抗核抗体筛选使用Hep-2细胞

以下实验的总体目标是使用间接免疫荧光测定来筛选抗核抗体。这是通过将患者血清与 hep 2 底物玻片一起孵育来实现的。将未结合的患者血清洗掉结合的自身抗体，然后与特异性荧光素标记的偶联物一起孵育，并洗去未结合的试剂。

通过荧光显微镜观察时，自身抗体阳性样品将呈现苹果绿色荧光，对应于自身抗体结合的细胞或细胞核区域，其荧光模式表明存在抗原。最终，arna 的存在可用于帮助诊断结缔组织病。间接免疫荧光方法相对于固相 Eliza 等其他方法的主要优点是 Hep 2 细胞底物包含 100 多种以天然构型表达的抗原。

这允许识别几乎所有临床相关的 O 抗体，这在实面技术中是不可能的，因为间接免疫荧光方法是一种非常专业的技术。刚接触这种方法的人需要时间和练习才能熟练掌握幻灯片处理程序。解释显微镜图像和学习识别相关模式也是一项需要时间掌握的技能。

使用正确的试剂和工具，结果更加一致且更易于解释。演示该程序的是免疫荧光 Asay 开发实验室的技术人员 Cassandra Bryant。从包装中取出试剂，让每件物品达到室温，制备试剂并按照方向稀释患者血清插入片段载玻片带有条形码，可轻松集成到自动化系统中。

此过程说明了手动幻灯片处理。然而，高通量实验室可能会选择具有条形码扫描功能的自动玻片处理设备。Inova 仪器通过集中式智能网络连接，该网络提供对工作流程结果和报告的控制。

对于 IFA。这导致通过处理和消除转录和相关错误来识别阳性患者。将一滴阳性对照和一滴阴性对照分配到适当的玻片上。

孔将 20 至 25 微升稀释的患者血清移液至其余孔中。一次处理一张幻灯片。将玻片放入染色容器中，底部用湿纸巾擦拭，盖上容器并孵育玻片 30 分钟。

潮湿的条件会阻止基材变干，这可能会导致人为染色。在此孵育期内，患者血清中的抗核抗体将与固定在每个孔上的细胞抗原结合。孵育期后，使用温和的洗涤缓冲液流冲洗血清，以避免损坏底物。

稍微调整载玻片的角度，使液流不会直接指向基材。载玻片的这种方向也有助于防止样品在孔之间交叉。拍掉多余的洗涤缓冲液，将玻片放入含有洗涤缓冲液的 Copeland 染色缸中。

洗涤步骤的孵育时间应约为 5 分钟。从洗涤缓冲液中取出载玻片并轻轻敲击。要去除多余的洗涤缓冲液，请在每个孔上滴一滴荧光偶联物。

对于 NA 检测，建议使用 IgG FC 特异性偶联物。将玻片在加湿容器中孵育 30 分钟，并确保更换染色盖。偶联物对光敏感，盖子将保护玻片免受光照。

在此孵育期内，偶联物将与患者与细胞抗原结合的抗核抗体结合。这种偶联物结合导致孵育后孔中存在荧光。用洗涤缓冲液洗涤载玻片。

和以前一样，将盖玻片放在纸巾上，并将封固剂沿连续线涂抹在盖玻片的底部边缘。从洗涤缓冲液中取出每张载玻片，然后轻轻敲击载玻片。要去除多余的洗涤缓冲液，请将载玻片的下边缘接触盖玻片的边缘。

轻轻地将载玻片降低到盖玻片上，使盖玻片上的安装介质流到载玻片的顶部边缘，而不会出现气泡盖滑落，包括最佳数量的安装介质是一种需要实践才能完美观察的技术。使用位于暗室中的荧光显微镜对载玻片进行扫描，应使用 20 x 或 25 x 物镜扫描整个孔。为了评估细胞分布和荧光的均匀性，切换到 40 x 物镜。

要对积极性和模式做出最终解释，请查看阳性和阴性对照。阴性对照可能不会完全变暗，但通常会显示低水平的非特异性荧光。阳性对照将在细胞核中显示明亮的苹果绿色荧光。

阳性可以通过使用从 1 加到 4 加的反应性分级量表进行分级。除了手动解释外，还可以通过自动荧光显微镜加载和扫描载玻片。不需要暗室。

通过选择合适的玻片类型创建项目后，仪器将采集并存储在每个孔中的细胞高分辨率数字图像。此外，Nova 视图可测量荧光强度，并将结果分类为阳性或阴性，并为阳性样品提供模式识别。作员在高分辨率计算机显示器上查看图像，以便对 Nova View 进行最终解释、修订和确认。

可以在确认的结果上生成结果报告。自身抗体结合细胞核内的组成蛋白结构可产生五种主要的核模式，包括均质、斑点着丝粒、核仁和核点。要识别如图所示的均质模式，请识别有丝分裂细胞或分裂细胞。

有丝分裂细胞显示固体均匀的荧光，这通常比静息细胞更明显。静息细胞核应均匀，弥漫染色。这种特征模式很可能是针对双链 DNA 的自身抗体的结果。

斑点模式的一个关键特征是中期有丝分裂细胞的硬币槽外观。这些细胞的染色体区域是阴性的。静息细胞在整个细胞核中显示出斑点图案。

斑点可以定义为粗或细。粗斑是 SM 和 RNP 自身抗体的结果。细小斑点可能是由于针对 S-S-A-S-S-B 以及 RNA 聚合酶的自身抗体造成的。

DFS 模式被称为致密、细斑点，表示 DFS 70 自身抗体。有丝分裂细胞显示斑点染色，而静止细胞在整个细胞核中显示均匀分布的细小斑点。在这些情况下，应进行确认测试，因为 DFS 70 自身抗体在健康个体中普遍存在，而不是结缔组织病患者。

要识别着丝粒模式，请扫描孔并识别有丝分裂细胞或分裂细胞。分裂的细胞有许多彼此密切相关的离散斑点，通常称为中期条。静息细胞显示大约 40 到 60 个离散的斑点分布在整个细胞核中。

着丝粒模式与针对核仁模式的着丝粒蛋白的自身抗体有关。有丝分裂细胞中染色体区域的染色是可变的。核仁模式与细胞核的均质或斑点染色有关，以及静息细胞核的核质的微弱、斑点或均匀染色。

这种模式与针对 RNA 聚合酶、三种原纤维蛋白和 PM SCL 抗体的自身抗体有关。核点模式与负中期、有丝分裂细胞和静息细胞核中的少数离散点有关。这种特征性模式通常是针对 SP 100 PML 或 P 80 colan 的自身抗体的结果。

这些抗体与原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎有关。在所示的图像中，核点图案显示由于线粒体抗原的自身抗体引起的细胞质染色。抗核抗体检测和模式识别是辅助患者诊断的重要工具。

了解各种模式的重要性有助于临床医生和实验室人员进行适当的随访检测。正确识别抗核抗体模式的最重要因素是选择高质量的细胞底物并以始终如一的良好技术处理载玻片。玻片读数传统上是通过在暗室中通过荧光显微镜进行的，并由熟悉细胞周期和细胞形态背景下各种模式的训练有素的技术人员完成。

在过去的几年里，已经开发了用于自动阅读载玻片的数字成像系统，这种仪器实现了工作流程的自动化，并提高了阅读和解释的一致性。此外，通过使用条形码玻片，整个过程中的样本可追溯性消除了潜在的转录错误，提高了数据完整性和患者安全性。观看此视频后，您应该对如何执行间接免疫荧光程序的每个步骤以及如何识别临床相关的抗核抗体模式有很好的了解。