Summary
Denne protokol præsenterer en optimeret tilgang til fremstilling af genetisk modificerede rottemodeller. Adeno-associeret virus (AAV) bruges til at levere en DNA-reparationsskabelon, og elektroporation bruges til at levere CRISPR-Cas9-reagenser for at fuldføre genomredigeringsprocessen i 2-celleembryo.
Abstract
Genomredigeringsteknologi bruges i vid udstrækning til at producere genetisk modificerede dyr, herunder rotter. Cytoplasmatisk eller pronukleær injektion af DNA-reparationsskabeloner og CRISPR-Cas-reagenser er den mest almindelige leveringsmetode i embryoner. Denne type mikromanipulation kræver imidlertid adgang til specialudstyr, er besværlig og kræver et vist niveau af teknisk dygtighed. Desuden resulterer mikroinjektionsteknikker ofte i lavere embryooverlevelse på grund af den mekaniske belastning på embryoet. I denne protokol udviklede vi en optimeret metode til at levere store DNA-reparationsskabeloner til at arbejde sammen med CRISPR-Cas9-genomredigering uden behov for mikroinjektion. Denne protokol kombinerer AAV-medieret DNA-levering af enkeltstrengede DNA-donorskabeloner sammen med levering af CRISPR-Cas9 ribonukleoprotein (RNP) ved elektroporation for at modificere 2-cellede embryoner. Ved hjælp af denne nye strategi har vi med succes produceret målrettede knock-in rottemodeller, der bærer indsættelse af DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse med effektivitetsgevinster mellem 42% og 90%.
Introduction
Udviklingen af CRISPR-baserede genomredigeringsværktøjer har accelereret vores evne til effektivt at generere nye og mere sofistikerede gensplejsede rottemodeller. Single-guide RNA, sammen med Cas9-nuklease, kombineres til dannelse af ribonukleoprotein (RNP) komplekser, der målretter DNA-sekvenser af interesse inden for genomet og resulterer i dobbeltstrengede DNA-brud. Fordi cellulære DNA-reparationsmekanismer er udsat for fejl, introduceres indsættelser og deletioner (INDEL'er) under reparationsprocessen, der kan forstyrre et målgens funktion. Når der er samtidig levering af en ønsket konstrueret DNA-sekvens (reparationsskabelon) sammen med genomredigeringsreagenser, sker indsættelse af reparationsskabelonen i regionen, der indeholder det dobbeltstrengede DNA-brud, gennem en proces kaldet homologi-rettet reparation (HDR). Dette er en effektiv strategi til generering af dyremodeller med målrettede DNA-indsættelser/substitutioner (knock-ins). En begrænsning er, at knock-in-sekvenser ofte er store i størrelse, hvilket har vist sig at reducere genredigeringseffektiviteten, hvilket gør det vanskeligere at generere den ønskede model1. Strategier til at øge knock-in-effektiviteten har inkluderet linearisering af både dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og enkeltstrenget DNA (ssDNA) reparationsskabeloner og kemisk modifikation af DNA-reparationsskabeloner 2,3,4. Derudover er pronukleær mikroinjektion sammen med HDR-stimulerende forbindelser, anvendelse af elektriske impulser i forbindelse med mikroinjektion og tidsbestemt mikroinjektion i 2-celleembryoner alle forsøgt 5,6,7. På trods af succesen med nogle af disse tilgange er inkorporeringen af DNA-sekvenser større end 1,0 kb stadig teknisk udfordrende.
Elektroporation, som er en almindelig metode til at indføre reagenser i dyrkede cellelinjer, tilbyder et alternativ til mikroinjektion til levering af CRISPR-Cas9-komponenter i embryoner. Embryoelektroporation, der først blev påvist i rotteembryoner8, er siden blevet anvendt med succes som leveringsmetode i mus 9,10,11,12,13, svin14,15 og andre dyremodelorganismer 16,17,18. Embryoner, suspenderet i mediet indeholdende CRISPR-Cas9-reagenser, anbringes i en kuvette eller på et glasglas mellem to elektroder og udsættes for direkte impulser af elektriske strømme. Dette skaber forbigående åbninger i zona pellucida og embryoplasmamembranen, hvorigennem CRISPR-Cas9-komponenterne kommer ind i embryonerne. Typisk bruges elektriske "poring" impulser på mellemniveau til at skabe de midlertidige åbninger efterfulgt af elektriske "overførselsimpulser" på lavere niveau, der letter bevægelsen af de negativt ladede genomredigeringskomponenter. Embryoelektroporation er effektiv, har en høj gennemstrømning og er let at udføre. Mens embryoelektroporation har vist sig at være meget vellykket til introduktion af små (<200 bp) ssDNA-reparationsskabeloner, er der få rapporter om vellykket elektroporation af større (>1,0 kb) reparationsskabeloner13,19. Denne størrelsesbegrænsning udgør en væsentlig begrænsning af embryoelektroporation til generering af knock-in dyremodeller, der kræver store indsættelser.
I forbindelse med genterapi har adenoassocierede vira (AAV'er) længe været brugt som køretøjer til at levere genetisk materiale på grund af deres effektive in vivo-infektivitet af både delende og ikke-delende celler, mangel på patogenicitet og sjælden genomisk integration20,21. For nylig har flere undersøgelser kombineret AAV'er med CRISPR-Cas9-teknologi for at introducere DNA-reparationsskabeloner og CRISPR-reagenser 22,23,24. Denne tilgang tillader levering af større DNA-reparationsskabeloner uden behov for mikroinjektionsteknikker.
HDR-vejen er mere aktiv i de sene S- og G2-faser af cellecyklussen25,26. I studier udført in vitro blev signifikante stigninger i knock-in-effektivitet opnået ved levering af CRISPR-Cas9 RNP'er og DNA-reparationsskabeloner til G2-synkroniserede celler eller ved begrænsning af tilstedeværelsen af Cas9-protein til sene S- og G2-faser under anvendelse af et Cas9-Geminin-fusionsprotein2. Desuden er der en større zygotisk genomaktivering (ZGA) begivenhed, der forekommer under den udvidede G2-fase af 2-cellestadiet embryo, og dette er forbundet med en åben kromatintilstand. Det spekuleres i, at dette giver CRISPR-Cas9 RNP'erne og reparationsskabelonerne større tilgængelighed til det genomiske DNA.
Vores mål var at bygge videre på alle disse observationer ved at kombinere AAV-tilgangen med embryoelektroporation for at introducere CRISPR-Cas9 RNP'er på 2-cellestadiet af embryoudvikling. Denne strategi udnytter AAV's større DNA-reparationsskabelonleveringskapacitet, den tekniske lethed ved elektroporation og det mere optimale 2-celles tidspunkt for genomisk tilgængelighed under embryoudvikling for at skabe en effektiv metode til målrettet gensplejsning af DNA-indsættelser. Som fremhævet i denne protokol giver vores optimerede metode mulighed for produktion af målrettede knock-in rottemodeller, der bærer indsættelser af DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse uden behov for mikroinjektionsteknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af University of Missouri's Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC-protokol # 25580) og blev udført i henhold til retningslinjerne i vejledningen til brug og pleje af forsøgsdyr.
1. AAV-medieret levering af DNA-reparationsskabelon
- Design DNA-konstruktionen til at indeholde den ønskede knock-in-sekvens mellem to homologiarme. Typiske homologiarmlængder er 300-500 bp lange. Sørg for, at hele DNA-reparationsskabelonen (homologiarme + ønsket knock-in-sekvens) flankeres af inverterede terminalgentagelser (ITR'er) ved kloning i en passende plasmidrygrad og emballering i rekombinant ssAAV1 eller ssAAV6 (serotype 1 eller 6).
BEMÆRK: Hvis sgRNA-målsekvensen er til stede i DNA-reparationsskabelonen, er det vigtigt at konstruere tavse mutationer for at forstyrre denne sekvens og dermed forhindre CRISPR-Cas9-medieret redigering af den korrekt målrettede allel.
FORSIGTIG: Rekombinante AAV virale vektorer er ikke-integrerende og klassificeret som BSL-1. Der anvendes aseptiske standardteknikker til pipettering og håndtering af embryoner, der har været udsat for virus. - Tilsæt manipuleret ssAAV1 eller ssAAV6 (pakket med DNA-reparationsskabelon) til 30 μL KSOM-R-medier27,28 til en endelig koncentration på 3 × 107 genomkopier (GC)/μL under mineralolie i 35 mm petriskål.
- Placer zygoter med synlige pronuclei i KSOM-R-mediet, der indeholder konstrueret ssAAV.
BEMÆRK: Ved hjælp af denne protokol er der ikke behov for at tynde zona pellucida, da AAV-serotype 1 og 6 let kan passere igennem for effektiv levering af DNA-reparationsskabeloner. - Der inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 og maksimal luftfugtighed i 18-20 timer for at muliggøre tilstrækkelig viral transduktion.
2. Forberedelse af elektroporation
- Den følgende dag fremstilles en elektroporationsblanding indeholdende 100 ng/μL sgRNA og 100 ng/μL Cas9-protein fortyndet i Opti-MEM-medier i et sterilt RNasefrit rør. Bland forsigtigt.
- Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter for at muliggøre RNP-dannelse.
- I løbet af inkubationstiden skal du tænde elektroporatoren og tilslutte ledninger til en 1,5 mm mellemrumsglasglideelektrode.
- Indstil elektroporationsparametre som beskrevet i tabel 1.
3. 2-celle embryo elektroporation
- Afpipetter forsigtigt 5 μL af CRISPR-elektroporationsblandingen mellem de to elektroder på glasglasset, og pas på ikke at indføre luftbobler i opløsningen.
- Fjern embryoet i 2-cellestadiet fra AAV-opløsningen. Stil 2-cellede embryoner op i blandingen uden at lade dem røre ved elektrodernes sider. Dette gøres for at undgå lysis.
- Tryk på Ohm-knappen for at måle impedansen. Kontroller, at impedans er mellem 0,100 og 0,300 kΩ. Reaktionsvolumenet vil ændre impedansen (tilføj volumen for at reducere impedans og træk volumen for at øge impedansen).
- Tryk på Start. Processen tager få sekunder at fuldføre.
- Embryonerne fjernes umiddelbart efter elektroporationen, og der vaskes 3 gange i friske 30 μL dråber KSOM-R-medier.
- Embryonerne anbringes tilbage i 37 °C inkubator med 5% CO2 og maksimal luftfugtighed til in vitro kultur i 500 μL dråber KSOM-R medier under mineralolie. Alternativt kan embryoner overføres kirurgisk til en 1,5-dages pseudogravid hunrotte efter coitum (dpc) for at producere levende afkom.
Figur 1: Skematisk oversigt over AAV-medieret DNA-levering og 2-celle embryoelektroporationspipeline til CRISPR-Cas9-genomredigering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter protokollen er der effektiv AAV-medieret levering af DNA-reparationsskabelonen, der giver mulighed for meget effektiv HDR, efter at 2-cellede embryoner er elektroporeret med CRISPR-Cas9 RNP'er. Som vist i videoen resulterer en vellykket elektroporationsproces i, at der dannes bobler på hver elektrode (figur 2C), og impedansen forbliver inden for området 0,100 og 0,300 kΩ. Efter elektroporation er det ikke ualmindeligt, at embryoner svulmer op og fylder perivitellinerummet inde i zona pellucida (figur 3). Denne hævelse skal aftage efter et par timer i kultur. Det er heller ikke ualmindeligt at se en lille procentdel (op til 20%) af cellulære fusionshændelser efter elektroporering af 2-cellede embryoner (figur 3). Cellulær fusion kan potentielt undgås ved omhyggelig vandret aksejustering snarere end lodret aksejustering mellem elektroderne (figur 2B). Vi kasserer dog typisk bare alle sammensmeltede embryoner efter elektroporationsprocessen.
Vores AAV-medierede DNA-levering med 2-celle embryo CRISPR-Cas9 RNP-elektroporationsteknik har vist sig at være yderst effektiv til generering af knock-in rottemodeller med målrettede indsættelser. Ved at teste vores metode i rotteembryoner og screene dyrkede blastocyster for indsættelse af en konstrueret kort kunstig intron indeholdende loxP-steder, bemærkede vi, at over 60% af blastocysterne indeholdt den korrekt målrettede knock-in-allel baseret på Next Generation Sequence (NGS) analyse (figur 4). Ved at teste vores metode til at producere levende knock-in rotter designede vi desuden et projekt til at konstruere en Cre-rekombinasekodningssekvens målrettet ATG-startstedet for rottens Drd2-gen. Den AAV-pakkede DNA-donorskabelon bestod af ITR-sekvenser, der kræves til AAV-emballage, en 5' homologiarm (422bp i længden), en Cre-pA-sekvens (1.339bp i længden) og en 3' homologiarm (477bp i længden) (figur 5A). Af de 11 fødte afkom var 10 positive ved PCR-analyse for den korrekt indsatte Cre-pA-sekvens i ATG-startstedet for rotte Drd2 (figur 5B-D). Den målrettede indsættelse blev senere bekræftet ved DNA-sekvensanalyse. Som et resumé over 7 forskellige projekter har vi opnået en gennemsnitlig knock-in succesrate på 76% hos grundlæggerdyr som bestemt af PCR-analyse på tværs af homologiarmkryds og DNA-sekvensverifikation (tabel 2).
| Spænding [V] | Pulslængde [msek] | Pulsinterval [msek] | # af pulser | Forfaldshastighed [%] | Polaritet | |
| Poring puls | 40 | 3.5 | 50 | 4 | 10 | + |
| Overfør puls | 5 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
Tabel 1: Elektroporationsparametre. Sørg for, at den aktuelle grænse er tændt under elektroporationen.
Figur 2: 2-cellet embryoelektroporationsproces. (A) Glasglideelektrode. B) embryoner suspenderet i CRISPR-Cas9-genomredigeringsreagenser og indlæst i glasglasstråleelektroden inden elektroporation. (C) Dannelse af luftbobler på hver elektrode under elektroporation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Embryoets udseende efter elektroporation. Cellulær fusion bemærkes i op til 20% af 2-cellede embryoner efter elektroporation. Embryonale celler kan også svulme inde i zona pellucida og fylde perivitellinerummet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: AAV-medieret DNA-levering og 2-celle embryoelektroporation knock-in effektivitet i dyrkning rotteblastocyster. Data præsenteret som procentdel af blastocyster, der er positive for korrekt knock-in alleldetektion ved Next Generation Sequencing (NGS). N = 28 blastocyster (kun kulturkontrolgruppe), N = 37 blastocyster (elektroporation (EP) kun kontrolgruppe) og N = 35 blastocyster (AAV + EP-gruppe). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Oprettelse af en Drd2-Cre knock-in rottemodel. A) Målretning af rottens Drd2-gen. RNP-komplekset blev designet til at målrette Exon 2, som indeholder startstedet for kodningsområdet. AAV-donorskabelonen indeholdt virale inverterede terminale gentagelsessekvenser (ITR), 5' og 3' Drd2 genhomologiarme (HA) og Cre-genet med en polyA-sekvens. Vellykket integration af donorskabelonen banker Cre-genet 3' ind på startstedet i Exon 2. Dette sætter Cre-genet under kontrol af Drd2-promotoren, samtidig med at Drd2-genet slås ud. Placeringen af PCR-primere, der bruges til bekræftelse af vellykket knock-in, er angivet med lilla pile. (B) PCR-analyse af potentielt genomredigerede dyr (baner B10-C8) med primere, der spænder over 5' homologiarmen. Bane C9: vildtype (negativ kontrol) Bane C10: ingen skabelon (negativ kontrol). Forventet amplicon størrelse for knock-in positive dyr er 601bp. (C) PCR-analyse af potentielt genomredigerede dyr (baner D8-E6) med primere, der spænder over 3'-homologiarmen. Bane E7: vild type; Bane E8: ingen skabelonkontrol. Den forventede amplikon størrelse for knock-in positive dyr er 676bp. (D) Cre gen detektion. Forventet amplicon størrelse er 381bp. Baner C7-D5: potentielle grundlæggere; Bane D6: vild type; Bane D7: ingen skabelonkontrol. PCR-reaktioner blev analyseret ved kapillærelektroforese med 15bp-3kb justeringsmarkører (angivet med grønt). QX DNA-størrelsesmarkøren vises til venstre for hvert billede med topstørrelse svarende til PCR-amplikon størrelse i basepar (bp). Dette tal er ændret med tilladelse fra reference24. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Projekt beskrivelse | Afkom positive for knock-in (%) |
| Oprm1-P2A-Flp (1,7 kb indsættelse) | 5/5 (100%) |
| Drd2-Cre (1,3 kb indsættelse) | 10/11 (91%) |
| Triml2-P2A-Cre (1,3 kb indsættelse) | 9/16 (56%) |
| Cxcl15-iCre (1,3 kb indsættelse) | 6/6 (100%) |
| Opn4-P2A-Cre (1,2 kb indsættelse) | 6/8 (75%) |
| Vipr1-FLEX-EGFP (1,4 kb indsættelse) | 5/12 (42%) |
| Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (3,1 kb indsættelse) | 5/7 (71%) |
Tabel 2: Succesrater for knock-in-modeller
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR-Cas genomredigeringssystemet har revolutioneret området for genteknologi ved at muliggøre effektiv produktion af både enkle og komplekse, tilpassede genetiske modifikationer i en række dyrearter. Hyppige forbedringer og forbedringer i teknikker forbundet med genomredigering fremmer dens alsidighed. Her har vi beskrevet en ny tilgang ved hjælp af ssAAV-medieret DNA-levering sammen med 2-celle embryoelektroporation af CRISPR-Cas9-reagenser i 2-cellede gnaverembryoner. Vi har vist, at dette er en effektiv måde at producere målrettede dyremodeller på.
En stor fordel ved at bruge AAV er, at det muliggør levering af større DNA-reparationsskabeloner til embryoner uden behov for mikroinjektionsteknikker. AAV-medieret levering hjælper også noget med at omgå DNA-skabelonstørrelsesbegrænsningerne for elektroporation alene. Der er dog nogle vigtige overvejelser, når du bruger AAV. Zona pellucida, den hærdede glycoproteinmatrix, der omgiver det befrugtede æg, tjener som en fysisk barriere, der ofte komplicerer levering af nukleinsyrer. Udtynding af zona pellucida er en almindelig teknik, der bruges til bedre adgang til embryoet. Nogle undersøgelser har imidlertid rapporteret, at embryoudvikling hindres af infektion med højere doser (1 × 107 GC / μL til 1 × 109 GC / μL) AAV i embryoner, hvor zona pellucida blev tyndet før AAV-infektion22. Der er dog nogle serotyper af AAV, der kan diffundere over zona pellucida29. Vores protokol involverer ikke udtynding af zona pellucida og bruger AAV med serotype 1 og 6 i en koncentration på 3 × 107 GC / μl for at opnå knock-in-hastigheder, der er højere end tidligere offentliggjorte rapporter. Vi bemærkede ikke nedsat embryoudvikling under disse forhold.
Den høje knock-in-effektivitet, der opnås ved elektroporering af 2-cellede embryoner, skyldes sandsynligvis den udvidede G2-fase i embryoner på dette udviklingsstadium, hvilket gør dette til et optimalt udviklingsstadium til elektroporation. En potentiel komplikation er imidlertid den observerede cellulære fusion, der ses i nogle 2-cellede embryoner under elektroporationsprocessen. Denne observation er ikke overraskende, da elektrofusionsprocedurer almindeligvis anvendes til sammensmeltning af pattedyrceller, og fusion kan potentielt undgås ved omhyggelig vandret snarere end lodret aksejustering mellem elektroderne30,31. Når genomredigering sker på et senere udviklingstrin som 2-celle frem for 1-celle, er der desuden større potentiale for øget mosaikisme. Ved hjælp af vores 2-celle elektroporationsmetode observerede vi en lille stigning i mosaikisme sammenlignet med pronuklear injektion (86% for AAV-tilgang og 67% for PNI-tilgang) på et 1-cellestadium, men var stadig i stand til at opnå kimlinjetransmission af den modificerede allel hos alle testede grundlæggerdyr. En anden potentiel bekymring er muligheden for tandem concatemer integration af AAV-afledte DNA-skabeloner. Selvom vi ikke udførte langlæst sekventering for de modeller, der er beskrevet i denne protokol, bekræftede vi en enkelt integration af DNA-skabelonerne for alle modeller ved hjælp af dråbe-digital PCR (ddPCR) kopinummervariation.
Endelig, mens vores metode involverede AAV-levering af DNA-sekvenser af interesse, bør det være muligt at anvende andre virale og ikke-virale medierede DNA-leveringsmetoder i forbindelse med embryoelektroporation for med succes at genmanipulere embryoner. Afslutningsvis er kombinationen af ssAAV-medieret DNA-levering og elektroporation af CRISPR-Cas9 RNP'er i embryoner i 2-cellestadiet en effektiv og let tilpasningsdygtig metode til effektiv generering af knock-in rottemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Nolan Davis for hjælp med videografi og videoredigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
References
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
- Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
- Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
- Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
- Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
- Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
- Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
- Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
- Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
- Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
- Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
- Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
- Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
- Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).
