在调节Toll样受体激活Neu1唾液酸酶活动的检测

以下实验的总体目标是评估响应配体与其特异性受体结合而诱导的细胞新 1 sase 活性。这是通过首先在 24 孔组织培养板中的 12 毫米圆形载玻片上培养细胞 24 小时来实现的。作为第二步，将粘附在载玻片上的活细胞直接与先前制备的 sase 底物和受体配体混合物接触，在显微镜载玻片上放置或不含有特异性抑制剂。

立即将显微镜载玻片置于荧光显微镜下，以便可视化和数字捕获荧光图像。随着时间的推移，会获得结果。这显示了与配体处理的活细胞相关的细胞表面新一 sase 活性的变化，基于落射荧光显微镜下细胞周围的蓝色荧光强度。

与光谱光度分析等现有方法相比，使用这种技术的主要优点是您使用的试剂更少。您还可以观察和捕获活细胞中 sase 活性的图像。这种方法可用于回答免疫学领域的关键问题，例如研究潜在的新型配体受体相互作用，以及研究特定酶或蛋白质抑制剂对受体激活的影响。

演示该程序的将是 Ray Amit 博士和 Dr.PT Gath，他们是我实验室的前博士生，他们在复活冷冻巨噬细胞之前在他们的研究中使用这种检测方法。使用无菌过滤的 delcos、补充有 10% 胎牛血清的改良 eagles 培养基和每毫升 5 μg 的抗生素纤溶酶制备培养基。然后，将 4 毫升培养基加入 25 平方厘米的细胞培养瓶中，用于每瓶冷冻细胞，从零下 80 摄氏度的冰箱中取出冷冻细胞小瓶，并在无菌生物危害容器罩中用手加热快速解冻。

这大约需要 2 到 3 分钟。细胞解冻后，使用 1 mL 无菌移液器将其快速转移到含有条件培养基的细胞培养瓶中。使用倒置显微镜将装有细胞的培养瓶置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的组织培养箱中。

每天检查细胞的生长和粘附情况，直到它们在接种细胞进行 SASE 测定前几天达到 75% 至 90% 汇合。准备 12 毫米圆形载玻片，细胞将在其中电镀。在生物危害收容柜中。

将载玻片放入一个大的玻璃培养皿中，并在一小时后将 100% 乙醇浸入 1 小时进行消毒。去除酒精，将湿玻片暴露在柜子中的无菌过滤气流中，在 UV 下放置 24 小时或直到它们干燥到可以接种。细胞首先通过火焰对全弯曲的 4 英寸锯齿状不锈钢镊子进行消毒。

然后使用镊子小心地将单个无菌圆形载玻片放入 24 孔平底组织培养处理的聚苯乙烯板的每个孔中。使用 5 ml 无菌移液器，从装有贴壁巨噬细胞的培养瓶中取出 DMEM 条件培养基。用 1 x 无菌 tris 缓冲盐水 pH 7.4 洗涤细胞一次，以去除任何含有血清的培养基。

接下来，加入 1 毫升 pH 值为 7.4 的不含钙培养基的磷酸盐缓冲盐水。将细胞置于 37 摄氏度的培养箱中约 10 分钟，或直到细胞开始在培养瓶中浮出。细胞脱落后，向悬浮细胞中加入 3 mL DMEM 条件培养基。

然后将 0.5 毫升悬浮液和大约 50 万个细胞转移到 24 孔板中的每个 12 毫米圆形载玻片上，将含有巨噬细胞的组织培养板在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳中孵育 24 小时，以使细胞粘附在圆形载玻片上。sase 活性的测定将在三种不同的条件下在三个单独的显微镜上进行。第一张幻灯片上的幻灯片，用作负片。

将对照细胞暴露于封固剂中。ANA 和 tris 缓冲盐水的神经氨酸酶底物，但不是 toll 样受体配体 LPS。在第二张载玻片上，将细胞暴露于由 toll 样受体配体 LPS 和 tris 缓冲盐水构成的封固剂中。

在第三张载玻片上，将细胞暴露于来自 ANA、LPS Tris、缓冲盐水和神经氨酸酶抑制剂 Tamiflu 的封固剂中。我们将仅演示第二次测定的程序，因为这三种测定的不同之处仅在于显微镜载玻片上的化合物混合物。将显微镜载玻片放在实验室工作台上，并按顺序添加以下化合物。

1 微升封固剂，然后是 1 微升，形成 2 微升 LPS，最后是 3 微升 tris 缓冲盐水，pH 值为 7.4。接下来，从含有细胞的 24 孔板的一个孔中取出培养基。下一步是该程序中最困难的一个方面，因为您必须用镊子从组织培养板的孔中取出圆形玻璃盖玻片，而不会用四英寸的镊子将其弄坏。

轻轻地将圆形载玻片提起到孔的角落，然后小心地取出载玻片，并将载玻片细胞朝下放入溶液混合物中。在显微镜载玻片上，立即将显微镜载玻片带到已设置为紫外滤光片并配备数码相机以捕获荧光图像的落射荧光显微镜上。在相差下聚焦显微镜，直到可以看到细胞，然后切换到荧光模式。

在 1 分钟、2 分钟和 3 分钟的荧光模式下采集细胞图像。此外，在相差表示下获取细胞的单个图像。此处显示了 sase 测定实验的结果。

首先，作为阴性对照，活细胞粘附在载玻片上。与封固剂和形成底物的点混合物直接接触，存在 IP sase 活性。底物将被水解以产生游离的 Ethyl lum beone，在添加底物后 2 分钟在 365 纳米激发后，在 450 纳米处发出荧光。

该荧光图像显示细胞周围没有 sase 活性。下一张图片显示了阳性测试 SASE 检测的结果，其中粘附在载玻片上的活细胞与封固剂 4 底物和 TLR 4 配体 LPS 的点混合物直接接触。底物被 sase 酶水解以产生游离的 ethyl lum beone，添加底物和 LPS 后 2 分钟拍摄的荧光图像表明细胞周围具有高水平的 sase 活性。

然而，当活细胞与来自纳米底物 TLR 四个配体 LPS 的封固剂的点混合物以及神经氨酸酶抑制剂直接接触时，根据抑制剂的浓度，达菲 sase 活性大大降低或不再检测到。最后，该图显示了达菲和奥司他韦羧酸盐的 50% 抑制浓度，方法是绘制 sase 活性的降低与试剂浓度对数的关系，测量每组细胞周围的平均荧光。使用 Image J 软件在尝试此过程时，重要的是要记住在开始 Sade 测定前 24 小时在 24 孔组织培养板中的圆形玻璃盖玻片上培养细胞。

此外，在开始检测之前，必须准备好该检测中使用的所有试剂。