Summary
RNA-interferens (RNAi) screening med høj gennemstrømning ved hjælp af en pulje af lentivirale shRNA'er kan være et værktøj til at detektere terapeutisk relevante syntetiske dødelige mål i maligniteter. Vi tilbyder en poolet shRNA-screeningsmetode til at undersøge de epigenetiske effektorer ved akut myeloid leukæmi (AML).
Abstract
Forståelse af klinisk relevante drivermekanismer for erhvervet kemoresistens er afgørende for at belyse måder at omgå resistens på og forbedre overlevelsen hos patienter med akut myeloid leukæmi (AML). En lille brøkdel af leukæmiske celler, der overlever kemoterapi, har en klar epigenetisk tilstand til at tolerere kemoterapeutisk fornærmelse. Yderligere eksponering for kemoterapi gør det muligt for disse lægemiddel persisterceller at opnå en fast epigenetisk tilstand, hvilket fører til ændret genekspression, hvilket resulterer i spredning af disse lægemiddelresistente populationer og til sidst tilbagefald eller ildfast sygdom. Derfor er det afgørende at identificere epigenetiske moduleringer, der nødvendiggør overlevelse af lægemiddelresistente leukæmiske celler. Vi beskriver en protokol til identifikation af epigenetiske modulatorer, der medierer resistens over for nukleosidanalog cytarabin (AraC) ved hjælp af poolet shRNA-biblioteksscreening i en erhvervet cytarabinresistent AML-cellelinje. Biblioteket består af 5.485 shRNA-konstruktioner rettet mod 407 humane epigenetiske faktorer, hvilket muliggør epigenetisk faktorscreening med høj gennemstrømning.
Introduction
Terapeutiske muligheder i akut myeloid leukæmi (AML) har været uændrede i næsten de sidste fem årtier, med cytarabin (AraC) og anthracycliner som hjørnestenen til behandling af sygdommen. En af udfordringerne for succesen med AML-terapi er leukæmiske stamcellers resistens over for kemoterapi, hvilket fører til sygdomstilbagefald 1,2. Epigenetisk regulering spiller en afgørende rolle i kræftpatogenese og lægemiddelresistens, og flere epigenetiske faktorer har vist sig som lovende terapeutiske mål 3,4,5. Epigenetiske reguleringsmekanismer påvirker spredning og overlevelse under kontinuerlig eksponering for kemoterapeutiske lægemidler. Undersøgelser af ikke-hæmatologiske maligniteter har rapporteret, at en lille brøkdel af celler, der overvinder lægemiddeleffekten, gennemgår forskellige epigenetikmodifikationer, hvilket resulterer i disse cellers overlevelse 6,7. Epigenetiske faktorers rolle i formidlende erhvervet resistens over for cytarabin i AML er imidlertid ikke blevet undersøgt.
Screening med høj kapacitet er en tilgang til lægemiddelopdagelse, der har fået global betydning over tid og er blevet en standardmetode i forskellige aspekter til at identificere potentielle mål i cellulære mekanismer, til vejprofilering og på molekylært niveau 8,9. Begrebet syntetisk dødelighed involverer interaktionen mellem to gener, hvor forstyrrelsen af begge gener alene er levedygtig, men af begge gener samtidig resulterer i tab af levedygtighed10. Udnyttelse af syntetisk dødelighed i kræftbehandling kan hjælpe med at identificere og mekanisk karakterisere robuste syntetiske dødelige genetiske interaktioner11. Vi har vedtaget en kombinatorisk tilgang til shRNA-screening med høj gennemstrømning med syntetisk dødelighed for at identificere de epigenetiske faktorer, der er ansvarlige for erhvervet cytarabinresistens i AML.
Akutte leukæmier drevet af kromosomtranslokation af det blandede slægts leukæmigen (MLL eller KMT2A) vides at være forbundet med dårlig overlevelse hos patienter. De resulterende kimære produkter af MLL-genomlejringer, dvs. MLL-fusionsproteiner (MLL-FP'er), kan omdanne hæmatopoietiske stamceller / stamceller (HSPC'er) til leukæmiske blaster med inddragelse af flere epigenetiske faktorer. Disse epigenetiske regulatorer udgør et kompliceret netværk, der dikterer vedligeholdelsen af leukæmiprogrammet og derfor kan danne potentielle terapeutiske mål. I denne sammenhæng brugte vi MV4-11-cellelinjen (der huser MLL-fusionsgenet MLL-AF4 med FLT3-ITD-mutationen; betegnet som MV4-11 P) til at udvikle den erhvervede cytarabinresistente cellelinje, betegnet som MV4-11 AraC R. Cellelinjen blev udsat for stigende doser cytarabin med intermitterende genopretning fra lægemiddelbehandlingen, kendt som en lægemiddelferie. Den halvmaksimale hæmmende koncentration (IC50) blev vurderet ved in vitro-cytotoksicitetsassay.
Vi brugte det poolede epigenetiske shRNA-bibliotek (se tabel over materialer) drevet af hEF1a-promotoren med en pZIP lentiviral rygrad. Dette bibliotek består af shRNA'er rettet mod 407 epigenetiske faktorer. Hver faktor har 5-24 shRNA'er med i alt 5.485 shRNA'er, herunder fem ikke-målrettede kontrol-shRNA'er. Det modificerede "UltrmiR" miR-30 stillads er optimeret til effektiv primær shRNA-biogenese og ekspression12,13.
Omridset af dette eksperiment er illustreret i figur 1A. Den nuværende protokol fokuserer på RNAi-screening ved hjælp af den epigenetiske faktor shRNA-biblioteket i MV4-11 AraC R-cellelinjen (figur 1B), en suspensionscellelinje. Denne protokol kan bruges til at screene ethvert målrettet bibliotek i enhver lægemiddelresistent cellelinje efter eget valg. Det skal bemærkes, at transduktionsprotokollen vil være forskellig for klæbende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følg retningslinjerne fra Institutional Biosafety Committee (IBSC), og brug den rette facilitet til at håndtere lentivirus (BSL-2). Personalet bør være behørigt uddannet i håndtering og bortskaffelse af lentivirus. Denne protokol følger retningslinjerne for biosikkerhed fra Christian Medical College, Vellore.
1. Udvælgelse af den mest potente promotor for at opnå vedvarende og langvarig ekspression af shRNA'erne
BEMÆRK: Det er vigtigt at udføre et transduktionseksperiment ved hjælp af lentivirale vektorer med forskellige promotorer, der udtrykker fluorescensproteiner for at identificere promotoren, der giver en stabil og langsigtet ekspression af shRNA'er i den cellelinje, der er valgt til eksperimentet. De mest almindeligt anvendte promotorer til dette formål er hEF1α (human forlængelsesfaktor 1α), hCMV (humant cytomegalovirus) og SSFV (miltfokusdannende virus) promotorer, der udtrykker grønt fluorescensprotein (GFP) (figur 2A).
- Udfør celletællingen ved hjælp af trypan blue-ekskluderingsmetoden. MV4-11 AraC R-cellerne suspenderes i 10 % RPMI-medium (RPMI med 10 % FBS suppleret med 100 U/ml penicillin og 100 U/ml streptomycin) indeholdende 8 μg/ml polybren. Frø 1 x 106 celler i 1,5 ml medium/brønd af en seks-brønds plade i triplikater.
- Tilsæt forskellige mængder koncentrerede lentivirus (for eksempel 10 μL, 20 μL og 40 μL afhængigt af titeren af lentivirus) til hver brønd. Hvirvl forsigtigt pladen for at blande indholdet.
- Udfør spinfektion ved centrifugering ved 920 x g ved 37 °C i 90 minutter.
- Inkuber straks pladerne i en CO2 - inkubator (5% CO2 ved 37 ° C).
- Overhold GFP-ekspressionen efter 48 timer under et fluorescensmikroskop for at sikre en vellykket transduktion.
- Kvantificer GFP-ekspressionen ved flowcytometri efter 72 timer for at evaluere transduktionseffektiviteten.
- Kultur cellerne i alt 2 uger og overvåg GFP-ekspressionen med jævne mellemrum ved flowcytometri. Reduktionen i GFP-ekspression målt ved den gennemsnitlige fluorescensintensitet og procentdelen af GFP+-celler indikerer promotorhæmning.
- Sorter GFP+-cellerne på den 10. dag, og kultur cellerne i 1 uge efter sorteringen. Kontroller GFP-udtrykket med jævne mellemrum under kulturen.
- Brug de ikke-overførte celler til at indstille porten. En population ud over skalaen 1 x10 1 mod højre på x-aksen betragtes som en positiv population for GFP.
- Vælg den promotor, der viser et vedvarende udtryk for GFP i cellernes langvarige kultur.
2. Forberedelse af poolet lentiviral human epigenetisk faktor shRNA bibliotek
- Dyrkning af 293T-celler (ved et lavt passagetal med en god spredningshastighed) i tre 10 cm cellekulturretter med 8 ml 10% DMEM-medium (DMEM med 10% FBS indeholdende 100 U/ml penicillin og 100 U/ml streptomycin) i hver plade.
- Når cellerne når 60% sammenløb, skal du udskifte mediet med et komplet medium.
- Forbered transfektionsblandingen (som beskrevet i tabel 1), der indeholder serumfrit medium, lentiviral emballage (psPAX2) og konvolutplasmid (pMD2.G), poolede biblioteksplasmider og endelig transfektionsreagenset.
- Tryk på blandingen for at blande den godt og inkubere ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Tilsæt transfektionsblandingen til 293T-cellerne og bland forsigtigt ved at hvirvle pladerne. Inkuber pladerne i en CO 2-inkubator (5 % CO2 ved 37 °C). Skift medium efter 24 timer.
- Efter 48 timer skal du kontrollere for GFP-ekspression under et fluorescensmikroskop for at sikre høj transfektionseffektivitet i 293T-cellerne.
- Opsaml virussupernatanterne efter 48 timer, 60 timer og 72 timer, og opbevar dem ved 4 °C. Tilsæt frisk medium (8 ml) på hvert tidspunkt efter opsamling af virussen.
- Pool virus supernatanter. Det samlede volumen af de poolede vira vil være: ~ 8 ml / plade x 3 samlinger = ~ 24 ml / plade; ~24 ml/plade x 3 plader = ~72 ml fra 3 plader.
- Filtrer de samlede vira med filteret på 0,4 μm.
- For at opnå en høj titer af vira, koncentrer de poolede vira ved ultracentrifugation. Overfør det filtrerede virussupernatant til to 70 Ti-rør (32 ml/rør) og centrifugen ved 18.000x g i 2 timer med langsom acceleration og deceleration. Brug en rotor og centrifuge, der er forkølet til 4 °C.
- Tag rørene forsigtigt ud af centrifugen, og fjern supernatanten helt.
- Brug en mikropipette til forsigtigt at suspendere pelleten i 400 μL DMEM (uden FBS og antibiotika). Inkuber på isen i 1 time og bland pellets fra begge rør.
- Aliquot virusserne og frys ved -80 °C.
BEMÆRK: Rørene og viraene skal opbevares på is under trin 2.10.-2.13. Undgå at skumme, mens du genbruger virussen med det almindelige medium. Mediet skal holdes på 4 °C. - Beregn koncentrationen (x) af virus som nedenfor:
Samlet volumen før koncentration = 72 ml (72.000 μL)
Volumen efter koncentrering = 400 μL
Koncentrationen = 72.000/400= 180x
3. Estimering af lentivirusses transduktionseffektivitet
- Transdukere 293T-celler med den koncentrerede virus i forskellige volumener (2 μL, 4 μL, 8 μL) for at bekræfte den vellykkede fremstilling af lentivirus.
BEMÆRK: Hvis koncentrerede vira udviser høj transduktionseffektivitet (>50%) i små mængder (1-2 μL), anbefales det at fortynde den koncentrerede virus i de ønskede mængder (100x til 75x). - Fortynd den koncentrerede virus til 100x med DMEM (uden FBS og antibiotika) for at udføre titreringseksperimenter i MV4-11 AraC R-cellelinjen.
- Frø 1 x 106 celler (MV4-11 AraC R-cellelinje i 1,5 ml 10% RPMI-medium indeholdende 8 μg/ml polybrene) i en brønd i en seks-brønds plade. Forbered fire brønde til transducering med forskellige mængder vira.
- Tilsæt fire forskellige volumener (for eksempel 1 μL, 1,5 μL, 2 μL og 2,5 μL) af 100x vira.
- Udfør spinfektion ved centrifugering af pladen ved 920 x g i 90 minutter ved 37 °C.
- Efter 72 timer måles procentdelen af GFP + -celler ved flowcytometri.
- Bestem virusets volumen for at opnå 30% transduktionseffektivitet. Denne lave transduktionseffektivitet er at sikre enkelt shRNA-integration pr. Celle.
4. Transduktion af poolet epigenetisk shRNA-bibliotek i den lægemiddelresistente cellelinje
- Oprethold målcellelinjen MV4-11 AraC R ved en 0,5 x 106 celler / ml densitet. Sørg for, at cellerne er i den eksponentielle vækstfase i kulturen.
- Beregn antallet af celler, der skal tages til eksperimentet som nedenfor baseret på antallet af virale integranter.
Antal celler, der kræves til transduktion = 5.485 (antal shRNA'er) × 500 (fold shRNA-repræsentation) / 0.25 (MOI) = 10.982.000 ~ 11 x 106 celler - Resuspend 1,1 x 107 celler i 16 ml 10% RPMI medium.
- Tilsæt polybrene (8 μg/ml) og bland godt. Tilføj derefter det krævede volumen vira for at opnå 30% transduktionseffektivitet som beregnet i det foregående afsnit.
- Frø alle cellerne på en seks-brønds plade med en densitet på 1 x 106 celler / 1,5 ml 10% RPMI-medium pr. Brønd.
- Centrifugering af pladen i 90 minutter ved 920 x g ved 37 °C.
- Inkuber pladen natten over i en CO2 - inkubator (5% CO2 ved 37 ° C).
- Efter 24 timer ændres mediet og overføres de transducerede celler til en T-75-kolbe.
- Efter 48 timer skal du kontrollere GFP'en under et fluorescensmikroskop for at sikre en vellykket transduktion.
- Efter 72 timer kvantificeres procentdelen af GFP + -celler ved flowcytometri.
5. Berigelse af GFP-positive celler
BEMÆRK: Udvid de transducerede celler ved at dyrke dem med en densitet på 0,5 x 106 celler / ml i 5-7 dage. Disse celler er en blandet population af transducerede og utransducerede, udvalgt ud fra GFP ved sortering, som nævnt i næste trin.
- Udfør flowsortering af GFP+-transducerede celler med flowsorteringsindstillingerne indstillet som høj renhed og lavt udbytte. Brug de ikke-overførte celler til at indstille porten. En befolkning ud over 1 x 102 mod højre betragtes som en positiv befolkning.
- Opsaml de sorterede celler i 5% RPMI (RPMI med 5% FBS suppleret med 100 U/ml penicillin og 100 U/ml streptomycin).
- Kultur de sorterede celler i et 10% RPMI-medium.
- Efter 72 timer skal du udføre eftersorteringsestimeringen af procentdelen af GFP+-celler for at sikre >95 % sorteringseffektivitet.
BEMÆRK: Sørg for at opnå ~ 3-5 x 106 GFP positive celler efter sortering for at opnå 450x til ~ 500x repræsentation af shRNA-biblioteket.
6. Dropout screening for at identificere epigenetiske faktorer, der medierer lægemiddelresistens
- Kultur shRNA-biblioteket transducerede celler i 10% RPMI i op til 5 dage. Kryopreserver de transducerede celler til fremtidige forsøg, hvis det er nødvendigt, før lægemiddelbehandlingen.
- Centrifugering 1 x 107 celler i dubletter ved 280 x g i 5 minutter ved 25 °C. Kassér supernatanten, og opbevar pellets ved -80 °C. Disse prøver vil tjene som baseline reference for det epigenetiske shRNA bibliotek.
- Kultur de resterende transducerede celler som dubletter (R1 og R2), der hver især opretholdes ved et celleantal, der giver en 500x repræsentation af biblioteket.
- Behandl en af duplikaterne med lægemidlet (10 μM cytarabin) (R2) og den anden uden lægemiddelbehandling (R1).
- Skift mediet til kolberne med og uden lægemidlet hver 72. time. Gentag mediumændringen 3x for en kumulativ lægemiddeleksponering på 9 dage.
- Efter 9 dages lægemiddelbehandling skal du kontrollere cellernes levedygtighed ved hjælp af trypan blå udelukkelsesmetode.
- Centrifugering af de resterende celler ved 280 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Resuspend cellerne i steril PBS og vask cellerne. Centrifuge ved 280 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Kassér supernatanten, og opbevar pellets ved -80 °C til DNA-ekstraktion.
7. Forstærkning af de integrerede shRNA'er ved hjælp af PCR
- Uddrag DNA fra de transducerede baselineceller (T) (trin 6.2.) og de celler, der er behandlet med lægemidlet (R2) og ubehandlet med lægemidlet (R1).
- Kontroller koncentrationen af prøven ved hjælp af et fluorometer.
- Beregn den mængde DNA, der kræves til PCR som nedenfor:
5.485 (nej. af shRNA'er) × 500 (shRNA-repræsentation) × 1 x 6,6-12 (g/diploid genom) = 15 μg DNA - Emnerne underkastes den første runde af PCR.
BEMÆRK: PCR-reaktionsblandingen er afbildet i tabel 2 med de termiske cyklusbetingelser. Nærmere oplysninger om primerne findes i supplerende tabel 1. - Opsæt flere reaktioner indeholdende 850 ng DNA pr. rør (for i alt 43 reaktioner).
BEMÆRK: Den første runde af PCR forstærker de flankerende områder af shRNA'et, hvilket resulterer i en ampliconstørrelse på 397 bp. - Pool PCR-produkterne og rens PCR-produkterne ved hjælp af 3-4 kolonner i et standard gel / PCR-rensningssæt.
BEMÆRK: Nærmere oplysninger findes i tabel 3. - Eluter produktet i 50 μL buffer fra hver kolonne og pool elutterne.
- Kvantificer DNA'et og opbevar det ved -20 °C.
BEMÆRK: Reagenserne er opstillet i tabel 4 med de termiske cyklusbetingelser. Anden runde PCR bruger primerne med den INDEX-sekvens, der kræves til multiplexering i NGS i en singleflow-celle. Så hver prøve skal mærkes med et andet indeks. Grundsekvenser findes i supplerende tabel 1. - Der opstilles fire reaktioner med 500 ng af det primære PCR-produkt i et samlet reaktionsvolumen på 50 μL for hver prøve og den negative kontrol.
- Læg hele produktet til elektroforese ved hjælp af 2% TBE agarosegel og bekræft båndstørrelsen ved hjælp af en 1 kb molekylær stige. Ampliconens størrelse er 399 bp.
- Visualiser PCR-produkterne på geldokumentationssystemet.
- Punktafgift det specifikke bånd og rens ved hjælp af et gelrensningssæt.
BEMÆRK: Beregninger for rensning med sættet findes i tabel 3. - Elute i et slutvolumen på 30 μL elueringsbuffer. Den omtrentlige koncentration af hver eluent vil være omkring 80-90 ng / μL med et samlet volumen på 30 μL.
8. Næste generations sekventering og dataanalyse
- Det gelrensede produkt sekventeres fra trin 7.13. på en næste generations sequencer (f.eks. Illumina) for at opnå læsetællingen for de udtømte shRNA'er.
- Trim adaptersekvenserne for de genererede FastQ-læsninger ved hjælp af Fastx-værktøjssættet (version 0.7).
- Juster de filtrerede læsninger til referencesekvenser ved hjælp af en Bowtie-justering med parameteren for at tillade to uoverensstemmelser. Sørg for, at læselængden efter adaptertrimning er omkring 21 bp.
- Indlæs filerne ved hjælp af Samtools-programmet (version 1.9). Brug indstillingen Flagstat, og beregn justeringsoversigten.
- Indlæs de trimmede fastQ-filer i CRISPRCloud2 (CC2) software (https://crispr.nrihub.org/) sammen med reference shRNA-sekvenserne i form af FASTA-filer, og udfør analysen i henhold til instruktionerne.
- Klik på linket Start analyse i CC2.
- Vælg skærmtypen som Skærmbilleder Overlevelse og Frafald. Angiv antallet af grupper, og skriv navnet på hver gruppe.
- Upload referencebiblioteket i FASTA-filformat. De uploadede data behandles. Klik på output-URL'en for at få resultaterne.
BEMÆRK: Denne software bruger en beta-binomial model med en modificeret Studerendes t-test til at måle forskelle i sgRNA / shRNA-niveauer, efterfulgt af Fishers kombinerede sandsynlighedstest for at estimere genniveau signifikansen. Den beregner estimerede samlede log2-fold ændringer (Log2Fc) af shRNAs for de epigenetiske faktorer mellem de behandlede (beriget / udtømt) og de ubehandlede prøver (baseline) med "p-værdier" og "FDR-værdier."
- Sørg for, at FDR-værdien er "Negativ" for en Dropout-skærm og "Positiv" for en Overlevelsesskærm.
BEMÆRK: CC2 er en analyseplatform til optælling af læsninger og beregning af foldrepræsentationen (berigelse eller udtømning) af shRNA'er mellem prøver. - Identificer de signifikant berigede og udtømte shRNA'er (FDR <0,05) fra CC2-resultaterne.
BEMÆRK: Der er 5-24 shRNAs mod hver faktor. Kontroller FDR-værdierne for hver af shRNA'erne; overvej FDR, som er <0,01, og tag et gennemsnit for de valgte shRNAs. Overvej de 40 bedste hits. Plot grafen for de valgte faktorer baseret på Log2Fc eller FDR negative værdier. Sørg for, at de ikke-målrettede shRNA'er også har betydelige FDR-værdier for at sikre ægtheden af dataene, da de fungerer som kontrol-shRA'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den overordnede screeningsarbejdsgang er afbildet i figur 1A. In vitro-cytotoksiciteten af MV4-11 AraC R (48 timer) afslørede, at IC50 til cytarabin i MV4-11 AraC R var højere end MV4-11 P (figur 1B). Denne cellelinje blev anvendt i undersøgelsen som model til screening af de epigenetiske faktorer, der er ansvarlige for cytarabinresistens.
Figur 2A viser de lineariserede pZIP-vektorkort med tre forskellige promotorer: hEF1α (human forlængelsesfaktor 1α), hCMV (humant cytomegalovirus) og SSFV (miltfokusdannende virus) med det krypterede shRNA inden for UltramiR-sekvensen. Figur 2B illustrerer pZIP-vektorkortet, der blev brugt i bibliotekseksperimentet, og shRNA'et rettet mod den epigenetiske faktor med Zsgreen og puromycin som den valgbare markør drevet af hEF1a-promotoren. Disse vektorer blev brugt til udvælgelsen af det mest potente promotoreksperiment.
Udvælgelsen af den mest potente promotor for at få et konsistent og langvarigt udtryk i målcellerne er illustreret i figur 3. Kvantificeringen af GFP målt ved MFI viste mere end 90% transduktionseffektivitet i slutningen af 72 timer i MV4-11 AraC R for alle tre promotorer. Histogrammet for GFP-ekspression viser en heterogen population for hCMV, men en homogen population for hEF1a og SFFV på dag 3 i transduktionen (figur 3A). Søjlediagrammet viser GFP-udtrykket drevet af tre forskellige promotorer (hEF1α, hCMV og SFFV) på dag 3 af transduktion i MV4-11 AraC R (figur 3B). SFFV-drevet GFP viste en reduktion i MFI på dag 5 af transduktionen (figur 3C). Der blev ikke observeret noget fald i MFI'en i den hEF1a-drevne GFP-transducerede MV4-11 forældrelinjepostsortering. Således blev hEF1a-promotoren identificeret som en passende promotor for cellelinjen (figur 3D).
Figur 4A illustrerer transfektionseffektiviteten af de poolede shRNA-biblioteksplasmider i 293T-celler efter 48 timers transfektion. GFP-udtrykket var lyst, hvilket indikerer god transfektionseffektivitet. Efter virusindsamling blev transduktionseffektiviteten af det forberedte poolede virus kontrolleret i 293T-celler i tre forskellige koncentrationer (2 μL, 4 μL og 8 μL). Vi observerede, at selv 2 μL-virus resulterede i samme effektivitet som 8 μL-virus, hvilket bekræftede den høje virale titer (figur 4B).
Figur 5 illustrerer den samlede bibliotekstransduktion i MV4-11 AraC R-cellelinjen og bestemmelsen af den lentivirale titer. Det samlede shRNA-bibliotek lentivirus blev fortyndet 100x og derefter tilsat til MV4-11 AraC R-cellelinjen i forskellige volumener (1 μL, 1,5 μL, 2 μL og 2,5 μL). Effektiviteten blev kontrolleret i slutningen af 72 timer. Transduktionseffektiviteten var 30% for 2-2,5 μL af virussen, hvilket bekræfter en shRNA-integration pr. Celle (figur 5A). Transduktion med 2,5 μl poolet biblioteksvirus i 1,1 x 107 MV4-11 AraC R-celler resulterede i 30% transduktionseffektivitet. GFP-positive celler blev sorteret, hvilket repræsenterer det poolede shRNA-bibliotek (figur 5B).
Efter transduktion af poolet shRNA epigenetisk lentivirus i MV4-11 AraC R-cellelinjen blev de GFP-positive celler sorteret på dag 5 eller dag 7 (figur 6). Disse sorterede celler blev udsat for langvarig eksponering for cytarabin i 9 dage. Levedygtigheden blev kontrolleret den 9. dag, og cellerne blev indsamlet til DNA. (Figur 6A). Søjlediagrammet viser reduktionen i proliferationshastigheden af de transducerede celler i nærvær af cytarabin (figur 6B).
Det ekstraherede DNA fra prøverne blev udsat for to runder PCR, og det endelige geleluerede produkt repræsenterede de berigede shRNA'er kvantificeret af NGS. Figur 7A viser bindingsområderne for den primer, der anvendes i 1. og 2. runde af PCR, hvor 1. runde primere binder til de flankerende regioner i det integrerede shRNA, og den 2. fremadrettede primer binder til loopsekvensen. Den omvendte primer binder sig til et område af den forstærkede vektor i 1. runde af PCR. Figur 7B og figur 7C illustrerer PCR-produktets båndstørrelse i slutningen af 1. (397 bp) og 2. runde PCR (399 bp), som blev gelelueret, renset og indsendt til NGS-analyse.
Efter at have underkastet DNA'et en standardkvalitetskontrolprocedure blev prøverne behandlet til NGS-analyse. Vi brugte CRISPRCloud2, en brugervenlig, skybaseret analyseplatform til at identificere berigede og udtømte shRNA'er i den samlede shRNA-screening. Figur 8 illustrerer repræsentationen af berigede eller udtømte shRA'er rettet mod epigenetiske faktorer, der kan formidle cytarabinresistens i AML.
Figur 1: Oversigt og model af undersøgelsen. (A) Illustration af oversigten over arbejdsgangen. B) MV4-11 forældre- og AraC-resistente celler behandlet med stigende cytarabinkoncentrationer (0,1 μM til 1000 μM) og levedygtighedsvurderet ved MTT-assay. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Illustration af de lineariserede vektorer. (A) De tre vektorkort med tre forskellige promotorer, hEF1α (human forlængelsesfaktor 1α), hCMV (humant cytomegalovirus) og SSFV (miltfokusdannende virus), med det krypterede shRNA inden for UltramiR-sekvensen. (B) Illustration af vektorkortet, der blev anvendt i bibliotekseksperimentet med hEF1α-promotoren og shRNA'et rettet mod den epigenetiske faktor med Zsgreen og puromycin som den valgbare markør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Udvælgelse af den mest potente promotor for at opnå vedvarende og langvarig ekspression af shRNA'erne. (A) Repræsentative flowplotter for GFP kvantificeret ved flowcytometri i slutningen af 72 timer for hEF1a-, hCMV- og SFFV-promotorer. hCMV viser en heterogen top, mens hEF1a og SFFV viser en enkelt homogen top. (B) Promotoreffektivitet i MV4-11 AraC R-cellelinjen. C) SFFV-drevet GFP viser dæmpning af GFP i langvarig kultur. (D) hEF1a-drevne GFP-celler viser vedvarende ekspression efter sortering af cellerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kontrol af effektiviteten af det forberedte poolede shRNA lentivirus. (A) Fluorescensmikroskopibilleder viser transfektionseffektiviteten af det poolede shRNA-bibliotek transfekteret i 293T i slutningen af 48 timer ved hjælp af 10x forstørrelse. (B) Transduktionseffektiviteten af det poolede virus blev vurderet i 293T-celler med varierende virusvolumener (2μL, 4μL og 8μL) ved hjælp af 10x forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Poolet bibliotekstransduktion i målcellelinjen og bestemmelse af lentiviral titer. (A) MV4-11 AraC R-cellelinje transduceret med varierende mængder virus (1μL, 1,5μL, 2μL og 2,5μL). Effektiviteten blev kontrolleret i slutningen af 72 timer. (B) Transduktion af poolet biblioteksvirus i 1 x 107 MV4-11 AraC R-celler for at opnå 30% transduktionseffektivitet og derefter sortering af GFP-positive celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Dropout screening for at identificere epigenetiske faktorer, der medierer lægemiddelresistens. (A) Skematisk illustration af lægemiddelbehandling til berigelse af resistente celler. Biblioteksinficerede celler blev udsat for langvarig cytarabineksponering i 9 dage efterfulgt af kontrol af levedygtigheden og indsamling af cellerne til DNA-ekstraktion. B) Reduktion af levedygtigheden ved langvarig cytarabineksponering i resistente cellelinjer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Fremstilling af ampliconerne, der repræsenterer det integrerede shRNA. (A) Bindingsområderne for primeren, der anvendes i 1. og 2. runde af PCR, hvor 1. runde primere binder til de flankerende områder af det integrerede shRNA, og den anden fremadrettede primer binder til loopsekvensen. Det omvendte binder sig til et område af det forstærkede vektorområde i 1. PCR. (B) Illustration af PCR-produktets båndstørrelse ved udgangen af 1. runde PCR (397 bp). C) Det andet runde PCR-produkt (399bp) blev gelelueret, renset og givet til NGS. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Screeningsresultater i AML-cellelinjen (MV-4-11 Ara-C R-cellelinje). Efter at have underkastet DNA'et en standardkvalitetskontrolprocedure blev prøverne behandlet til NGS-analyse. Vi brugte CRISPRCloud2, en brugervenlig, skybaseret analyseplatform, til at identificere berigede og udtømte shRNA'er i den samlede shRNA-screening. Figuren repræsenterer berigede eller udtømte shRNA'er rettet mod epigenetiske faktorer, der kan formidle cytarabinresistens i AML. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Forberedelse af Transfection Plasmid Mix (Beregning for 10 cm plade) Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: PCR-reaktionsblanding til 1. runde PCR Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Beregninger for rensning af produkterne fra 1. PCR Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4: PCR-reaktionsblanding til 2. runde af PCR Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA-interferens (RNAi) anvendes i vid udstrækning til funktionelle genomiske undersøgelser, som omfatter siRNA- og shRNA-screening. Fordelen ved shRNA er, at de kan inkorporeres i plasmidvektorer og integreres i genomisk DNA, hvilket resulterer i stabil ekspression og dermed mere langvarig knockdown af mål-mRNA'et. En poolet shRNA-biblioteksscreening er robust og omkostningseffektiv sammenlignet med de konventionelle arrayed screens (siRNA). Det kan være besværligt at identificere væsentligheden af en bestemt klasse af proteiner i en genom-bred skærm. Målrettede screeningsmetoder kan afsløre de enkelte proteiners væsentlighed for kræftcelleoverlevelse eller lægemiddelresistens inden for den specifikke klasse med reduceret støj. Denne protokol fremhæver RNAi-skærmen af epigenetiske faktorer for systematisk at forhøre både essentielle og ikke-væsentlige gener, og den demonstrerer brugen af denne tilgang som en funktionel platform, der gør det muligt at identificere mål, der er ansvarlige for AML-lægemiddelresistens.
Denne kraftfulde teknologi kræver visse forholdsregler i design og udførelse af eksperimenterne. Den første er valget af promotorer, der ikke gennemgår signifikant hæmning under cellekulturen til ekspression af shRNA'er, da deres robuste ekspression er afgørende for knockdown af målgener. For det andet er opretholdelsen af shRNA-repræsentation (antallet af celler transduceret med hvert shRNA) af særlig betydning. I hele shRNA-skærmen øger en gennemsnitlig repræsentation af >500 celler pr. ShRNA-konstruktion potentialet for at identificere de shRNA'er, der forårsager fænotypiske virkninger.
RNAi-screeningsstrategien er en konkurrencedygtig vækstskærm; derfor er det vigtigt at sikre, at målcellerne er i den logaritmiske vækstfase og ikke overflydende under skærmen for at minimere tab af repræsentation forårsaget af begrænset vækst. Det er ideelt at opretholde cellerne ved 50% -70% sammenløb for at minimere eksperimentelle variationer. Vi anbefaler at opretholde ensartede masser af medier, sera, virale supernatanter, lægemidler og vævskultur plasticware til alle skærmreplikater for at reducere eksperimentel variation.
Det anbefales at udføre pilotforsøg for at optimere lentivirusets transduktionseffektivitet for at beregne mængden af vira, der kræves for at opnå en integration af shRNA pr. Celle. For at opnå denne integration af et shRNA pr. Celle skal transduktionseffektiviteten være mindre end 30%. Da mængden af vira for at opnå 30% transducerede celler kan variere mellem de cellelinjer, der anvendes til eksperimenterne, kræves et standardiseringseksperiment for hver cellelinje. Transduktionseffektivitet kan også påvirkes af cellekulturbetingelser og hastigheden af celleproliferation. Derfor bør funktionelle titre bestemmes i pilotforsøget ved hjælp af de samme betingelser, der blev anvendt i screeningsforsøget. Vedligeholdelse af 3-6 replikater er altid tilrådeligt at få statistisk signifikante hits.
De to største bekymringer ved shRNA-screeningsmetoden er off-target-effekterne og de variable knockdown-effektivitetsgevinster af shRNA'er16. Disse kan overvindes ved at bruge flere shRNA'er af hvert gen. Tilpasning af det prokaryote immunsystem CRISPR-Cas9 i pattedyrceller har muliggjort nem, effektiv og omkostningseffektiv genomredigering i dyrkede humane celler. Dette system er blevet udnyttet i vid udstrækning til at udføre genom-brede genetiske skærme svarende til dem, der udføres ved hjælp af shRNA. Skæbnen for celler, der huser en bestemt single-guide RNA (sgRNA) sekvens, kan overvåges ved hjælp af dyb sekventering. Den eksperimentelle opsætning, der er skitseret her, kan også bruges til CRISPR-screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter og intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse finansieres delvist af et Institut for Bioteknologi tilskud BT / PR8742 / AGR / 36/773/2013 til SRV; og Institut for Bioteknologi Indien BT/ COE / 34 / SP13432/2015 og Institut for Videnskab og Teknologi, Indien: EMR / 2017 / 003880 til P.B. RVS og P.B. understøttes af henholdsvis Wellcome DBT India Alliance IA / S / 17/ 1 / 503118 og IA / S / 15/1 / 501842. S.D. støttes af CSIR-UGC-stipendiet, og S.I. støttes af et ICMR-seniorforskningsstipendium. Vi takker Abhirup Bagchi, Sandya Rani og CSCR Flow Cytometry Core Facility-personalet for deres hjælp. Vi takker også MedGenome Inc. for at hjælpe med sekventering og dataanalyse med høj kapacitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P.
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
