基于DNA的鱼类物种鉴定方案

鱼类物种鉴定系统是一种简单、快速且准确的基于DNA的方法，用于鉴定给定样本中存在的鱼类物种。鱼类样本经蛋白酶K处理以释放核酸进入溶液。随后使用可结合所有鱼类基因组中特定序列的引物，对鱼类基因组DNA进行分离并进行PCR扩增。

随后，PCR 产物用三种不同的限制性内切酶进行消化，并在 Agilent 2100 生物分析仪上进行分离。通过消化反应产生的片段长度可用于确定鱼类物种，方法是使用限制性片段长度多态性（RFLP）或片段长度多态性模式匹配软件。大家好，我是来自安捷伦科技的 Rachel Formosa。

今天我们将为您展示一种基于 DNA 的鱼类物种鉴定方法。该方法是一种筛查手段，可用于鉴定新鲜、冷冻、绞碎、煮熟、干燥或其他加工样品中所含的鱼类物种，且整个过程可在不到一个工作日内完成。

我们采用此方法来研究海鲜产品的真伪，这对于海鲜产业至关重要，因为品种替换和错误标识可能带来重大的经济、环境和食品安全问题。此外，仅通过肉眼观察和其他传统方法往往难以准确判断鱼类物种。一旦鱼类经过加工处理，DNA检测则能提供更为准确和可靠的结果。

那么，让我们开始吧。将每种生的或煮熟的鱼组织样本各取10至1000毫克，放入1.5毫升的微量离心管中，每种鱼分别处理。加入220微升 freshly prepared proteinase K 溶液，用移液器上下吹打混匀。

将试管在65摄氏度孵育10分钟，随后在14,000 G下离心3至5分钟，以沉淀任何未消化的组织。接下来，小心转移每份上清液150微升至新的1.5毫升离心管中，避免触及底部的未消化物质和顶部的油状物。上清液将用于基因组DNA提取。

开始基因组DNA提取，向每个样品中加入500微升核酸结合缓冲液，使样品总体积达到650微升。涡旋振荡样品直至均匀。

接下来，将每个样品转移至已置于试剂盒提供的两毫升接收管中的DNA结合离心柱内。将管盖紧紧扣在离心柱顶部。在14,000 G下离心样品1分钟，使DNA结合到离心柱基质上。

离心后，取出离心柱，弃去滤液，并将离心柱放回收集管中。加入 500 µL 1× 高盐洗涤缓冲液。盖上管盖，再次离心。

弃去滤液，再次将离心柱放回收集管中。然后加入 500 µL 80% 乙醇。盖上管盖，以 14,000 ×g 离心 1 分钟。

在第三次用80%乙醇洗涤后，再重复乙醇洗涤两次，弃去滤液。将离心杯放回接收管中，此次离心两分钟以干燥纤维基质。现在将离心杯转移至1.5毫升收集管中。

向每个离心杯中的纤维基质内直接加入100微升进化缓冲液。然后将收集管盖扣紧在离心杯上，在室温下孵育一分钟。孵育结束后，以最大速度离心样品一分钟。

接下来，弃去离心杯并盖上管盖。若测量DNA浓度，预期浓度范围为每微升5纳克至500纳克。DNA可在4摄氏度保存长达一个月；如需长期保存，应将DNA置于负20摄氏度或负80摄氏度。

使用P-C-R-R-F-L-P试剂盒中提供的引物和试剂进行PCR。根据随附的书面实验方案，在PCR运行过程中，建议每个样本（包括阳性对照和无模板对照）均设置重复孔。按以下顺序混合各组分，分别为DTE E one HAE three和NL three的酶切反应配制限制性内切酶主混合液：1.5微升无菌蒸馏水、0.5微升10×酶缓冲液和0.5微升10×酶。

为所有样本及额外的三份试剂混合液准备足够的反应体系。然后将2.5 µL分配至已标记样本名称和酶名称的各反应管中。PCR完成后，从PCR仪中取出样本并置于冰上。

将每种 PCR 产物各 2.5 微升分别加入该反应对应的三个限制性消化管中，即 DDE I、HAE III 和 NLA III。随后涡旋混匀。

短暂离心后，将消化反应在37摄氏度孵育两小时。若更方便，也可选择过夜孵育。消化完成后，在65摄氏度孵育反应体系15分钟。

然后向每管中加入 1 µL 的 60 mM EDTA 以终止反应，并涡旋混匀。使用安捷伦生物分析仪试剂盒，根据试剂盒说明书将限制性消化产物制备并上样至 DNA 芯片的加样孔中。每个样本的三种消化产物应加载在同一张芯片上。

然后涡旋混匀芯片，并将其装入仪器中。运行结束后，进入检测上下文，选择芯片汇总选项卡。在样本名称字段中，为芯片的全部12个孔输入样本名称，以标识待测DNA样本的鱼类物种。

单击“文件”以启动RFLP解码程序，然后打开XAD文件，此时将弹出打开对话框。

现在选择用于 DNA 芯片的 XAD 文件。单击“打开”以查看芯片上加载的样本列表。选择与第一个 DNA 样本对应的三个消化产物。

在酶列中，指定在“最小峰高占下标记物的百分比”字段中使用的限制性内切酶。默认值为10%，可根据需要进行调整。该值可降低以识别被遗漏的小峰，或提高以剔除由电泳图谱中非特异性噪音产生的峰。

调整最小峰高值后，单击“重新积分”。然后单击对话框底部的“计算”。生物分析仪运行获得的片段长度数据将自动填充到软件字段中。

接下来，在屏幕左上角的评分下拉列表中选择“dice”。如果鱼样品为单一鱼种或混合物，若样品可能为混合物，则屏幕底部标有“综合评分列表”的表格将显示基于全部三种消化反应结果的最佳物种匹配。

完全匹配且得分为1的结果以绿色高亮显示。接近匹配的结果在屏幕顶部以黄色高亮显示。较低的截断值用于指定分析中所用片段的最小长度，而匹配容差值则决定一个片段需与预测片段在长度上多接近才能被视为匹配。

显示的数值为默认设置，可根据需要进行调整。请对尖端上剩余的DNA样品重复上述步骤进行分析。本实验采用本视频所述方法，分离、扩增并消化了来自四种不同鱼类物种的DNA样品。

此处使用安捷伦生物分析仪和RFLP解码器展示了限制性消化样品的生物分析仪凝胶结果。通过软件分析条带模式来鉴定鱼类样本：第一个样品被准确鉴定为鳟鱼，第二个为金枪鱼，第三个为石首鱼。

最后一个样本为特异性鳕鱼。我们刚刚向您展示了如何使用安捷伦的PCR-RFLP方法进行基于DNA的鱼类物种鉴定。进行此操作时，必须注意避免样品间的交叉污染，因为该方法极为灵敏。

以上就是全部内容。现在您已经掌握了如何快速、简便且准确地鉴定样本中鱼类物种的方法。感谢观看，祝您的实验顺利成功。