Summary
Denne protokollen presenterer en optimalisert tilnærming for å produsere genetisk modifiserte rottemodeller. Adenoassosiert virus (AAV) brukes til å levere en DNA-reparasjonsmal, og elektroporering brukes til å levere CRISPR-Cas9-reagenser for å fullføre genomredigeringsprosessen i 2-celleembryo.
Abstract
Genomredigeringsteknologi er mye brukt til å produsere genetisk modifiserte dyr, inkludert rotter. Cytoplasmatisk eller pronukleær injeksjon av DNA-reparasjonsmaler og CRISPR-Cas-reagenser er den vanligste leveringsmetoden i embryoer. Imidlertid krever denne typen mikromanipulasjon tilgang til spesialutstyr, er arbeidskrevende og krever et visst nivå av teknisk ferdighet. Videre resulterer mikroinjeksjonsteknikker ofte i lavere embryooverlevelse på grunn av den mekaniske belastningen på embryoet. I denne protokollen utviklet vi en optimalisert metode for å levere store DNA-reparasjonsmaler for å fungere sammen med CRISPR-Cas9-genomredigering uten behov for mikroinjeksjon. Denne protokollen kombinerer AAV-mediert DNA-levering av enkeltstrengede DNA-donormaler sammen med levering av CRISPR-Cas9 ribonukleoprotein (RNP) ved elektroporering for å modifisere 2-celleembryoer. Ved hjelp av denne nye strategien har vi vellykket produsert målrettede knock-in rottemodeller som bærer innsetting av DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse med effektivitet mellom 42% og 90%.
Introduction
Utviklingen av CRISPR-baserte genomredigeringsverktøy har akselerert vår evne til effektivt å generere nye og mer sofistikerte genetisk konstruerte rottemodeller. Enkeltveiledet RNA, sammen med Cas9-nuklease, kombineres for å danne ribonukleoprotein (RNP) komplekser som retter seg mot DNA-sekvenser av interesse i genomet og resulterer i dobbeltstrengede DNA-brudd. Fordi cellulære DNA-reparasjonsmekanismer er utsatt for feil, blir innsettinger og slettinger (INDELs) introdusert under reparasjonsprosessen som kan forstyrre et målgens funksjon. Når det er samlevering av en ønsket konstruert DNA-sekvens (reparasjonsmal) sammen med genomredigeringsreagenser, skjer innsetting av reparasjonsmalen i regionen som inneholder det dobbeltstrengede DNA-bruddet gjennom en prosess som kalles homologirettet reparasjon (HDR). Dette er en effektiv strategi for å generere dyremodeller med målrettede DNA-innsettinger/substitusjoner (knock-ins). En begrensning er at innslagssekvenser ofte er store i størrelse, noe som har vist seg å redusere genredigeringseffektiviteten, og dermed gjøredet vanskeligere å generere den ønskede modellen. Strategier for å øke knock-in effektivitet har inkludert linearisering av både dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og enkeltstrenget DNA (ssDNA) reparasjonsmaler og kjemisk modifisering av DNA-reparasjonsmaler 2,3,4. I tillegg har pronukleær mikroinjeksjon sammen med HDR-stimulerende forbindelser, påføring av elektriske pulser i forbindelse med mikroinjeksjon og tidsbestemt mikroinjeksjon i 2-celleembryoer alle blitt forsøkt 5,6,7. Til tross for suksessen til noen av disse tilnærmingene, er inkorporering av DNA-sekvenser større enn 1,0 kb fortsatt teknisk utfordrende.
Elektroporering, som er en vanlig metode for å introdusere reagenser i dyrkede cellelinjer, tilbyr et alternativ til mikroinjeksjon for å levere CRISPR-Cas9-komponenter i embryoer. Embryoelektroporering, først demonstrert i rotteembryoer8, har siden blitt brukt som en leveringsmetode hos mus 9,10,11,12,13, griser 14,15 og andre dyremodellorganismer 16,17,18. Embryoer, suspendert i mediet som inneholder CRISPR-Cas9-reagenser, plasseres i en kyvette eller på et glassglass mellom to elektroder og underkastes direkte pulser av elektriske strømmer. Dette skaper forbigående åpninger i zona pellucida og embryoplasmamembranen gjennom hvilke CRISPR-Cas9-komponentene kommer inn i embryoene. Vanligvis brukes elektriske "poring" -pulser på mellomnivå for å lage de midlertidige åpningene etterfulgt av elektriske "overføringspulser" på lavere nivå som letter bevegelsen av de negativt ladede genomredigeringskomponentene. Embryoelektroporering er effektiv, har høy gjennomstrømning og er enkel å utføre. Imidlertid, mens embryoelektroporering har vist seg å være svært vellykket for innføring av små (<200 bp) ssDNA-reparasjonsmaler, er det få rapporter om vellykket elektroporering av større (>1,0 kb) reparasjonsmaler13,19. Denne størrelsesbegrensningen representerer en stor begrensning av embryoelektroporering for å generere innbankede dyremodeller som krever store innsettinger.
I sammenheng med genterapi har adenoassosierte virus (AAV) lenge vært brukt som kjøretøy for å levere genetisk materiale på grunn av deres effektive in vivo smittsomhet av både delende og ikke-delende celler, mangel på patogenisitet og sjelden genomisk integrasjon20,21. Nylig har flere studier kombinert AAV-er med CRISPR-Cas9-teknologi for å introdusere DNA-reparasjonsmaler og CRISPR-reagenser 22,23,24. Denne tilnærmingen tillater levering av større DNA-reparasjonsmaler uten behov for mikroinjeksjonsteknikker.
HDR-banen er mer aktiv i de sene S- og G2-fasene i cellesyklusen 25,26. I studier utført in vitro ble signifikante økninger i innslagseffektivitet oppnådd ved levering av CRISPR-Cas9 RNP og DNA-reparasjonsmaler i G2-synkroniserte celler eller ved begrensning av tilstedeværelsen av Cas9-protein til sene S- og G2-faser ved bruk av et Cas9-Geminin-fusjonsprotein2. Videre er det en stor zygotisk genomaktivering (ZGA) hendelse som oppstår under den utvidede G2-fasen av 2-cellestadiet embryo, og dette er forbundet med en åpen kromatintilstand. Det spekuleres i at dette gir CRISPR-Cas9 RNP-ene og reparasjonsmalene større tilgjengelighet til genomisk DNA.
Vårt mål var å bygge videre på alle disse observasjonene, ved å kombinere AAV-tilnærmingen med embryoelektroporering for å introdusere CRISPR-Cas9 RNP på 2-cellestadiet av embryoutvikling. Denne strategien utnytter den større leveringskapasiteten til DNA-reparasjonsmalen til AAV, den tekniske brukervennligheten til elektroporering og det mer optimale 2-celle tidspunktet for genomisk tilgjengelighet under embryoutvikling for å skape en effektiv metode for målrettet genmanipulering av DNA-innsettinger. Som fremhevet i denne protokollen, tillater vår optimaliserte metode produksjon av målrettede knock-in rottemodeller som bærer innsettinger av DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse uten behov for mikroinjeksjonsteknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av University of Missouris institusjonelle dyrepleie- og brukskomité (ACUC-protokoll # 25580) og ble utført i henhold til retningslinjene som er angitt i veiledningen for bruk og pleie av laboratoriedyr.
1. Levering av AAV-mediert DNA-reparasjonsmal
- Design DNA-konstruksjonen til å inneholde den ønskede bankesekvensen mellom to homologiske armer. Typiske homologiske armlengder er 300-500 bp i lengde. Forsikre deg om at hele DNA-reparasjonsmalen (homologiarmer + ønsket innbankingssekvens) er flankert av inverterte terminalrepetisjoner (ITR) ved å klone inn i en passende plasmidryggrad og pakke inn i rekombinant ssAAV1 eller ssAAV6 (serotyper 1 eller 6).
MERK: Hvis sgRNA-målsekvensen er tilstede i DNA-reparasjonsmalen, er det viktig å konstruere stille mutasjoner for å forstyrre denne sekvensen og dermed forhindre CRISPR-Cas9-mediert redigering av riktig målrettet allel.
FORSIKTIG: Rekombinante AAV-virusvektorer er ikke-integrerende og klassifisert som BSL-1. Standard aseptiske teknikker brukes for pipettering og håndtering av embryoer som har vært utsatt for virus. - Tilsett konstruert ssAAV1 eller ssAAV6 (pakket med DNA-reparasjonsmal) til 30 μL KSOM-R-medier27,28 til en endelig konsentrasjon på 3 × 107 genomkopier (GC)/μL under mineralolje i 35 mm petriskål.
- Plasser zygoter med synlige pronuclei i KSOM-R-mediet som inneholder konstruert ssAAV.
MERK: Ved å bruke denne protokollen er det ikke nødvendig å tynne zona pellucida, da AAV serotype 1 og 6 lett kan passere gjennom for effektiv levering av DNA-reparasjonsmaler. - Inkuber ved 37 °C med 5 % CO2 og maksimal fuktighet i 18-20 timer for å muliggjøre tilstrekkelig viral transduksjon.
2. Forberedelse av elektroporering
- Neste dag, lag en elektroporasjonsblanding som inneholder 100 ng / μL sgRNA og 100 ng / μL Cas9-protein fortynnet i Opti-MEM-medier i et sterilt RNase-fritt rør. Bland forsiktig.
- Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter for å tillate RNP-dannelse.
- Under inkubasjonstiden, slå på elektroporatoren og koble ledningene til en 1,5 mm gap glass lysbildeelektrode.
- Angi elektroporasjonsparametere som beskrevet i tabell 1.
3. 2-celle embryo elektroporering
- Pipetter forsiktig 5 μL av CRISPR-elektroporeringsblandingen mellom de to elektrodene på glasslysbildet, og pass på at det ikke introduseres luftbobler til løsningen.
- Fjern embryoet i 2-cellestadiet fra AAV-oppløsningen. Still opp 2-celle stadium embryoer i blandingen uten å la dem berøre sidene av elektrodene. Dette gjøres for å unngå lysis.
- Trykk på Ohm-knappen for å måle impedansen. Kontroller at impedansen er mellom 0,100 og 0,300 kΩ. Reaksjonsvolumet vil endre impedansen (legg til volum for å redusere impedans og trekke fra volum for å øke impedansen).
- Trykk Start. Prosessen tar noen sekunder å fullføre.
- Fjern embryoer umiddelbart etter elektroporering og vask 3 ganger i friske 30 μL dråper KSOM-R-medier.
- Plasser embryoer tilbake i 37 °C inkubator med 5% CO2 og maksimal fuktighet for in vitro kultur i 500 μL dråper KSOM-R media under mineralolje. Alternativt kan du kirurgisk overføre embryoer til en 1,5-dagers post coitum (dpc) pseudogravid hunnrotte for å produsere levende avkom.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av AAV-mediert DNA-levering og 2-celle embryoelektroporasjonsrørledning for CRISPR-Cas9-genomredigering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen er det effektiv AAV-mediert levering av DNA-reparasjonsmalen som muliggjør svært effektiv HDR etter at 2-celleembryoer er elektroporert med CRISPR-Cas9 RNP. Som vist i videoen, resulterer en vellykket elektroporeringsprosess i bobler som dannes på hver elektrode (figur 2C) og impedansen forblir innenfor området 0,100 og 0,300 kΩ. Etter elektroporering er det ikke uvanlig at embryoer hovner opp og fyller perivitellinerommet inne i zona pellucida (figur 3). Denne hevelsen skal avta etter noen timer i kultur. Det er heller ikke uvanlig å se en liten prosentandel (opptil 20 %) av cellulære fusjonshendelser etter elektroporering av 2-celleembryoer (figur 3). Cellulær fusjon kan potensielt unngås ved forsiktig horisontal aksejustering i stedet for vertikal aksejustering mellom elektrodene (figur 2B). Imidlertid kaster vi vanligvis bare eventuelle smeltede embryoer etter elektroporeringsprosessen.
Vår AAV-medierte DNA-levering med 2-celle embryo CRISPR-Cas9 RNP elektroporasjonsteknikk har vist seg å være svært effektiv for å generere knock-in rottemodeller med målrettede innsettinger. Ved å teste vår metode i rotteembryoer og screening av dyrkede blastocyster for innsetting av et konstruert kort kunstig intron som inneholder loxP-steder, bemerket vi at over 60% av blastocystene inneholdt riktig målrettet innbankingsallel basert på Next Generation Sequence (NGS) analyse (figur 4). Videre testet vi vår metode for å produsere levende knock-in rotter, designet vi et prosjekt for å konstruere en Cre rekombinase kodingssekvens rettet mot ATG-startstedet for rotte Drd2-genet. Den AAV-pakkede DNA-donormalen besto av ITR-sekvenser som kreves for AAV-pakking, en 5' homologisk arm (422bp i lengde), en Cre-pA-sekvens (1,339bp i lengde) og en 3' homologiarm (477bp i lengde) (figur 5A). Av de 11 avkomene som ble født, var 10 positive ved PCR-analyse for riktig innsatt Cre-pA-sekvens i ATG-startstedet til rotte Drd2 (figur 5B-D). Den målrettede innsettingen ble senere bekreftet ved DNA-sekvensanalyse. Som en oppsummering over 7 forskjellige prosjekter har vi oppnådd en gjennomsnittlig suksessrate på 76% hos grunnleggerdyr som bestemt av PCR-analyse på tvers av homologiske armkryss og DNA-sekvensverifisering (tabell 2).
| Spenning [V] | Pulslengde [msek] | Pulsintervall [msek] | # av pulser | Forfall Rate [%] | Polaritet | |
| Poring Puls | 40 | 3.5 | 50 | 4 | 10 | + |
| Overføringspuls | 5 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
Tabell 1: Elektroporasjonsparametere. Forsikre deg om at gjeldende grense er PÅ under elektroporeringen.
Figur 2: 2-celle embryo elektroporering prosess. (A) Glass lysbilde elektrode. (B) Embryoer suspendert i CRISPR-Cas9-genomredigeringsreagenser og lastet inn i glasslysbildeelektroden før elektroporering. (C) Dannelse av luftbobler på hver elektrode under elektroporering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Embryoutseende etter elektroporering. Cellulær fusjon er notert i opptil 20% av 2-celleembryoer etter elektroporering. Embryonale celler kan også svulme inne i zona pellucida som fyller perivitellinerommet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: AAV-mediert DNA-levering og 2-celle embryoelektroporering knock-in effektivitet i kultur rotte blastocyster. Data presentert som prosentandel blastocyster positive for korrekt innbankingsallelpåvisning ved neste generasjons sekvensering (NGS). N=28 blastocyster (kontrollgruppen med kun dyrkning), N=37 blastocyster (kontrollgruppen som bare er elektroporasjon (EP) og N=35 blastocyster (AAV+EP-gruppe). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Opprettelse av en Drd2-Cre knock-in rottemodell. (A) Målretting av Drd2-genet hos rotter. RNP-komplekset ble designet for å målrette mot Exon 2 som inneholder kodingsområdets startsted. AAV-donormalen inneholdt virale inverterte terminale repetisjonssekvenser (ITR), 5' og 3' Drd2-genhomologiske armer (HA) og Cre-genet med polyA-sekvens. Vellykket integrering av donormalen banker inn Cre-genet 3' til startstedet i Exon 2. Dette setter Cre-genet under kontroll av Drd2-promotoren samtidig som Drd2-genet slås ut. Plasseringen av PCR-primere som brukes til bekreftelse av vellykket innbanking er indikert med lilla piler. (B) PCR-analyse av potensielt genomredigerte dyr (Lanes B10-C8) med primere som spenner over 5' homologiarmen. Lane C9: vill type (negativ kontroll); Lane C10: ingen mal (negativ kontroll). Forventet ampliconstørrelse for innbankende positive dyr er 601bp. (C) PCR-analyse av potensielt genomredigerte dyr (Lanes D8-E6) med primere som strekker seg over 3' homologiarmen. Lane E7: vill type; Lane E8: ingen malkontroll. Forventet amplikonstørrelse for innbankende positive dyr er 676bp. (D) Cre gendeteksjon. Forventet ampliconstørrelse er 381bp. Lanes C7-D5: potensielle grunnleggere; Lane D6: vill type; Lane D7: ingen malkontroll. PCR-reaksjoner ble analysert ved kapillær elektroforese med 15bp-3kb justeringsmarkører (angitt i grønt). QX DNA-størrelsesmarkøren vises til venstre for hvert bilde med toppstørrelse tilsvarende PCR-amplikonstørrelsen i basepar (bp). Denne figuren er endret med tillatelse fra referanse24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Prosjektbeskrivelse | Avkom positive for innsjekking (%) |
| Oprm1-P2A-Flp (1,7 kb innsetting) | 5/5 (100%) |
| Drd2-Cre (1,3 kb innsetting) | 10/11 (91%) |
| Triml2-P2A-Cre (1,3 kb innsetting) | 9/16 (56%) |
| Cxcl15-iCre (innsetting på 1,3 kB) | 6/6 (100%) |
| Opn4-P2A-Cre (1,2 kb innsetting) | 6/8 (75%) |
| Vipr1-FLEX-EGFP (1,4 kb innsetting) | 5/12 (42%) |
| Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (3,1 kb innsetting) | 5/7 (71%) |
Tabell 2: Suksessrater for innbankingsmodeller
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR-Cas-genomredigeringssystemet har revolusjonert feltet genteknologi ved å tillate effektiv produksjon av både enkle og komplekse, tilpassede genetiske modifikasjoner i en rekke dyrearter. Hyppige forbedringer og forbedringer i teknikker knyttet til genomredigering øker allsidigheten. Her har vi beskrevet en ny tilnærming ved bruk av ssAAV-mediert DNA-levering sammen med 2-celle embryoelektroporering av CRISPR-Cas9-reagenser i 2-celle gnagerembryoer. Vi har vist at dette er en effektiv måte å produsere målrettede innbankede dyremodeller på.
En stor fordel med å bruke AAV er at det muliggjør levering av større DNA-reparasjonsmaler til embryoer uten behov for mikroinjeksjonsteknikker. AAV-mediert levering bidrar også til en viss omgåelse av størrelsesbegrensningene for DNA-maler ved elektroporering alene. Det er imidlertid noen viktige hensyn å ta ved bruk av AAV. Zona pellucida, den herdede glykoproteinmatrisen som omgir det befruktede egget, tjener som en fysisk barriere som ofte kompliserer levering av nukleinsyrer. Tynning av zona pellucida er en vanlig teknikk som brukes til bedre tilgang til embryoet. Noen studier har imidlertid rapportert at embryoutvikling hindres av infeksjon med høyere doser (1 × 107 GC/μL til 1 × 109 GC/μL) AAV hos embryoer der zona pellucida ble tynnet før AAV-infeksjon22. Det finnes imidlertid noen serotyper av AAV som kan diffundere over zona pellucida29. Vår protokoll innebærer ikke tynning av zona pellucida og bruker AAV med serotype 1 og 6 i en konsentrasjon på 3 × 107 GC/μl for å oppnå høyere innslagsrater enn tidligere publiserte rapporter. Vi registrerte ikke redusert embryoutvikling under disse forholdene.
Den høye innslagseffektiviteten oppnådd ved elektroporering av 2-celleembryoer skyldes mest sannsynlig den utvidede G2-fasen i embryoer på dette utviklingsstadiet, noe som gjør dette til et optimalt utviklingsstadium for å utføre elektroporering. Imidlertid er en potensiell komplikasjon den observerte cellulære fusjonen sett i noen 2-celleembryoer under elektroporasjonsprosessen. Denne observasjonen er ikke overraskende gitt at elektrofusjonsprosedyrer ofte brukes til å smelte sammen pattedyrceller, og fusjon kan potensielt unngås ved forsiktig horisontal snarere enn vertikal aksejustering mellom elektrodene30,31. Videre, når genomredigering skjer på et senere stadium i utviklingen som 2-celle i stedet for 1-celle, er det større potensial for økt mosaikk. Ved å bruke vår 2-celle elektroporasjonstilnærming observerte vi en liten økning i mosaikk sammenlignet med pronukleær injeksjon (86% for AAV-tilnærming og 67% for PNI-tilnærming) på et 1-cellestadium, men var fortsatt i stand til å oppnå kimlinjeoverføring av det modifiserte allelet i alle testede grunnleggerdyr. En annen potensiell bekymring er muligheten for tandemkonatemerintegrasjon av AAV-avledede DNA-maler. Selv om vi ikke utførte langlest sekvensering for modellene beskrevet i denne protokollen, bekreftet vi enkel integrering av DNA-malene for alle modeller ved hjelp av dråpe-digital PCR (ddPCR) kopinummervariasjon.
Til slutt, mens vår metode innebar AAV-levering av DNA-sekvenser av interesse, bør det være mulig å bruke andre virale og ikke-virale medierte DNA-leveringsmetoder i forbindelse med embryoelektroporering for å lykkes med genetisk manipulering av embryoer. Avslutningsvis er kombinasjonen av ssAAV-mediert DNA-levering og elektroporering av CRISPR-Cas9 RNP i 2-celle stadium embryoer en effektiv og lett tilpasningsdyktig metode for effektiv generering av knock-in rottemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Nolan Davis for hjelp med videografi og videoredigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
References
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
- Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
- Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
- Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
- Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
- Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
- Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
- Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
- Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
- Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
- Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
- Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
- Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
- Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).
