Summary
Le dépistage par interférence ARN (ARNi) à haut débit à l’aide d’un pool d’ARNs lentiviraux peut être un outil pour détecter des cibles létales synthétiques pertinentes sur le plan thérapeutique dans les tumeurs malignes. Nous fournissons une approche de dépistage de l’ARNs pour étudier les effecteurs épigénétiques de la leucémie myéloïde aiguë (LAM).
Abstract
Comprendre les mécanismes pilotes cliniquement pertinents de la chimio-résistance acquise est crucial pour élucider les moyens de contourner la résistance et d’améliorer la survie chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë (LAM). Une petite fraction des cellules leucémiques qui survivent à la chimiothérapie ont un état épigénétique posé pour tolérer l’insulte chimiothérapeutique. Une exposition supplémentaire à la chimiothérapie permet à ces cellules persistantes d’atteindre un état épigénétique fixe, ce qui entraîne une altération de l’expression des gènes, entraînant la prolifération de ces populations résistantes aux médicaments et éventuellement une rechute ou une maladie réfractaire. Par conséquent, il est essentiel d’identifier les modulations épigénétiques qui nécessitent la survie des cellules leucémiques résistantes aux médicaments. Nous détaillons un protocole pour identifier les modulateurs épigénétiques qui médient la résistance à la cytarabine analogue nucléosidique (AraC) en utilisant le criblage de la bibliothèque shRNA regroupée dans une lignée cellulaire acquise résistante à la cytarabine. La bibliothèque se compose de 5 485 constructions d’ARNh ciblant 407 facteurs épigénétiques humains, ce qui permet un criblage de facteurs épigénétiques à haut débit.
Introduction
Les options thérapeutiques dans la leucémie myéloïde aiguë (LAM) sont restées inchangées au cours des cinq dernières décennies, avec la cytarabine (AraC) et les anthracyclines comme pierre angulaire du traitement de la maladie. L’un des défis au succès du traitement de la LAM est la résistance des cellules souches leucémiques à la chimiothérapie, entraînant une rechute de la maladie 1,2. La régulation épigénétique joue un rôle vital dans la pathogenèse du cancer et la résistance aux médicaments, et plusieurs facteurs épigénétiques sont apparus comme des cibles thérapeutiques prometteuses 3,4,5. Les mécanismes de régulation épigénétique affectent la prolifération et la survie en cas d’exposition continue à des médicaments chimiothérapeutiques. Des études sur les tumeurs malignes non hématologiques ont rapporté qu’une petite fraction des cellules qui surmontent l’effet du médicament subissent diverses modifications épigénétiques, ce qui entraîne la survie de ces cellules 6,7. Cependant, le rôle des facteurs épigénétiques dans la médiation de la résistance acquise à la cytarabine dans la LAM n’a pas été exploré.
Le criblage à haut débit est une approche de la découverte de médicaments qui a acquis une importance mondiale au fil du temps et est devenue une méthode standard dans différents aspects pour identifier des cibles potentielles dans les mécanismes cellulaires, pour le profilage des voies et au niveau moléculaire 8,9. Le concept de létalité synthétique implique l’interaction entre deux gènes où la perturbation de l’un ou l’autre gène seul est viable mais des deux gènes entraîne simultanément la perte de viabilité10. L’exploitation de la létalité synthétique dans le traitement du cancer pourrait aider à identifier et à caractériser mécaniquement des interactions génétiques létales synthétiques robustes11. Nous avons adopté une approche combinatoire de criblage d’ARNh à haut débit avec létalité synthétique pour identifier les facteurs épigénétiques responsables de la résistance acquise à la cytarabine dans la LAM.
Les leucémies aiguës provoquées par la translocation chromosomique du gène de la leucémie mixte (MLL ou KMT2A) sont connues pour être associées à une faible survie chez les patients. Les produits chimériques résultants des réarrangements du gène MLL , c’est-à-dire les protéines de fusion MLL (MLL-FP), peuvent transformer les cellules souches /progénitrices hématopoïétiques (HSPC) en blastes leucémiques avec l’implication de multiples facteurs épigénétiques. Ces régulateurs épigénétiques constituent un réseau complexe qui dicte le maintien du programme de leucémie et, par conséquent, pourrait former des cibles thérapeutiques potentielles. Dans ce contexte, nous avons utilisé la lignée cellulaire MV4-11 (hébergeant le gène de fusion MLL MLL-AF4 avec la mutation FLT3-ITD; appelée MV4-11 P) pour développer la lignée cellulaire acquise résistante à la cytarabine, appelée MV4-11 AraC R. La lignée cellulaire a été exposée à des doses croissantes de cytarabine avec une récupération intermittente du traitement médicamenteux, connue sous le nom de vacances médicamenteuses. La concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) a été évaluée par un test de cytotoxicité in vitro .
Nous avons utilisé la bibliothèque d’ARNh épigénétique groupée (voir Tableau des matériaux) pilotée par le promoteur hEF1a avec une colonne vertébrale lentivirale pZIP. Cette bibliothèque comprend des shRNA ciblant 407 facteurs épigénétiques. Chaque facteur a 5 à 24 shRNA, avec un total de 5 485 shRNA, dont cinq shRNA de contrôle non ciblés. L’échafaudage miR-30 modifié « UltrmiR » a été optimisé pour une biogenèse et une expression efficaces de l’ARNh primaire12,13.
Les grandes lignes de cette expérience sont illustrées à la figure 1A. Le protocole actuel se concentre sur le dépistage de l’ARNi à l’aide de la bibliothèque d’ARNh du facteur épigénétique dans la lignée cellulaire MV4-11 AraC R (Figure 1B), une lignée cellulaire en suspension. Ce protocole peut être utilisé pour dépister n’importe quelle bibliothèque ciblée dans n’importe quelle lignée cellulaire résistante aux médicaments de son choix. Il convient de noter que le protocole de transduction sera différent pour les cellules adhérentes.
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Protocol
Suivez les directives du Comité institutionnel de biosécurité (IBSC) et utilisez l’installation appropriée pour traiter le lentivirus (BSL-2). Le personnel devrait recevoir une formation appropriée à la manipulation et à l’élimination du lentivirus. Ce protocole suit les directives de biosécurité du Christian Medical College, Vellore.
1. Sélection du promoteur le plus puissant pour obtenir une expression persistante et prolongée des shRNA
REMARQUE: Il est essentiel d’effectuer une expérience de transduction en utilisant des vecteurs lentiviraux avec différents promoteurs qui expriment des protéines de fluorescence pour identifier le promoteur qui fournit une expression stable et à long terme des ARNh dans la lignée cellulaire sélectionnée pour l’expérience. Les promoteurs les plus couramment utilisés à cette fin sont les promoteurs hEF1α (facteur d’élongation humaine 1α), hCMV (cytomégalovirus humain) et SSFV (virus formant un foyer de rate) qui expriment la protéine de fluorescence verte (GFP) (Figure 2A).
- Effectuez le comptage des cellules à l’aide de la méthode d’exclusion bleue trypan. Suspendre les cellules MV4-11 AraC R dans un milieu RPMI à 10 % (RPMI avec 10 % de FBS complété par 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine) contenant 8 μg/mL de polybrène. Ensemencer 1 x 106 cellules dans 1,5 mL de milieu/puits d’une plaque de six puits en triples.
- Ajouter différents volumes de lentivirus concentrés (par exemple, 10 μL, 20 μL et 40 μL selon le titre des lentivirus) à chaque puits. Faites tourbillonner doucement la plaque pour mélanger le contenu.
- Effectuer une spinfection par centrifugation à 920 x g à 37 °C pendant 90 min.
- Incuber immédiatement les plaques dans un incubateur à CO2 (5% deCO2 à 37 °C).
- Observez l’expression de la GFP après 48 h au microscope à fluorescence pour assurer une transduction réussie.
- Quantifier l’expression de la GFP par cytométrie en flux après 72 h pour évaluer l’efficacité de la transduction.
- Cultivez les cellules pendant un total de 2 semaines et surveillez périodiquement l’expression de GFP par cytométrie en flux. La réduction de l’expression de GFP mesurée par l’intensité moyenne de fluorescence et le pourcentage de cellules GFP+ indique un silence de promoteur.
- Triez les cellules GFP+ le 10ème jour et cultivez les cellules pendant 1 semaine après le tri. Vérifiez périodiquement l’expression GFP pendant la culture.
- Utilisez les cellules non traduites pour définir la porte. Une population au-delà de l’échelle1 x 10 1 vers la droite sur l’axe des x est considérée comme une population positive pour la GFP.
- Choisissez le promoteur qui montre une expression persistante de GFP dans la culture prolongée des cellules.
2. Préparation d’une bibliothèque d’ARNh de facteur épigénétique humain lentiviral groupé
- Culture de cellules 293T (à un faible nombre de passage avec un bon taux de prolifération) dans trois boîtes de culture cellulaire de 10 cm avec 8 mL de milieu DMEM à 10% (DMEM avec 10% FBS contenant 100 U / ml de pénicilline et 100 U / ml de streptomycine) dans chaque plaque.
- Une fois que les cellules atteignent 60% de confluence, remplacez le milieu par un milieu complet.
- Préparer le mélange de transfection (tel qu’indiqué dans le tableau 1) qui contient un milieu sans sérum, un emballage lentiviral (psPAX2) et un plasmide d’enveloppe (pMD2.G), des plasmides de bibliothèque regroupés et, enfin, le réactif de transfection.
- Tapotez le mélange pour bien le mélanger et incubez à température ambiante pendant 15 min.
- Ajouter le mélange de transfection aux cellules 293T et mélanger doucement en faisant tourbillonner les plaques. Incuber les plaques dans un incubateur à CO2 (5% deCO2 à 37 °C). Changer le support après 24 h.
- Après 48 h, vérifiez l’expression de GFP sous un microscope à fluorescence pour assurer une efficacité de transfection élevée dans les cellules 293T.
- Recueillir les surnageants du virus après 48 h, 60 h et 72 h et les conserver à 4 °C. Ajouter un milieu frais (8 mL) à chaque point temporel après avoir recueilli le virus.
- Mettez en commun les surnageants du virus. Le volume total des virus regroupés sera de : ~8 mL/plaque x 3 collections= ~24 mL/plaque; ~24 mL/plaque x 3 plaques = ~72 mL à partir de 3 plaques.
- Filtrez les virus regroupés avec le filtre de 0,4 μm.
- Pour obtenir un titre élevé de virus, concentrez les virus regroupés par ultracentrifugation. Transférer le surnageant du virus filtré dans deux tubes de 70 Ti (32 mL/tube) et centrifuger à 18 000x g pendant 2 h avec une accélération et une décélération lentes. Utilisez un rotor et une centrifugeuse prérefroidis à 4 °C.
- Retirez doucement les tubes de la centrifugeuse et retirez complètement le surnageant.
- À l’aide d’une micropipette, remettre doucement la pastille dans 400 μL de DMEM (sans FBS ni antibiotiques). Incuber sur la glace pendant 1 h et mélanger les granulés des deux tubes.
- Aliquoter les virus et les congeler à −80 °C.
REMARQUE: Les tubes et les virus doivent être conservés sur la glace pendant les étapes 2.10.-2.13. Évitez de mousser pendant la réutilisation du virus avec le milieu ordinaire. Le milieu doit être maintenu à 4 °C. - Calculer la concentration (x) du virus comme suit :
Volume total avant concentration = 72 mL (72 000 μL)
Volume après concentration = 400 μL
La concentration = 72 000/400 = 180x
3. Estimation de l’efficacité de transduction des lentivirus
- Transduire les cellules 293T avec le virus concentré dans différents volumes (2 μL, 4 μL, 8 μL) pour confirmer la préparation réussie des lentivirus.
REMARQUE: Si les virus concentrés présentent des efficacités de transduction élevées (>50%) dans de petits volumes (1-2 μL), il est conseillé de diluer le virus concentré dans les quantités souhaitées (100x à 75x). - Diluer le virus concentré à 100x avec du DMEM (sans FBS ni antibiotiques) pour effectuer des expériences de titrage dans la lignée cellulaire MV4-11 AraC R.
- Ensemencez 1 x 106 cellules (lignée cellulaire MV4-11 AraC R dans 1,5 mL de milieu RPMI à 10 % contenant 8 μg/mL de polybrene) dans un puits d’une plaque de six puits. Préparer quatre puits pour la transduction avec différents volumes de virus.
- Ajoutez quatre volumes différents (par exemple, 1 μL, 1,5 μL, 2 μL et 2,5 μL) de virus 100x.
- Effectuer une spinfection par centrifugation de la plaque à 920 x g pendant 90 min à 37 °C.
- Après 72 h, mesurez le pourcentage de cellules GFP+ par cytométrie en flux.
- Déterminez le volume des virus pour obtenir une efficacité de transduction de 30 %. Cette faible efficacité de transduction permet d’assurer une intégration unique de shRNA par cellule.
4. Transduction de la bibliothèque d’ARNh épigénétique regroupée dans la lignée cellulaire résistante aux médicaments
- Maintenir la lignée cellulaire cible MV4-11 AraC R à une densité de 0,5 x 106 cellules/mL. Assurez-vous que les cellules sont à la phase de croissance exponentielle en culture.
- Calculez le nombre de cellules à prélever pour l’expérience comme ci-dessous en fonction du nombre d’intégrants viraux.
Nombre de cellules nécessaires à la transduction = 5 485 (nombre d’ARNh) × 500 (représentation de l’ARNh) / 0,25 (MOI) = 10 982 000 ~ 11 x 106 cellules - Remettre en suspension 1,1 x 107 cellules dans 16 mL de milieu RPMI à 10 %.
- Ajouter le polybrene (8 μg/mL) et bien mélanger. Ensuite, ajoutez le volume requis de virus pour obtenir une efficacité de transduction de 30% telle que calculée dans la section précédente.
- Ensemencez toutes les cellules sur une plaque de six puits à une densité de 1 x 106 cellules/1,5 mL de milieu RPMI à 10 % par puits.
- Centrifuger la plaque pendant 90 min à 920 x g à 37 °C.
- Incuber la plaque pendant la nuit dans un incubateur à CO2 (5% de CO2 à 37 °C).
- Après 24 h, changer le milieu et transférer les cellules transduites dans une fiole T-75.
- Après 48 h, vérifiez la GFP sous un microscope à fluorescence pour assurer une transduction réussie.
- Après 72 h, quantifier le pourcentage de cellules GFP+ par cytométrie en flux.
5. Enrichissement des cellules GFP positives
REMARQUE: Dilatez les cellules transduites en les cultivant à une densité de 0,5 x 106 cellules / mL pendant 5-7 jours. Ces cellules sont une population mixte de transductives et non transduites, sélectionnées en fonction de GFP par tri, comme mentionné à l’étape suivante.
- Effectuez le tri en flux des cellules transduites GFP+ avec les paramètres de tri en flux définis comme haute pureté et faible rendement. Utilisez les cellules non traduites pour définir la porte. Une population au-delà de 1 x 102 vers la droite est considérée comme une population positive.
- Recueillir les cellules triées dans 5% RPMI (RPMI avec 5% FBS complété par 100 U / mL pénicilline et 100 U / mL streptomycine).
- Cultivez les cellules triées dans un milieu RPMI à 10%.
- Après 72 h, effectuez l’estimation post-tri du pourcentage de cellules GFP+ pour assurer une efficacité de tri de >95%.
REMARQUE: Assurez-vous d’obtenir ~3-5 x 106 cellules GFP positives après le tri pour obtenir une représentation 450x à ~500x de la bibliothèque shRNA.
6. Dépistage de l’abandon pour identifier les facteurs épigénétiques médiant la résistance aux médicaments
- Cultivez les cellules transduites de la bibliothèque shRNA dans 10% RPMI pendant 5 jours. Cryoconserver les cellules transduites pour de futures expériences, si nécessaire, avant le traitement médicamenteux.
- Centrifuger 1 x 107 cellules en double à 280 x g pendant 5 min à 25 °C. Jeter le surnageant et conserver les granulés à −80 °C. Ces échantillons serviront de référence pour la bibliothèque épigénétique d’ARNh.
- Cultivez les cellules transduites restantes sous forme de doublons (R1 et R2), chacune maintenue à un nombre de cellules qui fournit une représentation 500x de la bibliothèque.
- Traiter l’un des doublons avec le médicament (10 μM de cytarabine) (R2) et l’autre sans traitement médicamenteux (R1).
- Changer le milieu des flacons avec et sans le médicament toutes les 72 h. Répétez le changement de milieu 3x pour une exposition cumulative au médicament de 9 jours.
- Après 9 jours de traitement médicamenteux, vérifiez la viabilité des cellules par la méthode d’exclusion du bleu de trypan.
- Centrifuger les cellules restantes à 280 x g pendant 5 min à température ambiante. Remettez les cellules en suspension dans du PBS stérile et lavez les cellules. Centrifuger à 280 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Jeter le surnageant et stocker les granulés à −80 °C pour l’extraction de l’ADN.
7. Amplification des shRNA intégrés par PCR
- Extraire l’ADN des cellules de base transduites (T) (étape 6.2.) et des cellules traitées avec le médicament (R2) et non traitées avec le médicament (R1).
- Vérifiez la concentration de l’échantillon à l’aide d’un fluoromètre.
- Calculez la quantité d’ADN requise pour la PCR comme ci-dessous:
5 485 (non. des shRNA) × 500 (représentation de l’ARNh) × 1 x 6,6−12 (g/génome diploïde) = 15 μg d’ADN - Soumettre les échantillons à la première série de PCR.
REMARQUE: Le mélange réactionnel PCR est représenté dans le tableau 2 avec les conditions du cycleur thermique. Les détails des amorces sont fournis dans le tableau supplémentaire 1. - Mettre en place plusieurs réactions contenant 850 ng d’ADN par tube (pour un total de 43 réactions).
REMARQUE: La première série de PCR amplifie les régions flanquantes de l’ARNh, ce qui donne une taille d’amplicon de 397 pb. - Regroupez les produits PCR et purifiez les produits PCR à l’aide de 3-4 colonnes d’un kit de purification gel/PCR standard.
REMARQUE : Les détails sont fournis dans le tableau 3. - Éluez le produit dans 50 μL de tampon de chaque colonne et regroupez les éluats.
- Quantifiez l’ADN et stockez-le à −20 °C.
REMARQUE: Les réactifs sont présentés dans le tableau 4 avec les conditions du cycleur thermique. La PCR de deuxième tour utilise les amorces avec la séquence INDEX requise pour le multiplexage dans NGS dans une cellule à flux unique. Ainsi, chaque échantillon doit être étiqueté avec un index différent. Les séquences d’amorces sont fournies dans le tableau supplémentaire 1. - Mettre en place quatre réactions avec 500 ng du produit PCR primaire dans un volume de réaction total de 50 μL pour chaque échantillon et le témoin négatif.
- Chargez l’ensemble du produit pour l’électrophorèse à l’aide d’un gel d’agarose TBE à 2% et confirmez la taille de la bande à l’aide d’une échelle moléculaire de 1 kb. La taille de l’amplicon est de 399 pb.
- Visualisez les produits PCR sur le système de documentation du gel.
- Retirez la bande spécifique et purifiez-la à l’aide d’un kit de purification en gel.
REMARQUE: Les calculs pour la purification avec le kit sont fournis dans le tableau 3. - Éluter dans un volume final de 30 μL de tampon d’élution. La concentration approximative de chaque éluant sera d’environ 80-90 ng/μL avec un volume total de 30 μL.
8. Séquençage et analyse des données de nouvelle génération
- Séquencer le produit purifié au gel à partir de l’étape 7.13. sur un séquenceur de nouvelle génération (p. ex., Illumina) pour obtenir le nombre de lectures pour les shRNA épuisés.
- Découpez les séquences d’adaptateurs des lectures FastQ générées à l’aide du kit d’outils Fastx (version 0.7).
- Alignez les lectures filtrées sur les séquences de référence à l’aide d’un aligneur bowtie avec le paramètre d’autoriser deux incohérences. Assurez-vous que la longueur de lecture après le rognage de l’adaptateur est d’environ 21 pb.
- Chargez les fichiers à l’aide du programme Samtools (version 1.9). Utilisez l’option Flagstat et calculez le résumé de l’alignement.
- Chargez les fichiers fastQ découpés dans le logiciel CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) avec les séquences shRNA de référence sous la forme de fichiers FASTA et effectuez l’analyse conformément aux instructions.
- Cliquez sur le lien Démarrer l’analyse dans le CC2.
- Sélectionnez le type d’écran comme écrans Survie et Abandon. Définissez le nombre de groupes et tapez le nom de chaque groupe.
- Téléchargez la bibliothèque de référence au format de fichier FASTA. Les données téléchargées sont traitées. Cliquez sur l’URL de sortie pour obtenir les résultats.
REMARQUE: Ce logiciel utilise un modèle bêta-binomial avec un test t de Student modifié pour mesurer les différences dans les niveaux d’ARNs sg/ shRNA, suivi du test de probabilité combiné de Fisher pour estimer la signification au niveau du gène. Il calcule les variations globales estimées de2 fois (Log2Fc) des ARNh pour les facteurs épigénétiques entre les échantillons traités (enrichis/épuisés) et les échantillons non traités (de référence) avec des « valeurs p » et des « valeurs FDR ».
- Assurez-vous que la valeur FDR est « Négatif » pour un écran Dropout et « Positif » pour un écran Survival.
REMARQUE: CC2 est une plate-forme d’analyse permettant de compter les lectures et de calculer la représentation du pli (enrichissement ou épuisement) des shRNA entre les échantillons. - Identifier les shRNA significativement enrichis et épuisés (FDR <0,05) à partir des résultats du CC2.
REMARQUE: Il y a 5-24 shRNA contre chaque facteur. Vérifiez les valeurs FDR pour chacun des shRNA; considérez le FDR, qui est <0,01, et prenez une moyenne pour les shRNA sélectionnés. Considérez les 40 meilleurs hits. Tracez le graphique des facteurs sélectionnés en fonction des valeurs négatives Log2Fc ou FDR. Assurez-vous que les shRNA non ciblés ont également des valeurs FDR significatives pour assurer l’authenticité des données car ils servent de shRNA de contrôle.
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Representative Results
Le flux de travail global de sélection est illustré à la figure 1A. La cytotoxicité in vitro du MV4-11 AraC R (48 h) a révélé que la CI50 à la cytarabine dans le MV4-11 AraC R était supérieure à celle du MV4-11 P (Figure 1B). Cette lignée cellulaire a été utilisée dans l’étude comme modèle pour le dépistage des facteurs épigénétiques responsables de la résistance à la cytarabine.
La figure 2A montre les cartes vectorielles pZIP linéarisées avec trois promoteurs différents : hEF1α (facteur d’élongation humain 1α), hCMV (cytomégalovirus humain) et SSFV (virus formant un foyer de la rate), avec l’ARNh brouillé dans la séquence UltramiR. La figure 2B illustre la carte vectorielle pZIP utilisée dans l’expérience de bibliothèque et l’ARNh ciblant le facteur épigénétique avec Zsgreen et puromycine comme marqueur sélectionnable piloté par le promoteur hEF1a. Ces vecteurs ont été utilisés dans la sélection de l’expérience de promoteur la plus puissante.
La sélection du promoteur le plus puissant pour obtenir une expression cohérente et prolongée dans les cellules cibles est illustrée à la figure 3. La quantification de la GFP mesurée par MFI a montré une efficacité de transduction de plus de 90% au bout de 72 h dans MV4-11 AraC R pour les trois promoteurs. L’histogramme pour l’expression de la GFP montre une population hétérogène pour le hCMV mais homogène dans le cas de hEF1a et SFFV au jour 3 de la transduction (Figure 3A). Le graphique à barres montre l’expression de la GFP entraînée par trois promoteurs différents (hEF1α, hCMV et SFFV) au jour 3 de la transduction dans MV4-11 AraC R (Figure 3B). La GFP induite par le SFFV a montré une réduction de l’IMF au jour 5 de la transduction (Figure 3C). Aucune diminution de l’IMF n’a été observée dans le tri de la ligne parentale MV4-11 transduite par GFP basé sur hEF1a. Ainsi, le promoteur hEF1a a été identifié comme un promoteur approprié pour la lignée cellulaire (Figure 3D).
La figure 4A illustre l’efficacité de transfection des plasmides de la bibliothèque d’ARNh regroupés dans 293T cellules après 48 h de transfection. L’expression de GFP était brillante, ce qui indique une bonne efficacité de transfection. Après la collecte du virus, l’efficacité de transduction du virus groupé préparé a été vérifiée dans 293T cellules à trois concentrations différentes (2 μL, 4 μL et 8 μL). Nous avons observé que même un virus de 2 μL entraînait la même efficacité que celle du virus de 8 μL, confirmant ainsi le titre viral élevé (figure 4B).
La figure 5 illustre la transduction de la bibliothèque regroupée dans la lignée cellulaire MV4-11 AraC R et la détermination du titre lentiviral. Le lentivirus de la bibliothèque shRNA regroupé a été dilué 100x, puis ajouté à la lignée cellulaire MV4-11 AraC R dans différents volumes (1 μL, 1,5 μL, 2 μL et 2,5 μL). L’efficacité a été vérifiée à la fin de 72 h. L’efficacité de transduction était de 30 % pour 2 à 2,5 μL du virus, confirmant une intégration d’ARNh par cellule (figure 5A). La transduction avec 2,5 μl de virus de bibliothèque regroupés dans 1,1 x 10cellules 7 MV4-11 AraC R a entraîné une efficacité de transduction de 30%. Les cellules GFP positives ont été triées, représentant la bibliothèque d’ARNh regroupée (Figure 5B).
Après la transduction du lentivirus épigénétique shRNA regroupé dans la lignée cellulaire MV4-11 AraC R, les cellules GFP positives ont été triées le jour 5 ou le jour 7 (Figure 6). Ces cellules triées ont été soumises à une exposition prolongée à la cytarabine pendant 9 jours. La viabilité a été vérifiée le 9ème jour et les cellules ont été collectées pour l’ADN. (Figure 6A). Le graphique à barres montre la réduction du taux de prolifération des cellules transduites en présence de cytarabine (Figure 6B).
L’ADN extrait des échantillons a été soumis à deux cycles de PCR, et le produit final élué en gel représentait les shRNA enrichis quantifiés par NGS. La figure 7A montre les régions de liaison de l’amorce utilisée dans le 1er et le 2e cycle de PCR, où les amorces du 1er tour se lient aux régions flanquantes de l’ARNh intégré et où l’amorce avant se lie à la séquence de boucles. L’amorce inverse se lie à une région du vecteur amplifié dans le 1er tour de la PCR. La figure 7B et la figure 7C illustrent la taille de la bande du produit PCR à la fin du 1er (397 pb) et du 2e tour de pcR (399 pb), qui a été éluée au gel, purifiée et soumise à l’analyse NGS.
Après avoir soumis l’ADN à une procédure standard de contrôle de la qualité, les échantillons ont été traités pour une analyse NGS. Nous avons utilisé CRISPRCloud2, une plate-forme d’analyse conviviale basée sur le cloud pour identifier les shRNA enrichis et épuisés dans le dépistage de shRNA groupé. La figure 8 illustre la représentation des ARNS enrichis ou épuisés ciblant les facteurs épigénétiques qui pourraient servir de médiateur à la résistance à la cytarabine dans la LAM.
Figure 1 : Plan et modèle de l’étude. (A) Illustration de la vue d’ensemble du flux de travail. (B) cellules parentales et résistantes à l’AraC MV4-11 traitées avec des concentrations croissantes de cytarabine (0,1 μM à 1000 μM) et dont la viabilité a été évaluée par un essai MTT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Illustration des vecteurs linéarisés. (A) Les trois cartes vectorielles avec trois promoteurs différents, hEF1α (facteur d’élongation humaine 1α), hCMV (cytomégalovirus humain) et SSFV (virus formant la focalisation de la rate), avec l’ARNh brouillé dans la séquence UltramiR. (B) Illustration de la carte vectorielle utilisée dans l’expérience de bibliothèque avec le promoteur hEF1α et l’ARNh ciblant le facteur épigénétique avec Zsgreen et puromycine comme marqueur sélectionnable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Sélection du promoteur le plus puissant pour obtenir une expression persistante et prolongée des shRNA. (A) Diagrammes d’écoulement représentatifs pour la GFP quantifiés par cytométrie en flux à la fin de 72 h pour les promoteurs hEF1a, hCMV et SFFV. hCMV montre un pic hétérogène, tandis que hEF1a et SFFV montrent un seul pic homogène. (B) Efficacité du promoteur dans la lignée cellulaire MV4-11 AraC R. (C) La GFP pilotée par le SFFV montre un silence du GFP en culture prolongée. (D) Les cellules GFP pilotées par hEF1a présentent une expression soutenue après le tri des cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Vérification de l’efficacité du lentivirus shRNA groupé préparé. (A) Les images de microscopie à fluorescence montrent l’efficacité de transfection de la bibliothèque d’ARNh regroupée transfectée en 293T à la fin de 48 h en utilisant un grossissement 10x. (B) L’efficacité de transduction du virus groupé a été évaluée dans des cellules 293T avec des volumes de virus variables (2μL, 4μL et 8μL) en utilisant un grossissement de 10x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Transduction de la bibliothèque groupée dans la lignée cellulaire cible et détermination du titre lentiviral. (A) Lignée cellulaire MV4-11 AraC R transduite avec des volumes variables de virus (1μL, 1,5μL, 2μL et 2,5μL). L’efficacité a été vérifiée à la fin de 72 h. (B) Transduction du virus de bibliothèque regroupé dans 1 x 107 cellules AraC R MV4-11 pour atteindre une efficacité de transduction de 30%, puis tri des cellules GFP positives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Dépistage de l’abandon pour identifier les facteurs épigénétiques médiant la résistance aux médicaments. (A) Illustration schématique du traitement médicamenteux pour l’enrichissement des cellules résistantes. Les cellules infectées par la bibliothèque ont été soumises à une exposition prolongée à la cytarabine pendant 9 jours, suivies d’une vérification de la viabilité et de la collecte des cellules pour l’extraction de l’ADN. B) Réduction de la viabilité à une exposition prolongée à la cytarabine dans les lignées cellulaires résistantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Préparation des amplicons représentant l’ARNh intégré. (A) Les régions de liaison de l’amorce utilisées dans le 1er et le 2e cycle de PCR, où les amorces du 1er tour se lient aux régions flanquantes de l’ARNh intégré et la deuxième amorce avant se lie à la séquence de boucles. L’inverse se lie à une région de la région vectorielle amplifiée dans la 1ère PCR. (B) Illustration de la taille de la bande du produit PCR à la fin du 1er tour de PCR (397 pb). (C) Le produit pcR du 2e tour (399 pb) a été élué au gel, purifié et administré pour le NGS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Résultats du dépistage dans la lignée cellulaire AML (lignée cellulaire MV-4-11 Ara-C R). Après avoir soumis l’ADN à une procédure standard de contrôle de la qualité, les échantillons ont été traités pour une analyse NGS. Nous avons utilisé CRISPRCloud2, une plate-forme d’analyse conviviale basée sur le cloud, pour identifier les shRNA enrichis et épuisés dans le dépistage de shRNA groupé. La figure représente les ARNh enrichis ou épuisés ciblant les facteurs épigénétiques qui pourraient servir de médiateur à la résistance à la cytarabine dans la LAM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Préparation du mélange de plasmides de transfection (calcul pour une plaque de 10 cm) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Mélange réactionnel de PCR pour la 1ère série de PCR Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Calculs pour la purification des produits du 1er de la PCR Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 4 : Mélange réactionnel de PCR pour la 2e série de PCR Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
L’interférence ARN (ARNi) est largement utilisée pour les études de génomique fonctionnelle, qui comprennent le criblage du siRNA et du shRNA. L’avantage des shRNA est qu’ils peuvent être incorporés dans des vecteurs plasmidiques et intégrés dans l’ADN génomique, ce qui entraîne une expression stable et, par conséquent, une destruction plus prolongée de l’ARNm cible. Un criblage de bibliothèque d’ARNh groupé est robuste et rentable par rapport aux écrans en réseau conventionnels (siRNA). Identifier l’essentialité d’une classe spécifique de protéines dans un écran à l’échelle du génome peut être fastidieux. Les approches de dépistage ciblées peuvent révéler l’essentialité des protéines individuelles pour la survie des cellules cancéreuses ou la résistance aux médicaments au sein de la classe spécifique avec un bruit réduit. Ce protocole met en évidence le criblage ARNi des facteurs épigénétiques pour interroger systématiquement les gènes essentiels et non essentiels, et il démontre l’utilisation de cette approche comme plateforme fonctionnelle permettant l’identification de cibles responsables de la résistance aux médicaments AML.
Cette technologie puissante exige certaines précautions dans la conception et l’exécution des expériences. Le premier est le choix des promoteurs qui ne subissent pas de silence significatif pendant la culture cellulaire pour l’expression des ARNh, car leur expression robuste est essentielle à l’élimination des gènes cibles. Deuxièmement, le maintien de la représentation de l’ARNh (le nombre de cellules transduites avec chaque ARNh) revêt une importance particulière. Tout au long du dépistage de l’ARNh, une représentation moyenne de >500 cellules par construction d’ARNh augmente le potentiel d’identification des ARNh qui causent des effets phénotypiques.
La stratégie de dépistage de l’ARNi est un écran de croissance concurrentiel; par conséquent, il est essentiel de s’assurer que les cellules cibles sont dans la phase de croissance logarithmique et non trop confluentes pendant le dépistage afin de minimiser la perte de représentation causée par une croissance restreinte. Il est idéal pour maintenir les cellules à une confluence de 50% à 70% afin de minimiser les variations expérimentales. Nous recommandons de maintenir des quantités cohérentes de milieux, de sérums, de surnageants viraux, de médicaments et de plastique de culture tissulaire pour toutes les répliques de criblage afin de réduire la variation expérimentale.
Il est conseillé d’effectuer des expériences pilotes pour optimiser l’efficacité de transduction du lentivirus afin de calculer le volume de virus nécessaire pour réaliser une intégration d’ARNh par cellule. Pour réaliser cette intégration d’un shRNA par cellule, l’efficacité de transduction doit être inférieure à 30%. Comme la quantité de virus pour obtenir 30% de cellules transduites peut varier entre les lignées cellulaires utilisées pour les expériences, une expérience de normalisation pour chaque lignée cellulaire est nécessaire. L’efficacité de la transduction peut également être influencée par les conditions de culture cellulaire et le taux de prolifération cellulaire. Par conséquent, les titres fonctionnels doivent être déterminés dans l’expérience pilote en utilisant les mêmes conditions que celles utilisées dans l’expérience de dépistage. Maintenir 3-6 répliques est toujours conseillé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Les deux principales préoccupations de l’approche de dépistage de l’ARNh sont les effets hors cible et les rendements variables des ARNn16. Ceux-ci peuvent être surmontés en utilisant plusieurs shRNA de chaque gène. L’adaptation du système immunitaire procaryote CRISPR-Cas9 dans les cellules de mammifères a permis une édition facile, efficace et rentable du génome dans les cellules humaines cultivées. Ce système a été largement exploité pour effectuer des criblages génétiques à l’échelle du génome similaires à ceux effectués à l’aide d’ARNh. Le devenir des cellules hébergeant une séquence particulière d’ARN monoguide (ARNg) peut être surveillé à l’aide d’un séquençage profond. La configuration expérimentale décrite ici peut également être utilisée pour le dépistage CRISPR.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts et rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude est financée en partie par une subvention du Département de biotechnologie BT/PR8742/AGR/36/773/2013 à SRV; et Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 et Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS et P.B. sont soutenus par Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 et IA/S/15/1/501842, respectivement. S.D. est soutenu par la bourse CSIR-UGC, et S.I. est soutenu par une bourse de recherche senior ICMR. Nous remercions Abhirup Bagchi, Sandya Rani et le personnel de l’installation centrale de cytométrie en flux du CSCR pour leur aide. Nous remercions également MedGenome Inc. pour son aide dans le séquençage à haut débit et l’analyse des données.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
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