利用激光显微切割技术从小鼠脊髓运动神经元胞体中制备转录组分析用RNA

本实验的总体目标是从脊髓运动神经元中回收高质量的RNA，同时避免邻近细胞RNA的污染。首先将脊髓取出、分割后包埋于冷冻包埋介质中，并在负160摄氏度下冷冻。第二步是在负20摄氏度下将脊髓冷冻切片至带膜载玻片上。

接下来，将切片用70%乙醇洗涤，并用70%乙醇中的Azure B染色。最后一步是将已识别的运动神经元胞体通过激光显微切割技术分离至硫氰酸胍裂解缓冲液中。最终，从合并的裂解液中提取总RNA，并检测突变型与野生型动物神经元中总体或特异性RNA转录的差异。

激光捕获显微切割技术能够从脊髓切片中分离出运动神经元胞体，且不会被数量更多的施卡氏细胞及其他细胞类型所污染，从而有机会制备RNA，并比较来自患病动物与正常动物的神经元之间的转录差异。在建立该实验流程中最困难的部分是找到一种染色方法，该方法既能让我们在脊髓切片中识别运动神经元，又能在激光捕获前后及过程中保持RNA的高度完整性及其可提取性。

我们发现，将切片用Azure B和70%乙醇染色，并结合直接将分离的细胞体收集到硫氰酸胍裂解缓冲液中，可满足这些标准。本方案由本实验室博士后Van Padia建立。为获得最佳结果，在动物安乐死后及经心灌注后，务必使用RNase去污染溶液清洁所有器械，随后再用无RNase的70%乙醇冲洗。小心分离脊髓组织，将脊髓在RNase-free水中冲洗10秒。

用游离水冲洗掉任何残留血液，并将组织轻轻但迅速地放置在无RNAs的载玻片上。接着，使用洁净的刀片将脊髓横向分割成9到10段。将组织段放入盛有OCT的冷冻模具中，并用洁净的针头将其垂直排列整齐。

将模具放入含有液氮预冷的异戊烷的浅盘中。为避免 RNA 降解，将浅盘置于液氮浴中，以快速冷冻脊髓组织块。

将OCT包埋的组织块在负80摄氏度下保存，最长可保存六个月，然后进行切片。准备切片时，将OCT包埋的组织块置于预冷的冷冻切片机中。每片切取20微米厚度，每张切片包含9至10个脊髓横切面。

将切片置于无RNAs的笔膜上。先将2微米厚的切片在室温下放置，以确保切片贴附牢固。随后立即在冷冻切片机内将切片置于-20摄氏度的表面上重新快速冷冻。

将载玻片置于负80摄氏度保存，使用前放置于洁净的载玻片架上。准备六个50毫升的无RNA酶的锥形管，装入70%乙醇。乙醇深度应足以覆盖浸入载玻片时其上所有组织切片。

接下来将1% Azure B溶液置于同一染色架上。为尽量缩短洗涤或染色过程中更换溶液的时间，在染色架前方放置三到四张实验室擦拭纸，以便快速沥去多余的溶液。准备就绪后，将载玻片从-80摄氏度的低温冰箱中取出，放置于干冰上，并通过将其放在戴着手套的手掌上来逐张解冻。

用实验室擦拭纸小心擦去载玻片上的大部分水分和冷凝水，注意不要触碰组织切片。将载玻片置于培养皿中的新鲜硅胶干燥剂上，干燥 30 至 40 秒。干燥后，将载玻片浸入第一个装有无 RNase 的 70% 乙醇的离心管中。

将载玻片浸泡30秒，然后通过在溶液中上下浸洗45秒至1分钟以洗去OCT。接着将载玻片从溶液中取出，用实验室擦拭纸吸去多余液体。重复此过程，将载玻片浸入第二个装有70%乙醇的离心管中。

如果脊髓切片周围仍有 OCT 包埋剂残留，则需在第三个管中重复洗涤步骤。沥干多余液体后，将载玻片浸入含 1% 焦宁 B 溶液的 70% RNAs 溶液中，使用无 RNA 酶的乙醇处理 30 至 45 秒。然后在实验室擦拭纸上沥去多余的焦宁 B 溶液。

此时，整个切片将呈现蓝色。将切片浸入下一个装有70%乙醇的试管中，快速上下移动三到四次，以去除多余的染料，并使特异性的运动神经元染色显现。如果切片染色过深，可在新的70%乙醇试管中重复脱色步骤。

如果染色过浅，可将切片再次放入Azure B溶液中染色32分钟，并重复脱色步骤。若染色效果满意，则让切片短暂空气干燥，随后进行下一步操作。经DES染色并干燥后，灰质呈浅蓝色，深蓝色染色的运动神经元将清晰可见。

打开显微镜后立即开始解剖。卸下离心管架，安装一个0.6毫米微量离心管的管盖。用于样品采集时，将30微升胍硫氰酸裂解缓冲液加入管盖中，并将溶液铺展以覆盖整个表面。

用移液枪头将盖子与孔洞及物镜对齐。使用显微镜软件时，保持盖子处于封闭位置，直至开始激光显微切割。将空气干燥的载玻片倒置放在显微镜载物台上，使膜面朝下，并将切片与孔洞对齐。

将切片放置到位后，先用 5 倍物镜对焦脊髓切片区域，然后切换至 20 倍物镜进行显微切割。首先，使用光笔标记一个虚拟区域，并让激光将其切割但不收集，以松弛膜，从而能够连续标记并切割多个区域。

接下来，重新对焦并识别腹角区域的运动神经元。这些神经元因其位于腹侧角、具有典型的形态、较大的体积以及被亚甲蓝染成深蓝色而易于辨认。使用光笔选择绘图工具，沿运动神经元边缘进行描记，形成完整的轮廓。尽量使轮廓紧贴运动神经元，以避免其他细胞的污染。

可在切割前标记多个细胞，因为软件会记住标记位置，待准备切割时，将帽置于切割位置下方，点击开始按钮即可启动激光分离运动神经元。将所有切片中的运动神经元全部收集到一个载玻片上，并转移至一个微量离心管的管盖中。收集完成后，通过退出托盘小心取出微量离心管，并轻轻取出管子，通过上下吹打溶液使运动神经元和缓冲液完全溶解。

染色后立即将样品在干冰中速冻，然后转移至离心管中离心，使溶液移入管体，之后在负80摄氏度下保存。运动神经元表现为大而深染的细胞体，可通过抗CHATT抗体染色确认，并可轻松与周围较小的邻近细胞区分开来。在此示例中，运动神经元的细胞体已由软件使用光笔勾勒出轮廓并编号。

此处，细胞体已被激光切割并落入收集管中，同时已关闭轮廓显示。激光对邻近区域造成的损伤程度显而易见。图中显示的是通过激光显微切割（LMD）收集的大约4,000个小鼠运动神经元细胞体样本进行RNA完整性电泳分析的典型结果。

注意明显的核糖体 RNA 峰。从切片染色到运动神经元显微切割的整个过程，应在一个载玻片上所有切片的 30 分钟内完成，以尽量减少 RNA 降解。在进行该操作时，必须牢记在脊髓的初始解剖和包埋过程中，以及在运动神经元染色和激光显微切割的最后步骤中，都应尽可能快速操作。