通过激光捕获微分路，从小鼠脊髓运动神经细胞体中生成RNA进行转录分析

通过激光捕捉微分，用 Azure B 染色 70% 乙醇的脊髓部分后，从小鼠脊髓运动神经元的细胞体中制备了高质量的总RNA。从 3，000-4，000 个运动神经元中恢复足够的 RNA（+40-60 ng），以便通过 RNA-seq 和 qRT-PCR 进行下游 RNA 分析。

该程序的总体目标是从脊髓运动神经元中回收高质量的 RNA，而不会受到邻近细胞 RNA 的污染。这是通过首先将脊髓恢复、分割和包埋在冷冻包埋介质中并在零下 160 摄氏度下冷冻来实现的。第二步是在零下 20 摄氏度下将绳索冷冻切片到笔膜载玻片上。

接下来，将载玻片用 70% 乙醇洗涤，并用 70% 乙醇中的 Azure B 染色。最后一步是将鉴定出的运动神经元细胞体的激光捕获显微解剖到几烯硫氰酸盐裂解缓冲液中。最终，从混合裂解物中制备总 RNA，并进行测试以揭示突变型动物与野生型动物神经元中一般或特异性 RNA 转录的差异。

激光捕获显微切割允许从脊髓切片中恢复运动神经元细胞体，而不会受到更多 Scalia 和其他细胞类型的污染。有机会制备 RNA 并比较患病动物和正常动物的神经元之间的转录。开发该程序最困难的方面是找到一种染色方法，使我们能够检测脊髓切片中的运动神经元，同时在激光捕获之前和期间保持高水平的 RNA 完整性和提取能力。

我们发现，当将解剖的细胞体直接收集到硫氰酸几丁油裂解缓冲液中时，Azure B 和 70% 乙醇中的染色切片符合这些标准，证明该程序是我们实验室的博士后 ine Van Padia 为了获得最佳结果。确保在安乐死和经心灌注后，先用 RNA 去污溶液清洁所有设备，然后用不含 RNA 的 70% 乙醇清洁小心隔离脊髓。在 RNA 中冲洗脐带 10 秒钟。

游离水洗去任何残留的血液，然后将其放在不含 RNA 的载玻片上，非常轻柔但快速。接下来，使用干净的剃须刀片将脊髓横向分成 9 到 10 块。将工件放置在装满 OCT 的冷冻模具中，并使用干净的针头垂直对齐它们。

将模具放入装有两个甲基丁烷的浅托盘中，并用液氮预冷。为避免 RNA 降解，请将托盘放入液氮浴中。快速冷冻脊髓碎片。

切片前，将 OCT 嵌入式块在零下 80 摄氏度下储存长达六个月。当准备好切片位置时，将 OCT 模块嵌入到冷却的低温恒温器中。制作 20 微米切片，每个切片包含 9 到 10 个脊髓横截面。

将切片放在无 RNA 的笔膜上。两个微米载玻片最初保存在室温下，以确保切片粘附。立即在低温恒温器内的负 20 摄氏度表面上重新冷冻切片。

将玻片保持在零下 80 摄氏度，直到在干净的机架范围内使用。六个 50 毫升锥形管，装满不含 70% 乙醇的 RNA。深度应足以在浸入载玻片时覆盖载玻片上的所有部分。

接下来，将 1%Azure B 解决方案放在同一个机架上。为了尽量减少洗涤或染色期间更换溶液之间的时间，请在样品架前放置三到四块实验室湿巾，以便快速排出多余的溶液。准备好后，将载玻片从零下 80 摄氏度的冰箱中取出，放在干冰上，将一张载玻片放在戴手套的手掌上解冻。

用实验室抹布擦去玻片上的大部分水分和冷凝水，注意不要接触切片。将玻片放在培养皿中的新鲜硅胶干燥剂上 30 至 40 秒，使其完全干燥。干燥后，将载玻片浸入第一管 RNA，游离 70% 乙醇。

将玻片浸泡 30 秒，然后上下浸泡 45 秒至 1 分钟，洗掉 OCT。接下来，从溶液中取出玻片，沥干实验室湿巾上多余的液体。通过将载玻片浸入第二管 70% 乙醇中来重复此过程。

如果 OCT 仍然存在脊髓切片周围，请在第三根管中重复洗涤。排干多余的液体后，将玻片浸入 1%Azure B 溶液中，溶于 70%RNA、游离乙醇中 30 至 45 秒。在实验室擦除上排空多余的 Azure B。

此时，整个幻灯片将为蓝色。将载玻片浸入下一管 70% 乙醇中，快速上下浸泡 3 到 4 次，以去除多余的染料并使特定的运动神经元染色可见。如果切片看起来染色非常暗，请在 70% 乙醇的新管中重复 des 染色步骤。

如果染色看起来太浅，请将载玻片放回 Azure B 溶液中再进行第 32 次染色，然后重复 des 染色。如果染色令人满意，请让玻片短暂风干，然后进行下一步。DES 染色和干燥后，灰质会呈浅蓝色，深蓝色染色的运动神经元将很容易看到。

打开显微镜后立即开始解剖。卸下试管架以连接 0.6 毫米微量离心管的盖子。对于样品采集，将 30 微升 Guine 和硫氰酸盐裂解缓冲液放入瓶盖中，并通过铺展溶液覆盖表面。

使用移液器吸头，将盖子与孔和物镜对齐。在显微镜软件磨损的情况下，将盖子保持在覆盖位置，直到开始激光捕获。将风干的载玻片倒置在显微镜的载物台上，使膜面朝下，并且切片与孔对齐。

载玻片就位后，用 5 倍物镜聚焦在脊髓切片上，然后移动到 20 倍物镜进行解剖。首先，用光笔标记一个虚拟区域，让激光将其切割出来而不收集它。这会松弛膜，并可以连续标记和切割多个区域。

接下来，重新聚焦并识别腹角区域的运动神经元。这些神经元可以通过它们的位置 parmal morphology、大尺寸和 Azure B 的深蓝色染色来识别，使用光笔，选择绘图工具并沿着运动神经元的边缘标记，形成完整的轮廓。尽量使轮廓尽可能靠近运动神经元，以避免受到其他细胞的污染。

切割前可以标记多个细胞，因为软件会在准备切割时记住位置，将盖子放在切割位置下方，然后单击开始按钮以使用激光启动运动神经元解剖。将一张载玻片上所有切片的所有运动神经元收集到一个微型离心管的盖子中。收集完成后，卸下托盘，轻轻移动管，将微量离心管从支架中取出，通过上下移液溶液完全溶解运动神经元和缓冲液。

通过离心将溶液移入管体中，立即将样品冷冻在干冰中，并在用 Azure B 染色后储存在零下 80 摄氏度。它们通过抗 CHATT 抗体、染色得到证实，并且很容易与较小的邻近细胞区分开来。在这个例子中，运动神经元细胞体已经用光笔勾勒出来，并由软件编号。

在这里，细胞体被激光切出并放入收集管中，轮廓关闭。激光对邻近区域的损伤程度是显而易见的。此处显示了 LMD 收集的大约 4， 000 个小鼠运动神经元细胞体样品的 RNA 完整性电泳分析的典型结果。

注意突出的核糖体 RNA 峰。对于一张载玻片上的所有切片，从载玻片染色到运动神经元解剖的这一过程应在 30 分钟内完成，以最大限度地减少 RNA 降解。尝试此程序时，重要的是要记住尽快工作，无论是在脊髓的初始解剖和包埋，还是在运动神经元的染色和激光捕获显微解剖的最后步骤中。