Name: 以DNA为基础的鱼类物种鉴定协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学习基于DNA的鱼类物种鉴定方法，通过PCR扩增和RFLP分析技术，利用Agilent生物分析仪快速准确识别鱼类样本。该方法适用于新鲜、冷冻及加工鱼类，可在一天内完成检测，有效保障海产品真实性和食品安全。

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Agilent Stratagene 产品部 
<ul>
<li>Harini Ravi</li>
<li>Natalia Novorodovskaya</li>
<li>Scott Basehore</li>
<li>Jeff Braman</li>
<li>Rachel Formosa</li>
<li>Ronda Allen</li>
<li>Rajesh Bagga</li>
<li>Derek Hall</li>
<li>Sarah Jandle</li>
<li>Danielle Huffman</li>
</ul>

Agilent 实验室
<ul>
<li>Robert Kincaid</li>
<li>Mary McBride</li>
</ul>

Agilent 欧洲
<ul>
<li>Nigel Skinner</li>
<li>Juergen Schneider</li>
<li>Stephen Mueller</li>
<li>Martin Kratzmeier</li>
</ul>

Campden BRI
<ul>
<li>Steve Garrett</li>
</ul>

1：准备鱼类样本以进行DNA提取
<ol>
<li>针对每个待检测的鱼类样本，取一片重量在 10 mg 至 1 g 之间的鱼组织（生或熟），放入一个 1.5-ml 微量离心管中。可参考下图，根据样本大小估算生鱼样本的重量。 
<img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig1.jpg" alt="三文鱼样本比较；重量与尺寸；比例图表；鱼类样本度量研究；生物学研究" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 1"> 
图 1. 基于样本尺寸的鱼类样本质量估算。 </li>
<li>将蛋白酶 K 消化缓冲液在 65°C 的培养箱或水浴中预热 5 分钟。</li>
<li>通过将每份样本加入 200 μl 蛋白酶 K 消化缓冲液和 20 μl 蛋白酶 K，配制蛋白酶 K 工作液。 
注意：每次使用前均需新鲜配制蛋白酶 K 工作液。</li>
<li>向每个含有鱼样本的 1.5-ml 管中加入 220 μl 蛋白酶 K 工作液。将各管在 65°C 的培养箱或水浴中孵育 10 分钟。</li>
<li>将各管在微量离心机中以 14,000 × g 离心 3 至 5 分钟，使未消化的组织沉淀。</li>
<li>将每份上清液的 150 μl 转移至新的 1.5-ml 管中。避免转移管底的未消化物质或管顶可能存在的油状物。 这些上清液即为用于提取基因组 DNA 的样本。</li>
</ol>
2：提取基因组 DNA
<ol>
<li>在无菌容器（聚丙烯管或玻璃瓶）中，通过将每份样品加入 320 μl 的 90% 亚砜烷和 170 μl 核酸结合缓冲液，配制亚砜烷与核酸结合缓冲液的工作液。 
建议配制足够量的该混合液，以处理未来 4 周内计划检测的所有样品。该混合液可在室温下保存最多 30 天。储存期间应避免光照。</li>
<li>向每份鱼样品中加入 490 μl 上述第 1 步配制的亚砜烷/结合缓冲液混合液。通过涡旋振荡或反复移液使样品充分均质化。加入该混合液后，每份样品的总体积将达到 640 μl。</li>
<li>将每份样品转移至已置于 2-ml 收集管（提供）中的 DNA 结合旋转杯中，并将收集管的盖子扣紧在旋转杯顶部。</li>
<li>在微量离心机中以 14,000 × g 离心 1 分钟，使 DNA 结合到旋转杯基质上。</li>
<li>取出并保留旋转杯，弃去滤液。对每份样品，将旋转杯重新放入收集管中，然后加入 500 μl 1× 高盐洗涤缓冲液，并盖上管盖。</li>
<li>在微量离心机中以 14,000 × g 离心 1 分钟。</li>
<li>取出并保留旋转杯，弃去滤液。对每份样品，将旋转杯重新放入收集管中，然后加入 500 μl 80% 乙醇，并盖上管盖。</li>
<li>在微量离心机中以 14,000 × g 离心 1 分钟。</li>
<li>重复步骤 7 和 8 两次，共进行 3 次使用 500 μl 80% 乙醇的洗涤。</li>
<li>第三次使用 80% 乙醇洗涤后，取出并保留旋转杯，弃去滤液。将旋转杯放回各自的收集管中，在微量离心机中以 14,000 × g 离心 2 分钟，以干燥纤维基质。</li>
<li>将旋转杯转移至 1.5-ml 收集管中。直接向每个旋转杯内的纤维基质上加入 100 μl 洗脱缓冲液。将收集管的盖子扣紧在旋转杯上，在室温下孵育 1 分钟。</li>
<li>在微量离心机中以最大转速离心 1 分钟。</li>
<li>纯化的 DNA 存在于微量离心管中的洗脱缓冲液中。弃去旋转杯，并盖上收集管。DNA 可在 4°C 下保存最多一个月。如需长期保存，应将 DNA 置于 20°C 或 80°C 下储存。</li>
<li>如有需要，可使用分光光度计测定 DNA 样品的浓度。</li>
</ol> 
基因组DNA提取方案通常获得的样品浓度范围为5 ng/μl至500 ng/μl。PCR-RFLP方案适用于DNA浓度在0.05 ng/μl至2000 ng/μl范围内的样品。
3：设置 PCR 反应
<ol> 
<li>	通过将 8 μl 的鲑鱼 DNA 原液与 32 μl 无菌、无 DNase 的水混合，制备 50 ng/μl 的阳性对照 DNA 稀释液。涡旋混匀。 
稀释后的样品可于 4°C 保存以供后续使用。</li> 
<li>	按以下表格中的组分顺序配制反应体系。通过将下表所列体积按比例放大，为所有需同时进行的 PCR 反应配制一份统一的试剂混合液。除待测 DNA 样品外，还需设置一个阳性对照反应和一个无模板对照反应。建议为每个待测 DNA 样品设置两个重复的 PCR 反应。试剂混合液的总量应满足所有反应所需体积，并额外增加一个反应的体积。 
例如，若您有 5 个待测 DNA 样品，则应配制足够用于 8 个反应 的试剂混合液（5 个待测反应、1 个阳性对照、1 个无模板对照和 1 个余量），或在包含待测反应重复的情况下配制足够用于 13 个反应 的混合液（10 个重复待测反应、1 个阳性对照、1 个无模板对照和 1 个余量）。 
PCR 试剂混合液
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>单个反应体积</td>
 <td>五个反应体积</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O, 无菌</td>
 <td>9 μl</td>
 <td>45 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2x PCR Master Mix</td>
 <td>12.5 μl</td>
 <td>62.5 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>引物混合液</td>
 <td>2.5 μl</td>
 <td>12.5 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总体积</td>
 <td>24 μl</td>
 <td>120 μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
<li>充分涡旋混匀试剂混合液，然后将 24 μl 分装至各个薄壁 PCR 反应管中。</li>
<li>向阳性对照反应管中加入 1 μl 稀释后的阳性对照 DNA。向各待测样品管中加入 1 μl 待测 DNA 样品。对于无模板对照反应，用 1 μl 无 DNase 水替代 DNA 加入。 为避免交叉污染，每种 DNA 样品应使用新的移液器吸头。加样后，通过快速上下吹打数次混匀反应体系。</li>
<li>盖紧反应管，涡旋混匀后短暂离心。</li></ol>
4：运行 PCR 程序
<ol>
<li>将反应体系放入热循环仪中，并运行下方所示的PCR程序。 
PCR循环程序
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>步骤</td>
 <td>循环次数</td>
 <td>温度</td>
 <td>持续时间</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>95°C</td>
 <td>5分钟</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>40</td>
 <td>95°C 50°C 72°C</td>
 <td>30秒 30秒 30秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>1</td>
 <td>72°C</td>
 <td>7分钟</td>
 </tr>
 </tbody>
</table> 
</li></ol>
5：用限制性内切酶消化PCR产物 
<ol>
<li>标记将用于限制性消化反应的0.5 ml离心管或0.2 ml联管。每个PCR反应需用三种不同的限制性内切酶进行消化：DdeI、HaeIII和NlaIII。因此，针对每个PCR反应，分别标记三个独立的离心管，注明PCR样品名称及限制性内切酶名称。</li>
<li>准备 DdeI 消化反应的试剂混合物，需将以下组分混合 依次。 为所有 DdeI 消化反应（另加至少一个反应体积的余量）配制单一的试剂混合液，各组分按倍数使用。PCR 完成后，用限制性内切酶处理 PCR 反应产物，进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析。 
DdeI 消化试剂混合物
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>体积</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O，无菌</td>
 <td>1.5 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x DdeI 缓冲液</td>
 <td>0.5 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x DdeI 酶</td>
 <td>0.5 μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
<li>充分涡旋混匀试剂混合物，然后分装 2.5 μl 加入已标记为 DdeI 的各个反应管中。</li>
<li>准备 HaeIII 消化反应的试剂混合物，需混合以下组分 依次。 为所有 HaeIII 消化反应（另加至少一个反应体积的余量）配制单一的试剂混合液，使用各组分的倍数进行配制。 
HaeIII 消化试剂混合物
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>体积</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O，无菌</td>
 <td>1.5 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x HaeIII 缓冲液</td>
 <td>0.5 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x HaeIII 酶</td>
 <td>0.5 μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
<li>充分涡旋混匀试剂混合物，然后分装 2.5 μl 加入已标记为 HaeIII 的各个反应管中。</li>
<li>准备 NlaIII 消化反应的试剂混合物，将以下组分混合 依次。 为所有 NlaIII 消化反应（外加至少一个反应体积的余量）配制单一的试剂混合液，使用各组分的倍数进行配制。 
NlaIII 消化试剂混合物
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>体积</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O，无菌</td>
 <td>1.5 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x NlaIII 缓冲液</td>
 <td>0.5 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x NlaIII 酶</td>
 <td>0.5 μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
<li>充分涡旋混匀试剂混合物，然后分装 2.5 μl 到已标记用于 NlaIII 的各个反应管中。</li>
<li>每个消化反应中，加入 2.5 μl 将适量的PCR产物加入已标记的试管中。所有的测试PCR反应以及阳性对照反应均需用三种限制性内切酶进行消化。</li>
<li>涡旋振荡消化反应液，然后短暂离心试管。</li>
<li>将所有消化反应置于 37°C 2小时。该孵育步骤可在热循环仪中进行。如需要，反应物可置于 37°C 过夜。</li>
<li>将反应物转移至 65°C 15分钟。此步骤可在热循环仪中进行。</li>
<li>添加 1 μl 加入 60 mM EDTA（试剂盒提供）至各反应体系中，充分涡旋混匀。</li>
</ol>
6：分析限制性酶切图谱 
<ol>
<li>制备凝胶-染料混合液，将DNA芯片放置于芯片预处理工作站上，并将混合液加载至DNA芯片中。</li>
<li>用移液器将5 μl DNA标记物加入标记有梯形符号的孔以及芯片上的12个样品孔中。 
DNA标记物由DNA 1000试剂盒中的绿色盖管提供。</li>
<li>用移液器将1 μl DNA分子量标准加入标记有梯形符号的孔中。 
DNA分子量标准由DNA 1000试剂盒中的黄色盖管提供。</li>
<li>针对每个DNA样品，根据下图所示指南，将各限制性消化反应产物1 μl分别加入芯片的12个样品孔之一中。采用此方法，1–3号孔用于阳性对照样品的3个消化反应，4–6号孔用于测试样品1的3个消化反应，7–9号孔用于测试样品2的3个消化反应，10–12号孔用于测试样品3的3个消化反应。在Agilent 2100 Bioanalyzer上分析限制性消化反应，以确定消化过程中产生的片段长度。Agilent DNA 1000试剂盒使用指南中提供了在Bioanalyzer上运行实验芯片的完整操作说明。为方便起见，以下提供简要操作流程。 
<img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig2.jpg" alt="芯片电泳用DNA芯片示意图；测试样品比较与对照样品分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 2"> 
图2. 芯片上样品的排列方式。 
若DNA样品少于4个，请向未使用的孔中加入1 μl水。若DNA样品超过4个，则需运行多个芯片。注意：无需在每块芯片上都运行阳性对照样品。</li>
<li>将芯片水平放入IKA涡旋混合器的适配器中，在2400 rpm条件下涡旋60秒。</li>
<li>将芯片插入Agilent 2100 Bioanalyzer中并启动芯片运行。原始信号将在仪器界面中实时显示。 
运行结束后，系统将根据峰识别算法的设定参数自动识别所有样品的峰。若认为算法未能检测到真实存在的峰，可降低“峰高阈值”设定值，以便算法识别该峰。</li>
<li>进入“Assay”界面，选择芯片汇总标签页。在“样品名称”字段中，为芯片上的全部12个孔输入对应的样品名称，如下图所示。 
<img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig3.jpg" alt="基因分析结果表格；PCR样品、对照样品列表、数据输入界面" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 3"> 
图3. 芯片汇总标签页中的样品名称输入界面。</li>
</ol>
7：使用 RFLP Matcher 鉴定测试样本物种 
可使用安捷伦软件应用程序 RFLP Decoder，根据消化反应中产生的片段长度来鉴定测试DNA样本的鱼类物种。表7 阳性对照限制性内切酶预期产物大小中的预期DNA片段大小（bp） DdeI 117, 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 本文提供的操作说明使用 RFLP Matcher 中的默认分析设置。有关软件操作及结果解读的详细信息，请参考软件的帮助系统。
<ol>
<li>启动 RFLP 解码程序。</li>
<li>点击 文件 &gt; 打开 &gt; XAD 文件。 
此时将打开打开对话框。</li>
<li>选择包含限制性消化反应的 DNA 芯片对应的 XAD 文件，然后点击 打开。 
系统将弹出一个对话框，列出芯片上加载的所有样本。</li>
<li>选择对应于一个 DNA 样本的三个消化反应，并使用酶列下方的下拉菜单为每个样本指定相应的限制性内切酶。在下图中，DNA 样本 1 已填写了酶列信息。 
<img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig4.jpg" alt="DNA 限制性分析图谱；酶切位点：DdeI, HaeIII, NlaIII；片段大小以碱基对表示。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 4"> 
图 4。为每个样本指定限制性内切酶。 </li>
<li>在标记为“min peak height as % of lower marker”的字段中，默认值为 10.0%。如有需要，可降低该值以识别之前遗漏的小峰，或提高该值以去除电泳图谱中非特异性噪声产生的峰。调整最小峰高数值后，请点击 Reintegrate（重新积分）。 
<img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig5.jpg" alt="色谱数据积分设置，峰重新积分控制，最小峰高调整。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 5"> 
图 5。设定最小峰高。 </li>
<li>点击对话框底部的 Calc（计算） 按钮。 
软件将自动填入从 Bioanalyzer 运行中获得的片段长度数据。</li>
<li>在屏幕左上角的 score（评分） 下拉列表中，选择适合数据分析的算法。若待分析的鱼类样本为单一鱼种，请在评分下拉列表中选择 Dice (Nei Li)；若样本可能为多种物种的混合物，则选择 Mixture（混合物）。 
屏幕底部标记为 combined（合并） 评分的表格将列出基于三个消化反应结果的最佳物种匹配。表格中同时显示物种学名和常用名（见下图）。完全匹配（评分为 1）以绿色高亮显示；黄色高亮的匹配视为近似匹配。您可双击某一物种名称，以打开该物种的 FishBase 网页。 
<img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig6.jpg" alt="鱼类物种评分表，数据分析结果，突出显示 Thunnus alalunga 及相关物种。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 6"> 
图 6。基于消化反应的物种鉴定。 </li>
<li>在屏幕顶部的 lower cutoff（下限截断） 和 match tolerance（匹配容差） 字段中，可调整默认设置以优化最佳物种匹配的评分。lower cutoff 值用于排除短于设定长度的片段；match tolerance 值决定一个片段与预测片段在长度上需接近到何种程度才被视为匹配。</li>
<li>对同一芯片上的其余 DNA 样本，重复执行步骤 4 至 8。</li>
</ol>
8：代表性结果：
下图显示了来自4种不同鱼类物种的限制性消化样品的Bioanalyzer凝胶图像。阳性DNA样品的预期结果总结在下表中。 
<img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig7.jpg" alt="凝胶电泳DNA片段分析，鱼类物种比较，酶消化结果示意图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7。限制性消化反应样品的Bioanalyzer凝胶图像。每条凝胶泳道均标注了该反应中所使用的限制性内切酶。 
三文鱼阳性对照中预期的DNA片段大小
<img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig8.jpg" alt="限制性内切酶表；列出 DdeI、HaeIII、NlaIII 及其预期的 DNA 产物大小（bp）。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 8"> 
图 8．鲑鱼阳性对照中预期的 DNA 片段大小。

<ol><li>Dooley, J. J., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+fish+species+identification+by+use+of+lab-on-a-chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Improved fish species identification by use of lab-on-a-chip technology.</a> Food Control. 16 (7), 601-607 (2004).</li>
<li>Dooley, J. J., Sage, H. D., Clarke, M. -A. L., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+species+Identification+Using+PCR-RFLP+Analysis+and+Lab-on-a-Chip+Capillary+Electrophoresis%3A+Application+to+Detect+White+Fish+Species+in+Food+Products+and+an+Interlaboratory+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Fish species Identification Using PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis: Application to Detect White Fish Species in Food Products and an Interlaboratory Study.</a> J. Agric. Food Chem. 53, 3348-3357 (2005).</li>
<li>Dooley, J., Garrett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+PCR-RFLP+Profiles+for+Fish+Species+Using+the+Agilent+2100+Bioanalyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies+Application+Note%22%5BJournal%5D)">Determination of PCR-RFLP Profiles for Fish Species Using the Agilent 2100 Bioanalyzer.</a> Agilent Technologies Application Note. , (2005).</li>
<li>Dooley, J. J., Clarke, M. L., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+chip-based+capillary+electrophoresis+system+to+enable+simple+PCR-RFLP+identification+of+fish+species%5BTitle%5D)+AND+%22FSA+Final+Report+Q01069%22%5BJournal%5D)">Application of a chip-based capillary electrophoresis system to enable simple PCR-RFLP identification of fish species.</a> FSA Final Report Q01069. , (2004).</li>
</ol>

作者受雇于安捷伦科技公司，该公司生产本文所使用的试剂和仪器。

我们展示了一种基于DNA的简便、快速且准确的筛查方法，用于鉴定海产品中的鱼类物种。该方法强大高效，可在不到一个工作日内提供可重复且精确的结果，且由于其流程简化的实验方案和简单的设备要求，可广泛应用于商业检测机构。该方法通过生成客观数据进行分析，并利用RFLP Decoder软件对实验获得的鱼类物种图谱数据库（可扩展）进行比对分析。
通过常规实施，该检测方法有望防止海产品标签的错误标注，并有助于维护符合政府法规要求的准确记录。

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 生物分析仪（配备芯片预处理站和 IKA 涡旋混合器）</td><td>安捷伦科技</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>安捷伦 2100 生物分析仪笔记本电脑 &amp;和专家软件</td><td>安捷伦科技</td><td>G2953CA</td><td>G2950CA - 台式电脑 &amp;和专家软件</td></tr><tr><td>安捷伦 Bioanalyzer DNA 1000 试剂盒（货号 #5067-1504）</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>各种</td><td>各种</td><td></td></tr><tr><td>PCR条形管</td><td>安捷伦科技</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>PCR条板盖</td><td>安捷伦科技</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>96孔工作架</td><td>安捷伦科技</td><td>410094</td><td></td></tr><tr><td>鱼类物种鉴定系统DNA提取试剂盒</td><td>安捷伦科技</td><td>联系</td><td></td></tr><tr><td>鱼类物种鉴定系统 PCR-RFLP 试剂盒</td><td>安捷伦科技</td><td>联系</td><td></td></tr><tr><td>RFLP Matcher 软件</td><td>安捷伦科技</td><td>联系</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇，200 证明（USP 级或同等级别）</td><td>各种</td><td>各种</td><td></td></tr><tr><td>无菌、无核酸酶水</td><td>各种</td><td>各种</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>各种</td><td>各种</td><td></td></tr><tr><td>65℃的培养箱或水浴锅&amp;#x00B0;C</td><td>各种</td><td>各种</td><td></td></tr><tr><td>无菌玻璃瓶或聚丙烯管（例如 14 ml BD Falcon 聚丙烯管）</td><td>各种</td><td>各种</td><td></td></tr><tr><td>圆底管或50 ml BD Falcon聚丙烯锥形管</td><td>各种</td><td>各种</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>各种</td><td>各种</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>各种</td><td>各种</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>各种</td><td>各种</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管架</td><td>各种</td><td>各种</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>各种</td><td>各种</td><td></td></tr></tbody></table>

基于dna的鱼类物种鉴定方案

DNA-based Fish Species Identification Protocol

我们开发了一种快速、简便且准确的基于DNA的筛查方法，用于鉴定新鲜及加工海产品样品中存在的鱼类物种。该方法具有良好的通用性，通过PCR扩增从鱼类样品中提取的基因组DNA，随后进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析，产生可在Agilent 2100 Bioanalyzer上分辨的片段图谱，并利用RFLP图谱匹配软件比对以确定正确的物种。
该鱼类鉴定方法采用一种简单、可靠的基于离心柱的方案，从鱼类样本中分离DNA。样本经蛋白酶K处理，以释放核酸进入溶液。随后将样本悬浮于结合缓冲液中，并加载至含有硅基纤维基质的微型离心柱中，使样本中的核酸与纤维基质结合。通过洗涤固定化的核酸以去除污染物，最终在100 μl洗脱液中回收总DNA。所提取的DNA可直接用于PCR扩增，所用引物可结合所有鱼类基因组中的保守序列。PCR产物随后用三种不同的限制性内切酶进行消化，并在Agilent 2100 Bioanalyzer上进行分离。通过分析消化反应产生的片段长度，结合包含商业重要鱼类物种实验获得的RFLP图谱数据库的RFLP模式匹配软件，可确定DNA样本来源的鱼类物种。

本文介绍如何使用安捷伦鱼类物种鉴定系统，通过提取DNA并进行PCR和RFLP分析来鉴定鱼类的物种。

基于DNA的鱼类物种鉴定方案

我们开发了一种快速、简便且准确的基于DNA的筛查方法，用于鉴定新鲜及加工海产品样品中存在的鱼类物种。

鱼类物种鉴定系统是一种简单、快速且准确的基于DNA的方法，用于鉴定给定样本中存在的鱼类物种。鱼类样本经蛋白酶K处理，以将核酸释放到溶液中。随后使用可结合所有鱼类基因组中序列的引物，对鱼类基因组DNA进行分离并进行PCR扩增。随后，PCR 产物用三种不同的限制性内切酶进行消化，并在 Agilent 2100 生物分析仪上进行分离。通过消化反应产生的片段长度可用于确定鱼类物种，方法是使用限制性片段长度多态性（RFLP）或片段长度多态性图谱比对软件。大家好，我是来自安捷伦科技的 Rachel Formosa。今天，我们将向您展示一种基于DNA的鱼类物种鉴定方法。该方法是一种筛查手段，可用于鉴定新鲜、冷冻、绞碎、煮熟、干燥或其他加工样品中所含的鱼类物种。整个过程可在不到一个工作日内完成。我们采用此方法来研究海产品的真伪，这对于海产品行业至关重要，因为物种替代和错误标识可能带来重大的经济、环境和食品安全问题。此外，仅通过肉眼识别及其他传统方法往往难以准确判断鱼类物种。一旦鱼类经过加工处理，DNA检测则能提供更为准确和可靠的结果。接下来我们开始。将每份生鱼或熟鱼组织样本取10至1000毫克，放入1.5毫升微量离心管中，每份鱼样对应一管。向每管中加入220微升 freshly prepared proteinase K 溶液，并用移液器反复吹打混匀。将试管在65摄氏度孵育10分钟，随后在14,000 G下离心3至5分钟，以沉淀任何未消化的组织。接下来，小心转移150微升上清液至新的1.5毫升离心管中，避免触碰底部的未消化物质以及顶部的油状物。此上清液将用于基因组DNA提取。开始基因组DNA提取，向每个样本中加入500微升核酸结合缓冲液，使总体积达到650微升。涡旋振荡样本直至均匀。接下来，将每个样品转移至已放入试剂盒提供的两个毫升接收管之一中的DNA结合离心柱中。将管盖扣紧在离心柱顶部。在14,000 G下离心样品一分钟，使DNA结合到离心柱基质上。离心后，取出离心柱，弃去滤液，并将离心柱放回收集管中。加入500 µL 1×高盐洗涤缓冲液。盖上管盖，再次离心。弃去滤液，再次将离心柱放回收集管中。然后加入 500 µL 80% 乙醇。盖上管盖，在 14,000 ×g 条件下离心 1 分钟。在80%乙醇中第三次洗涤后，再重复乙醇洗涤两次，弃去滤液。将离心柱重新放入接收管中，此次离心两分钟以干燥纤维基质。然后将离心柱转移至1.5毫升收集管中。向每个离心杯内的纤维基质中直接加入 100 微升洗脱缓冲液。然后将收集管盖扣紧到离心杯上，在室温下孵育一分钟。孵育结束后，将样品在最大转速下离心一分钟。接下来，弃去离心杯并盖上管盖。若测量DNA浓度，预期浓度范围为每微升5纳克至500纳克。DNA可在4摄氏度保存长达一个月；如需长期保存，应将DNA置于-20或-80摄氏度。使用P-C-R-R-F-L-P试剂盒中提供的引物和试剂进行PCR。根据随附的书面实验方案，在PCR运行过程中，建议每个样本（包括阳性对照和无模板对照）均设置重复孔。按以下顺序混合组分，分别为DTE E one HAE three和NL three的酶切反应配制限制性内切酶主混合液：1.5微升无菌蒸馏水、0.5微升10×酶缓冲液和0.5微升10×酶。为所有样本以及额外的三份试剂混合液准备足够的反应体系。然后将2.5微升分配至已标记样本和酶名称的各反应管中。PCR完成后，从热循环仪中取出样本并置于冰上。将每种 PCR 产物各 2.5 微升加入该反应对应的三个限制性消化管中：DDE I、HAE III 和 NLA III。随后涡旋振荡。短暂离心后，将消化反应在37摄氏度孵育两小时。若更方便，也可选择过夜孵育。消化完成后，在65摄氏度孵育反应体系15分钟。然后向每个管中加入 1 µL 的 60 mM EDTA 以终止反应，并进行涡旋混匀。使用安捷伦生物分析仪试剂盒，根据试剂盒说明书将限制性消化产物制备并上样至 DNA 芯片的加样孔中。每个样本的三种消化产物应加载在同一张芯片上。然后涡旋混匀芯片，并将其装入仪器中。运行结束后，进入检测上下文，选择芯片汇总选项卡。在样本名称字段中，为芯片的全部12个孔输入样本名称，以标识待测DNA样本的鱼类物种。单击“文件”以启动RFLP解码程序，然后打开XAD文件，此时将弹出打开对话框。现在选择用于 DNA 芯片的 XAD 文件。然后单击打开，查看芯片上加载的样本列表。选择与第一个 DNA 样本对应的三个消化产物。在酶列中，于标注为“min peak height as percent of lower marker”（下标记物峰高的最小百分比）的字段内，注明所使用的限制性内切酶。默认值为10%，可根据需要进行调整。降低该值可识别被遗漏的小峰，提高该值可剔除由电泳图谱中非特异性噪音产生的峰。调整最小峰高值后，单击“重新积分”。然后单击对话框底部的“计算”按钮。生物分析仪运行获得的片段长度数据将自动填充到软件字段中。接下来，在屏幕左上角的评分下拉列表中选择“dice”。如果鱼样品为单一鱼种或混合物，若样品可能为混合物，则屏幕底部标有“综合评分列表”的表格将显示基于全部三种消化反应结果的最佳物种匹配。得分为1的完全匹配结果以绿色高亮显示。近似匹配结果在屏幕顶部以黄色高亮显示。较低的截断值用于指定分析中所用片段的最小长度，而匹配容差值则决定一个片段需与预测片段在长度上接近到何种程度才能被视为匹配。显示的数值为默认设置，可根据需要进行调整。请对尖端上剩余的DNA样品重复上述步骤进行分析。本实验采用本视频所述方法，分离、扩增并消化了来自四种不同鱼类物种的DNA样品。此处使用安捷伦生物分析仪和RFLP解码器展示了一张生物分析仪凝胶图，显示了限制性酶切样本。通过软件分析条带模式来鉴定鱼类样本：第一个样本被准确鉴定为鳟鱼，第二个为金枪鱼，第三个为石首鱼。最后一个样本为特异性鳕鱼。我们刚刚向您展示了如何使用安捷伦的PCR-RFLP方法进行基于DNA的鱼类物种鉴定。在进行此操作时，必须注意避免样品间的交叉污染，因为该方法极为灵敏。以上就是全部内容。现在您已经了解如何快速、简便且准确地鉴定样本中存在的鱼类物种。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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