. S.D. cuenta con el apoyo de la beca CSIR-UGC, y S.I. cuenta con el apoyo de una beca de investigación senior de ICMR. Agradecemos a Abhirup Bagchi, Sandya Rani y al personal de CSCR Flow Cytometry Core Facility por su ayuda. También agradecemos a MedGenome Inc. por ayudar con la secuenciación de alto rendimiento y el análisis de datos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
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