Name: 在调节Toll样受体激活Neu1唾液酸酶活动的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学习利用荧光显微镜检测活巨噬细胞表面Neu1唾液酸酶活性变化的方法，研究Toll样受体配体结合诱导的酶活性调控机制，为免疫学和炎症疾病研究提供实时监测手段。

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MRS 部分经费来自加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）、Harry Botterell 神经科学研究基金会、ARC 以及 Garfield Kelly 心血管研究与发展基金。S.R.A. 获得了女王大学研究奖和 Robert J. Wilson 研究生奖学金。P.J. 获得了女王大学研究生奖和 Robert J. Wilson 研究生奖学金。A.G. 和 S.A. 获得了女王大学研究生奖。S.F. 获得了安大略省科技研究生奖学金（OGSST）。A.G. 获得了女王大学 Franklin Bracken 研究生奖学金。S.A. 获得了女王大学 R.S. McLaughlin 研究生奖学金。

1. 复苏冻存的巨噬细胞
<ol>
<li>	从-80°C冰箱中取出冻存细胞前，需准备培养基，使用经无菌过滤的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）和5 μg/mL的支原霉素。支原霉素是一种抗生素溶液，用于我们的研究中清除并预防细胞培养物中的支原体污染。</li>
<li>	对于一管冻存细胞，需在无菌生物安全柜中向25 cm2 的细胞培养瓶中加入4 mL、1 mL的培养基。</li>
<li>	当从-80°C冰箱中取出冻存细胞管时，应在无菌操作台中用手快速温育解冻，约需2-3分钟。</li>
<li>	细胞一旦完全解冻，应立即使用1 mL无菌移液器迅速转移至含有预置培养基的培养瓶中。</li>
<li>	含有细胞的培养瓶应置于37°C、5% CO2 的组织培养孵箱中培养。</li>
<li>	每天使用倒置显微镜观察细胞生长和贴壁情况，直至细胞融合度达到75%至90%。</li>
<li>	在细胞培养孵育期间，将12 mm圆形玻璃盖玻片置于大型玻璃培养皿中，用70%乙醇覆盖，在生物安全柜中消毒1小时；随后将乙醇移除并储存以备再次使用，并将湿润的玻璃片暴露于生物安全柜内经紫外照射的无菌过滤气流中，干燥24小时或直至完全干燥。</li>
</ol>
2. 唾液酸酶检测的细胞接种
<ol>
<li>	铺板前，使用经火焰灭菌的4英寸全弯带齿不锈钢镊子，在无菌条件下将一个单独的无菌圆形玻璃盖玻片小心放入BD Falcon 24孔平底带盖组织培养处理的聚苯乙烯板的一个孔中。对于一个75%融合度的细胞培养瓶，我们通常使用该培养板的12个孔。</li>
<li>	对于贴壁的巨噬细胞，需在无菌操作柜中用5 mL无菌移液管从培养瓶中移除DMEM条件培养基。用1×无菌Tris缓冲盐水（pH 7.4）洗涤贴壁细胞一次，以去除含血清的培养基，然后加入1 mL无钙无镁（CMF）磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4），用量以覆盖细胞为宜。将培养瓶置于37°C培养箱中约10分钟，或直至细胞开始从瓶壁脱落。可轻轻晃动或摇动培养瓶以松动残留的贴壁细胞。</li>
<li>	向培养瓶中悬浮的1 mL细胞悬液加入3 mL DMEM条件培养基。取0.5 mL细胞悬液，无菌转移至含有12 mm圆形玻璃盖玻片的组织培养板孔中。每个盖玻片上大约接种0.5 × 106个细胞。</li>
<li>	将含有细胞的组织培养板置于37°C、5% CO2条件下培养24小时，以使细胞充分贴附于圆形玻璃盖玻片上。</li>
</ol>
3. 唾液酸酶活性检测
1. 制备对照组
<ol>
<li>	在生物安全柜或实验台中放置一张载玻片（磨砂端：一端，1张，25 × 75 × 1 mm），按顺序依次加入以下化合物并混匀：1 μL DAKO + 1 μL 4-MUNANA，最后加入 3 μL pH 7.4 的 Tris 缓冲盐水（TBS）。</li>
<li>	从含有细胞的一个孔中移除培养基后，用4英寸镊子轻轻将圆形玻璃盖玻片移至孔的角落。小心地用镊子取出盖玻片，并将带有细胞的一面朝下放置于载玻片上的混合液中。</li>
<li>	立即取该载玻片置于已设定为紫外滤光片并配备数码相机用于捕获荧光图像的落射荧光显微镜下进行观察。</li>
<li>	先在相差显微镜下聚焦，直至可见细胞，然后切换至荧光模式。分别在1分钟、2分钟和3分钟时拍摄细胞的荧光图像，另拍摄一张相差模式下的细胞图像。</li>
</ol>
2. 制备阳性对照
<ol>
<li>	在另一张显微镜载玻片上按以下顺序点样：1 μL DAKO + 1 μL 4-MUNANA + 2 μL LPS + 1 μL TBS。</li>
<li>	重复上述步骤 3.1.2 至 3.1.4。</li>
</ol>
3. 使用神经氨酸酶抑制剂达菲进行阳性对照实验
<ol>
<li>	在另一张显微镜载玻片上，按以下顺序点样下列化合物：1 μL DAKO + 1 μL 4-MUNANA + 2 μL LPS + 1 μL Tamiflu。</li>
<li>	Tamiflu 浓度预先用 pH 7.4 的 1× Tris 缓冲盐水配制；与圆形玻璃载玻片上的活细胞接触时，各化合物的最终浓度将被稀释 5 倍。</li>
<li>	重复上述步骤 3.1.2 至 3.1.4。</li>
</ol>
4. 抑制50%唾液酸酶活性所需抑制剂浓度（IC50）的测定
<ol>
<li>	为了定量细胞周围荧光强度，使用 ImageJ 1.38x 软件及其用于测量 RGB 的分析插件对图像进行分析。在细胞周围随机选取 50 个点进行荧光读数，并计算总荧光强度的平均值。</li>
<li>	IC50 值通过非线性回归分析获得，以抑制剂浓度的对数值（例如，log ng/mL）作为横坐标，平均荧光强度作为纵坐标作图生成。</li>
</ol>
5. 成功的秘诀
<ol>
<li>	确保培养的细胞无支原体污染。我们通常在培养基中使用Plasmocin来预防此类污染。</li>
<li>	人工神经氨酸酶底物4-MUNANA应新鲜配制。配制好的底物可用于唾液酸酶活性检测，且在一周内有效。</li>
<li>	如果细胞系在细胞表面的受体表达水平较低，可使用较高剂量的配体进行刺激。</li>
<li>	我们还发现，传代超过6次的细胞可能会失去其受体表型。应重新复苏并培养新鲜细胞。</li>
</ol> 
6. 典型结果
请参见附带的 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2142/szewczuk_JoVE_sialidase_assay.pptx">Powerpoint 文件</a> 中包含的唾液酸酶活性检测动画方案及代表性结果。

<ol><li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+desialylation+of+sialyl+alpha-2%2C3-linked+beta-galactosyl+residues+of+TOLL-like+receptor+4+is+essential+for+receptor+activation+and+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling.</a> Cell Signal. 22, 314-324 (2010).</li>
<li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+pathogen+molecule-induced+Toll-like+receptor+activation+and+cell+function+on+Neu1+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase.</a> Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).</li>
<li>Woronowicz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+neurotrophic+factor+activation+of+Trk+tyrosine+kinase+receptors+on+cellular+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase.</a> Glycobiology. 17, 10-24 (2007).</li>
<li>Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+Sialidase+and+Matrix+Metalloproteinase-9+Cross-talk+is+Essential+for+Neurotrophin+Activation+of+Trk+Receptors+and+Cellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling.</a> Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).</li>
<li>Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymoquinone+from+nutraceutical+black+cumin+oil+activates+Neu4+sialidase+in+live+macrophage%2C+dendritic%2C+and+normal+and+type+I+sialidosis+human+fibroblast+cells+via+GPCR+G%CE%B1i+proteins+and+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9.</a> Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).</li>
<li>Seyrantepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Phagocytosis+in+Macrophages+by+Neuraminidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).</li>
</ol>

S.R.A. 和 P.J. 对本研究的贡献相同，同为第一作者。

利用新开发的检测活巨噬细胞中唾液酸酶活性的分析方法2，我们采用该技术以剂量依赖的方式检测了活BMC-2巨噬细胞中配体诱导的唾液酸酶活性，同时也检测了活DC-2.4树突状细胞、HEK-TLR4/MD2、HEK293、SP1乳腺腺癌细胞、人野生型（WT）以及1140F01和WG0544 I型唾液酸沉积症成纤维细胞中的唾液酸酶活性。神经氨酸酶抑制剂如达菲（磷酸奥司他韦）可抑制活BMC-2细胞中百里醌（thymoquinone, TQ）诱导的唾液酸酶活性，其IC50为0.0194 μM，而神经氨酸酶抑制剂DANA（2-脱氧-2,3-脱氢-D-N-乙酰神经氨酸）的IC50为19.17 μM5。我们还报道了其他应用：特异性抗Neu1、Neu2和Neu3抗体对活BMC-2细胞和人THP-1巨噬细胞中TQ诱导的唾液酸酶活性无抑制作用，而抗Neu4抗体则完全阻断该活性。该唾液酸酶活性还可用于检测经TQ处理的来源于野生型（WT）和组织蛋白酶A功能低下小鼠（继发性Neu1缺陷，NeuI KD）的原代骨髓（BM）巨噬细胞中显著的唾液酸酶活性，但在Neu4基因敲除（Neu4 ...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-MUNANA</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation 荧光封片剂</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>达菲（磷酸奥司他韦）</td><td>Hoffmann-La Roche AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

检测neu1唾液酸酶活性在调控toll样受体激活中的作用

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

哺乳动物Toll样受体（TLRs）是一类识别病原体相关分子模式的受体家族。TLRs不仅在感知微生物（例如病毒、细菌和寄生虫）感染中发挥关键作用，还在传染性疾病、炎症性疾病以及可能的自身免疫性疾病的病理生理过程中扮演重要角色。因此，针对传染性疾病的TLR反应强度和持续时间必须受到严格调控。由此可见，了解感受器受体的结构完整性、配体相互作用及其信号转导组分，对于后续的免疫保护至关重要，同时也为通过调控感受器来干预疾病提供了重要机会。尽管TLR感受器的信号通路已被充分表征，但控制感受器与其配体之间相互作用的参数仍不明确。我们最近发现了一种由天然配体激活TLR的全新机制，此前尚未被观察到1,2。该机制表明，配体诱导的TLR激活受到Neu1神经氨酸酶激活的严密调控。我们还报道了Neu1可严格调控神经营养因子受体（如TrkA和TrkB）3，其中涉及Neu1与基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在受体复合物中的相互作用4。神经氨酸酶活性检测最初被用于发现一种新型配体——百里醌，其可通过GPCR Gαi蛋白和MMP-9激活巨噬细胞、树突状细胞和成纤维细胞表面的Neu4神经氨酸酶5。对于TLR受体，我们的数据表明，Neu1神经氨酸酶已与TLR-2、-3和-4受体形成复合物，并在配体结合任一受体后被激活。活化的Neu1神经氨酸酶可水解远离配体结合位点的唾液酸α-2,3连接的β-半乳糖残基，从而消除TLR-4二聚化、MyD88/TLR4复合物招募、NFκB激活及促炎性细胞反应的空间位阻。在一项合作研究中，Neu1神经氨酸酶已被证明可调控巨噬细胞的吞噬作用6。综上所述，神经氨酸酶活性检测为我们深入理解配体诱导受体激活的分子机制提供了强有力的见解。尽管Neu1神经氨酸酶与TLR、Trk受体激活之间的精确关系仍有待进一步阐明，但这一发现代表了一种全新的或开创性的细胞调控通路研究方法。

唾液酸酶检测是一种简便的技术方法，可用于阐明TLR感受器在活体巨噬细胞细胞表面受体水平上识别微生物感染的新型分子机制及其在炎症性疾病中的作用。

检测Neu1唾液酸酶活性在调控TOLL样受体激活中的作用

哺乳动物Toll样受体（TLRs）是一类识别病原体相关分子模式的受体家族。TLRs不仅是……的关键感受器

以下实验的总体目标是评估配体与其特异性受体结合后对细胞新型磷酸酶活性的诱导作用。该目标通过以下步骤实现：首先，在24孔组织培养板中，将细胞接种于直径为12毫米的圆形玻璃盖片上，培养24小时。第二步，将贴附在玻璃盖片上的活细胞直接与预先配制的磷酸酶底物和受体配体混合液接触，该混合液可含有或不含特异性抑制剂，并将其置于显微镜载片上进行后续操作。立即将显微镜载玻片置于荧光显微镜下，以观察并数字采集荧光图像。通过随时间推移获得的结果，可基于倒置荧光显微镜下细胞周围蓝色荧光强度的变化，来显示配体处理的活细胞表面新的一种酶活性的变化。与现有的分光光度分析等方法相比，该技术的主要优势在于试剂用量更少。此外，您还可以在活细胞中观察并捕获sase活性的图像。该方法可用于解答免疫学领域的关键问题，例如研究潜在的新型配体-受体相互作用，以及特定酶或蛋白抑制剂对受体激活的影响。进行该实验操作的是我实验室前博士研究生 Ray Amit 博士和 PT Gath 博士，他们在其研究中应用了此检测方法。在复苏冻存的巨噬细胞之前，使用无菌过滤的 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基），添加 10% 胎牛血清和 5 微克/毫升抗生素嘌呤霉素，配制培养基。然后，每支冻存细胞样品向 25 平方厘米的细胞培养瓶中加入 4 毫升上述培养基，从 -80°C 冰箱中取出冻存细胞管，并在无菌生物安全柜中用手快速温育融化。此过程大约需要两到三分钟。细胞一旦解冻，立即使用一支一毫升无菌移液管将其快速转移至含有条件培养基的细胞培养瓶中。将含有细胞的培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳的组织培养孵箱中，并使用倒置显微镜进行观察。每天检查细胞的生长和贴壁情况，直至在进行SASE实验铺板前数天达到75%至90%的融合度。准备细胞将要铺种的12毫米圆形玻璃盖玻片。在生物安全柜内操作。将载玻片放入一个大的玻璃培养皿中，在100%乙醇中浸泡1小时以进行消毒。1小时后，移除乙醇，将湿润的载玻片置于超净台内经无菌过滤的气流中，并暴露于紫外线下24小时，或直至其完全干燥，方可用于接种细胞。首先，使用火焰灼烧对一把完整的四英寸带齿不锈钢镊子进行灭菌。然后使用镊子小心地将单个无菌圆形玻璃盖玻片放入24孔平底组织培养处理的聚苯乙烯板的每个孔中。使用5毫升无菌移液管，从贴壁巨噬细胞的培养瓶中移除DMEM条件培养基。用1×无菌Tris缓冲盐水（pH 7.4）洗涤细胞一次，以去除含有血清的培养基。接着，加入1 mL pH 7.4的无磷酸钙缓冲盐溶液。将细胞置于37°C培养箱中孵育约10分钟，或直至细胞开始从培养瓶底部脱落。待细胞脱落后，向悬浮细胞中加入3 mL DMEM条件培养基。然后，取0.5毫升含有约50万个细胞的悬液，分别加入24孔板中的每个12毫米圆形玻璃片上，将含有巨噬细胞的组织培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在调节Toll样受体激活Neu1唾液酸酶活动的检测

本视频展示了一种检测巨噬细胞中Toll样受体（TLR）依赖性转录因子核因子κB（NF-κB）和激活蛋白-1（AP-1）活性的实验方法。当TLR识别损伤相关分子模式（DAMPs）后，会启动促炎性信号级联反应，从而激活NF-κB和AP-1。经基因工程改造的报告巨噬细胞在NF-κB和AP-1激活后会分泌胚胎碱性磷酸酶（SEAP），该酶的活性可被检测 通过...

一种用于检测巨噬细胞中 TLR 依赖性 NF-κB/AP-1 转录因子信号通路的实验方法

本视频展示了一种基于报告细胞的检测方法，用于筛选可抑制Toll样受体（TLR）信号通路的潜在生物活性纳米颗粒。该检测方法包括将脂多糖（LPS）与肽-金纳米颗粒杂合物混合后加入报告巨噬细胞中，这些细胞表达报告蛋白——分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）和荧光素酶。通过检测报告信号的变化，评估杂合物对LPS诱导的TLR信号通路的抑制作用。...

一种用于筛选抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒的检测方法

树突状细胞（DCs） 在Toll样受体8（TLR8）识别合成嘌呤类物质R848后，经黑素菌素（nigericin）激活NLRP3炎性小体，进而分泌IL-1β，因此IL-1β可用于检测NLRP3炎性小体的活性。通过细胞内细胞因子染色、免疫印迹和ELISA方法，可准确检测IL-1β的表达水平，从而评估NLRP3炎性小体的启动和激活状态。...

利用人单核细胞来源的树突状细胞中IL-1β检测NLRP3炎性小体的激活与活性测定

我们描述了一种基于高效液相色谱法（HPLC）的方法，用于测定小鼠肝脏和乳汁中的N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸。...

野生型与CMAH基因敲除小鼠肝脏及乳汁样品中唾液酸的测定

Toll样受体（TLR）信号通路在多种人类炎症性疾病的病理生理过程中发挥重要作用，而通过生物活性纳米颗粒调控TLR反应有望在多种炎症状态下产生有益效果。基于THP-1细胞的报告细胞系统为筛选新型TLR信号通路抑制剂提供了一个多功能且可靠的筛选平台。...

筛选吞噬性免疫细胞中抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒

MALT1 调控先天免疫，但其作用机制尚不明确。我们使用选择性 MALT1 副半胱天冬酶抑制剂 MLT-827，揭示了 MALT1 在 Toll 样受体或 C 型凝集素样受体下游的先天免疫信号通路中的作用，证明 MALT1 调控髓系细胞因子的产生，且该作用主要在 C...

MALT1 副半胱天冬酶活性对髓系先天免疫信号通路的调控

本方案为研究人员提供了一种快速、间接的方法，用于检测小鼠巨噬细胞系在响应多种聚合物表面及吸附蛋白层时，TLR依赖性的NF-кB/AP-1转录因子活性，这些表面和蛋白层可模拟生物材料植入物的微环境。...

一种用于在聚合物表面吸附蛋白层上研究Toll样受体介导的NF-κB/AP-1信号通路的巨噬细胞报告细胞检测方法

本方案包含一系列中性粒细胞功能检测方法，可作为筛选手段，用于评估不同信号通路相关的功能。该方案包括细胞活力、纯度、活性氧生成、实时迁移、吞噬作用的初步且简单的评估，以及对中性粒细胞胞外诱捕网的初步分析建议。...

一套用于快速评估中性粒细胞功能的筛选技术

本文介绍了一种独特的综合性方案，可通过唾液酸酶处理，从分离的外周血单个核细胞（PBMCs）制备去唾液酸化的人单核细胞来源树突状细胞（mo-DCs）。此外，还描述了对mo-DCs进行表型和功能特征分析的方法，并评估唾液酸酶处理如何提高mo-DCs成熟水平的实验流程。...

生成具有不同唾液酸化表型的单核细胞来源树突状细胞

本文提出了一种简单的方法，结合代谢寡糖工程、点击化学和扩增显微技术，利用常规显微镜设备即可实现对细胞内唾液酸化N-糖蛋白的高分辨率生物成像。...

利用点击化学与扩展显微技术可视化细胞内唾液酸化修饰

学习利用荧光显微镜检测活巨噬细胞表面Neu1唾液酸酶活性变化的方法，研究Toll样受体配体结合诱导的酶活性调控机制，为免疫学和炎症疾病研究提供实时监测手段。

检测Neu1唾液酸酶活性在调控TOLL样受体激活中的作用

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