アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

この手順の目的は、ロボットプラットフォーム上の自動プロトコルを使用して、組換えのタグ付きタンパク質をハイスループットで精製することです。これは、まず少量の培養物を用いて大腸菌のタンパク質を過剰発現させることによって達成されます。次に、細胞を化学的に溶かしてタンパク質を放出し、タンパク質が磁性ニッケルビーズに結合します。

次に、ビーズを洗浄して、汚染されたタンパク質を除去し、目的のタンパク質の純度を高めます。最後に、タンパク質は磁気ビーズから精製されます。最終的には、BCAアッセイとSDSページ、およびタンパク質の活性を決定するための追加の機能アッセイを通じて、タンパク質の濃度と純度を示す結果を得ることができます。

この技術の主な利点は、最小限の介入で同じ条件下で多数のタンパク質を精製できるようになったことです。これにより、高い再現性を得ることができ、また人為的ミスも最小限に抑えられます。現在、この方法は、タンパク質の活性の変動性が実際には突然変異によるものであり、サンプルの調製の違いによるものではないことを保証するため、特定のタンパク質の多数の点変異体を研究するのに特に有用です。

一晩で細菌培養を準備するには、まず24ウェルプレートに水を入れ、2分間電子レンジで加熱して滅菌します。水を捨て、再度2分間プレートを電子レンジで加熱し、新たに栽培した欠乏誘導性、BL21ロゼッタ2種、細菌コロニーまたは凍結グリセロールストック、グルコースと乳糖予備力の混合物を含む1.5ミリリットルの自動誘導培地を接種する。ポジティブコントロールとネガティブコントロール用にそれぞれ3つのウェルがあり、1つのウェルはミディアムコントロールのみから得られます。コントロール。

細胞を250RPMで18時間、摂氏37度で増殖させます。蓋を取り外し、プレートをロボットプラットフォームに置きます。このプラットフォームには、物体をある位置から別の位置に移動させるためのグリッパーアーム、ピペッティングアーム、および振とうプラットフォーム、磁気ビーズ攪拌機、磁気プラットフォームなど、プレートとトラフのさまざまな位置が含まれています。

96ウェルプレートの場合、100ミリリットルの蒸留水と15マイクロリットルの消泡試薬を使用して、書面によるプロトコルに従って精製手順のための洗浄および希釈緩衝液を調製します。光学密度測定のために一晩培養液を希釈するための溶液を調製します。ファストブレイク試薬リアーゼと酢酸マグネシウムを含む溶解液を調製し、BCAタンパク質アッセイ溶液を調製します。

TF two Bはピペッティングニードルに付着する傾向があるため、それらを洗浄するために6 Molo Guine塩酸塩溶液を準備します。適切なバッファーに適したサイズのトラフまたはプレートを充填し、ロボットプラットフォーム上の事前に割り当てられた位置、つまりプラットフォーム上の位置に配置します。塩酸グアニン廃棄物用の24ウェルプレートを1枚、OD 600および吸光度測定用の透明な96ウェルプレートを2枚、精製タンパク質用の青色の96ウェルプレートを1枚配置します。

1 96ディープウェルプレートを磁気スタンドに置きます。水を使用してマグナヘアニッケル粒子を希釈し、ビーズスターリングユニットに加えます。攪拌機をオンにして、ビーズを懸濁状態に保ちます。

ロボットプラットフォームのスイッチを入れ、ピペッティングニードルを数分間洗い流します。気泡を除去するには、プレートを振とう台に置き、一晩の細胞培養の成長を確認します。10マイクロリットルの培養物を90マイクロリットルの希釈液で希釈し、添加物の間にピペットを洗浄します。

次に、培養物が同様の密度に達したときのOD600で密度を測定します。100マイクロリットルの磁性ニッケルビーズ懸濁液を24ウェルプレートのウェルに移し、各培養物900マイクロリットルをウェルに移し、ステップ間でピペットを洗浄します。次に、100マイクロリットルのファストブレークリアーゼミックスを追加します。

プレートを室温で800 RPMの振とうプラットフォームに30分間置き、細胞を溶解させ、彼のタグ付きタンパク質をビーズに結合させてビーズを洗浄します。それらを、ビーズをウェルの中心から引き離す磁気ロッドを備えたスタンド上の96ウェルプレートに移し、穿轍を廃棄し、6 mo iGuide塩酸塩を使用してピペットチップを洗浄します。次に、500のウェルに24マイクロリットルの洗浄バッファーを追加します。

ウェルプレートを作成し、サンプルを96ウェルプレートに移します。次に、 ?? 下を取り外します。.500マイクロリットルの洗浄バッファーを96マイクロリットルに追加します。

ウェルプレート。プレートをシェーカーに移し、プレートを1分間激しく振る。次に、プレートを磁気スタンドに戻し、洗浄バッファーを取り外します。

最終洗浄後、ビーズに100μLの溶出緩衝液を加え、室温で30分間激しく振とうします。次に、溶出液を新しいプレートに移します。タンパク質サンプルを定量するには、透明な96ウェルプレートのウェルに190マイクロリットルのBCA試薬を添加し、ウェルに10マイクロリットルのタンパク質サンプルを添加します。

サンプルを少なくとも5時間インキュベートし、BSA標準セットで吸光度を測定します。その後、タンパク質は摂氏マイナス80度で保存されます。精製プロトコルには、2つの品質管理段階があります。

最初は細菌の増殖段階で、その後でタンパク質の収量を評価するときです。タンパク質を三重に精製することにより、機能アッセイにおける任意の変動が変異体の表現型によるものであり、実験的変動または精製の失敗によって引き起こされたものではないと決定することができる収率は、典型的には50〜200マイクログラムの範囲であり、機能アッセイには十分すぎるほどである。一度習得すれば、この技術は約3時間しかかからず、プラットフォームのセットアップ、培養のセットアップ、精製されたタンパク質の収集を除けば、他に何もする必要はありません。

この手順に従って、機能アッセイを行うことができます。私たちの場合、これらは、TF 2 Bの突然変異がarポリメラーゼの触媒活性への影響をどのように変化させるかを調査するための一連の転写アッセイになります。