在活体小鼠的血管炎症和血栓形成的异型血小板中性粒细胞被激活的内皮细胞相互作用对实时成像

在这里，我们报告荧光活体显微镜可视化激活的内皮细胞在活体小鼠的血管炎症和血栓形成的异型血小板中性粒细胞相互作用的实验技术。显微技术将是很有价值的研究血管疾病的分子机制和病理生理条件下测试药物制剂。

以下实验的总体目标是可视化血管疾病期间活化内皮上血小板和中性粒细胞之间的典型相互作用。这是通过在活小鼠中进行实时荧光活体显微镜检查来实现的，以可视化提睾肌内的微脉管系统。作为第二步，注入荧光标记的抗体并引发眼球炎症或损伤，以促进直接可视化由此产生的典型血小板中性粒细胞相互作用。

接下来，分析保存的数据以量化细胞的数量及其动态。最终，可以根据实时活体显微镜下输注抗体的荧光信号来评估活化内皮细胞上血小板和中性粒细胞之间的直接典型相互作用。我们的活体显微镜技术可以深入了解血管炎症和血栓形成过程中活化内皮细胞上血小板和中性粒细胞之间的实时相互作用。

该技术还可以应用于其他系统，例如评估癌细胞和血细胞的相互作用。在开始实验之前，打开血管炎症模型的显微镜系统。在 IP 注射麻醉剂前 3 小时进行生长内注射镜像 TNF α。

一旦通过脚趾捏住确认镇静，将 PE 90 管插入小鼠的气管中，以消除任何呼吸困难。接下来，将 PE 10 管插管到左颈静脉中，以输注荧光标记的抗体和其他麻醉剂。然后轻轻拉出并水平插入阴囊皮肤，并在手术区域上使用预热缓冲液。

现在用一个镊子按压下腹部，小心地用另一个镊子拉出睾丸，汽车垂直掌握肌肉，并通过将外周组织固定在托盘上，将肌肉压平在小瓶内显微镜托盘上的玻璃盖玻片上。首先通过先前设置的颈静脉套管注入 DITE 4 88 偶联大鼠、抗小鼠 CD 42 C 和 Alexa 地板 6 47 偶联抗小鼠 GR one 抗体来开始此步骤。然后在显微镜的滤镜组中，标记将要曝光的通道的复选框，并为每个选定的延时拍摄设置曝光时间。

将时间点数设置为 1000 到 1500，间隔为 200 毫秒，总运行时间为 5 分钟。在图像捕获中设置所有参数后，选择"开始"以 60 倍放大倍率和 157 微米 x 118 微米窗口开始捕获。在发炎的 cremaster 场所的上半部分监测进入中性粒细胞的规则和粘附的血小板 5 分钟。

要分析血小板血栓的形成，请转到 Mask 并选择 Create （创建）。然后在主视图中的选框工具下，单击大铅笔图标。使用铅笔为主视图中容器外部的区域着色。

要设置背景蒙版，请转到 mask，单击 copy this plane，然后单击 copy mask。在当前时间点，选择所有时间点，然后单击 确定。要计算背景信号，请转到 statistics（统计数据），然后单击 mask statistics（掩码统计数据）。

然后在图像范围中，单击当前 2D 延时，或蒙版范围中的四个 D 图像，在特征中选择整个蒙版。在 date of capture （捕获日期） 下，选择 elapse time （经过时间）。在 morph geometry （变形几何体） 下，选择 area in pixels （以像素为单位的区域），在 intensity （强度） 下选择 maximum intensity（最大强度）。

现在单击 export。在电子表格程序中打开文本文件，并计算整个录制期间背景信号的平均值。确定背景荧光强度。

正如刚才在 ular 炎症模型中所示，计算血小板血栓期间的背景荧光强度后，转到掩码，单击片段，选择拟合 e 和通道，并在低单击应用和确定时插入背景信号的平均值。然后转到 statistics（统计数据）并单击 mask statistics（掩码统计数据）。现在在图像范围内，单击蒙版范围内的当前 2D 延时或四个 D 图像，在捕获日期下的特征中选择整个蒙版，在变形几何体下选择经过的时间，以像素为单位选择区域，然后在强度下选择一些强度。

然后单击 export。在电子表格程序中打开文本文件并计算血小板血栓的荧光强度。为了分析小动脉血栓形成，首先注入 DITE 4 88 偶联的抗小鼠 CD 42 C ANDOR 6 47 偶联的抗小鼠 GR one 抗体，如刚刚证明的那样。

单击"开始"启动图像捕获过程后，双击容器壁内部 2 到 3 微米的点以发射激光。小动脉内皮细胞的损伤会导致视觉形状变化，这在明场图像中应该很明显，然后是血小板积累。激光损伤 5 分钟后，暂停并取消捕获。

随后以 2， 400 个时间点开始捕获，间隔为 500 毫秒，以记录 20 分钟的贴壁血小板以及滚动和贴壁的中性粒细胞。以与周围炎症模型类似的方式计算血小板血栓期间的背景荧光强度后，转到掩码，单击段，选择 fite 和 channel，并在低单击时插入背景信号的平均值应用和确定。现在在图像范围内，单击蒙版范围内的当前 2D 延时或 40 D 图像，在捕获日期下的特征中选择整个蒙版，在 Morpho 下选择经过的时间，以像素为单位选择区域，然后在强度下选择一些强度。

然后单击 export。在电子表格程序中打开文本文件并计算血小板血栓的荧光强度。要量化滚动和贴壁的中性粒细胞，请播放延时并计算明显翻转的细胞数量。

血小板血栓滚动超过 20 分钟定义为在与血小板血栓相互作用至少两秒钟时中性粒细胞速度降低。贴壁中性粒细胞定义为任何与血小板血栓保持附着至少两分钟的中性粒细胞。在这里，与红色中性粒细胞和绿色血小板相关的荧光信号外观的代表性图像。

在显示眼部炎症期间，箭头显示血管中血流的方向。确定发炎的内皮细胞上滚动和贴壁的中性粒细胞数量分别为每分钟 0.25 个细胞和 18.5 个细胞/5 分钟。数据代表了 4 只野生型小鼠中 30 种不同 Es 的平均值的平均值加上或减去标准误差。

这里，血小板的中位积分荧光信号绘制为时间的函数。结果发现，大多数红色血小板粘附在粘附物上，绿色的蠕动中性粒细胞粘附在发炎的血管壁上，而不是粘附在发炎的血管壁上。现在转向激光诱导的小动脉损伤后的中性粒细胞血小板相互作用。

这些图像显示了一个红色的中性粒细胞，黄色箭头在血小板血栓上滚动表示，绿色箭头表示，第二个中性粒细胞在红色上滚动，白色箭头在小动脉内皮细胞上快速滚动，均在 5 秒的捕获间隔内，此处显示一个红色的中性粒细胞在 15 秒的间隔内滚动并粘附在血小板血栓上。箭头标识滚动和粘附的中性粒细胞，灰色粗箭头表示血流的方向。在这里，血小板的中位积分荧光信号绘制为时间的函数。

在 20 分钟内，滚动和贴壁中性粒细胞的数量分别为 21.5 和 1.6 个细胞。中性粒细胞的初始快速滚动发生在内皮细胞上。一旦中性粒细胞接触到血小板血栓，中性粒细胞在血小板血栓上的滚动速度就以每秒 8.2 微米的幅度变化，这是由果胶和 psgl L 的相互作用介导的。

数据代表平均值加或负，即激光损伤后 5 分钟在 7 只野生型小鼠中 14 种不同血栓的平均值的标准误差。血小板血栓的大小在成像过程中保持相对恒定，中性粒细胞滚动并粘附在血栓上。来自循环血小板的荧光信号可以忽略不计。

与血小板血栓相比，看完这个视频后，你应该对如何用活小鼠设置活体显微镜系统有一个很好的了解，让你能实时看到血小板和中性粒细胞在微血管系统内活化的内皮细胞上的异型相互作用。