以DNA为基础的鱼类物种鉴定协议

鱼种鉴定系统是一种简单、快速、准确的基于 DNA 的方法，用于鉴定给定样品中存在的鱼种。用蛋白酶 K 处理鱼样品，将核酸释放到溶液中。然后分离鱼类基因组 DNA，并使用与所有鱼类基因组中发现的序列结合的引物进行 PCR 扩增。

然后用三种不同的限制性内切酶消化 PCR 产物，并在 Agilent 2100 生物分析仪上进行分离。消化反应中产生的片段长度可用于使用限制性片段长度多态性或 RFLP 模式匹配软件确定鱼的种类。大家好，我是来自安捷伦科技公司的 Rachel Formosa。

今天，我们将向您展示一种基于 DNA 的鱼种鉴定程序。该程序是一种筛选方法，可让您识别新鲜、冷冻、碎、熟、干或其他加工样品中存在的鱼种。这可以在不到一个工作日内完成。

我们使用此程序来研究海鲜的真伪，这对海鲜行业非常重要，因为替代和贴错标签可能会产生重大的经济、环境和食品安全后果。此外，通过目视识别和其他传统方法确定鱼类种类可能特别困难。一旦鱼经过加工，DNA 检测就会提供更准确和可靠的结果。

那么让我们开始吧。将 10 至 1000 毫克生鱼或熟鱼组织样品放入 1.5 毫升微量离心管中，开始制备用于 DNA 提取的样品。在 220 μL 新鲜制备的蛋白酶盒溶液中取样，并上下移液。

将试管在 65 摄氏度下孵育 10 分钟，然后以 14， 000 Gs 的离心机孵育 3 至 5 分钟，以沉淀任何未消化的组织。接下来，小心地将 150 μL 的每种上清液转移到新的 1.5 mL试管中，避免底部出现任何未消化的物质和顶部出现的油性物质。上清液现在将用于基因组 DNA 提取。

通过向每个样品中加入 500 μL 核酸结合缓冲液来开始基因组 DNA 提取。这将使总样品量达到 650 微升。涡旋样品直至均质化。

接下来，将每个样品转移到 DNA 结合离心杯中，该离心杯位于试剂盒中提供的两个 ml 容器管之一中。将试管盖卡在离心杯的顶部。以 14， 000 Gs 离心样品 1 分钟，以将 DNA 上样到离心杯基质上。

离心后，取出离心杯，弃去滤液，然后将杯子放回容器管中。加入 500 μL 1 x 高盐洗涤缓冲液。盖上试管并在离心后再次离心。

丢弃滤液，然后再次将离心杯放回容器管中。现在加入 500 微升 80% 乙醇。盖上试管，以 14， 000 Gs 离心 1 分钟。

再次在 80% 乙醇中洗涤第三次后，再重复乙醇洗涤两次，弃去滤液。更换插座管中的离心杯，此时旋转 2 分钟以干燥纤维基质。现在将离心杯转移到 1.5 毫升收集管中。

向每个旋转杯中加入 100 μL 析出缓冲液，直接添加到杯内的纤维基质上。然后将收集管盖卡在离心杯上，并在室温下孵育 1 分钟。孵育后，以最大速度旋转样品 1 分钟。

接下来，丢弃旋转杯并盖上试管。如果测量 DNA 浓度，预计浓度范围为 5 ng/μL 至 500 ng/μL。DNA 现在可以在 4 摄氏度下储存长达一个月以进行长期储存，将 DNA 置于零下 20 或零下 80 摄氏度。

使用 P-C-R-R-F-L-P 试剂盒中提供的引物和试剂进行 PCR。根据随附的书面方案，建议在 PCR 运行时一式两份运行每个样品，包括阳性抗无模板对照。通过按顺序组合以下组分，制备用于消化的限制性内切酶预混液：DTE、E、1 HAE 3 和 NL 3,1.5 微升无菌蒸馏水、0.5 微升 10 x 酶缓冲液和 0.5 微升 10 x 酶。

为所有样品准备足够的样品，外加一个反应体积、过量的 fourex 三种试剂混合物。然后将 2.5 μL 分配到标有样品和酶名称的每个反应管中。PCR 完成后，从热循环仪中取出样品并将它们放在冰上。

向三个限制性酶切管中分别添加 2.5 μL 每种 PCR 产物以进行该反应。DDE 1 个 HAE 和 NLA 3 个。下一个漩涡。

短暂离心并在 37 摄氏度下孵育消化液 2 小时。如果更方便，消化液也可以孵育过夜。消化后，将反应物在 65 摄氏度下孵育 15 分钟。

然后向每管中加入 1 微升 60 毫摩尔 EDTA 以终止反应并涡旋。使用 Agilent 生物分析仪试剂盒，根据试剂盒指南制备限制性酶切物并将其加载到 A DNA 芯片的孔中。对于每个样品，所有三个消化物都应加载到同一个芯片上。

然后涡旋芯片并将其装入机器中。运行完成后，转到检测上下文并选择 ChIP summary 选项卡。在样品名称字段中，输入芯片所有 12 个孔的样品名称，以识别测试 DNA 样品的鱼类种类。

通过单击启动 RFLP 解码器程序 file.然后打开 XAD 文件。打开的对话框将打开。

现在为使用的 DNA 芯片选择 XAD 文件。然后单击 open 查看芯片上加载的样本列表。选择与第一个 DNA 样品相对应的三个酶解物。

在酶列下，指定在标记为最小峰高作为下限标记物百分比的字段中使用的限制性内切酶。如果需要，默认值为 10%。可以降低该值以识别遗漏的小峰，或提高该值以丢弃由电泳图中的非特异性噪音引起的峰。

对最小峰高值进行任何调整后，单击 reintegrate（重新积分）。现在单击对话框底部的 calc。从生物分析仪运行中获得的片段长度数据将填充软件字段。

接下来，在屏幕左上角的分数下拉列表中，选择骰子。如果鱼样本由单一鱼类物种或混合物组成，如果样本可能由混合物组成，则屏幕底部的表格标有 Combined Score list。最佳物质匹配基于所有三个消化反应的结果。

得分为 1 的完美匹配项以绿色突出显示。接近匹配项在屏幕顶部以黄色突出显示。下限截止值指定分析中使用的最小片段大小，匹配容差值确定片段的长度必须与预测片段接近多近才能被视为匹配。

显示的值是默认设置，可能会进行调整。重复这些步骤以分析尖端上剩余的 DNA 样品。使用本视频中描述的方法分离、扩增和消化来自四种不同鱼类的 DNA 样品。

此处显示了使用 Agilent 生物分析仪和 RFLP 解码器显示限制性酶切样品的生物分析仪凝胶。软件弯曲模式用于识别这里的鱼。第一个样本被正确识别为鳟鱼，第二个样本为金枪鱼，第三个样本为岩土。

最后一个样本为特定鳕鱼。我们刚刚向您展示了如何使用安捷伦的 P-C-R-R-F-L-P 方法进行基于 DNA 的鱼类鉴定。执行此程序时，避免样品交叉污染非常重要，因为该方法非常敏感。

就是这样。现在，您知道如何快速、轻松、准确地鉴定样品中存在的鱼类。感谢您的观看，祝您的实验好运。