方法调查小RNA和核糖体占用的调控作用恶性疟原虫

人类 microRNA 从宿主红细胞转移到恶性疟原虫寄生虫。这里描述了用于将合成 microRNA 转染到宿主红细胞中并从恶性疟原虫中分离所有 RNA 的技术。 此外，本文将详细介绍一种在恶性疟原虫中分离多核糖体的方法，以确定寄生虫转录物的核糖体占有率和翻译潜力。

该程序的总体目标是研究红细胞 microRNA 在恶性疟原虫转录后基因调控中的作用。这种方法可以帮助回答疟疾领域的关键问题，例如与宿主或寄生虫小 RNA 的 RNA 剪接事件如何影响融合 mRNA 的翻译潜力。该技术的主要优点是能够在一个池中同时捕获总 RNA 和小 RNA，证明一个细胞中存在小 RNA 和融合 RNA。

此外，该程序利用多核糖体分析来显示这些小 RNA 如何影响其融合 mRNA 产物的翻译。首先，在 800 倍 G 的疟疾完全培养基中加入 300 μL 红细胞，转染 5 分钟。用 RPMI 培养基洗涤红细胞两次，以 50% 血细胞比容将细胞重悬于完全细胞混合物中。

接下来，将细胞转移到电穿孔 vete 中，并添加 10 μg DYS 生物素偶联的 micro RNA 或未偶联的阴性对照 micro RNA。要对细胞进行电穿孔，请将 vete 置于电穿孔中并传递单个脉冲。然后按照文本方案中的说明，四小时后接种细胞并用恶性疟原虫感染它们。

然后在微中心管中将 50 微升填充、剥离的 avid 和珠子加入 10 微克寄生虫 RNA 中，并在 4 摄氏度下旋转孵育管 1 小时。将试纸条和珠子以 800 倍 G 离心 30 秒，然后用 500 微升含有 1 至 1000 稀释度的 RNA 抑制剂的 RNP 缓冲液洗涤沉淀。接下来，通过 Resus 洗脱珠子中的 RNA，将它们悬浮在 200 微升 RNA 中。

捕获含有过量生物素的洗脱缓冲液。将珠子在 4 摄氏度下旋转孵育过夜。然后将磁珠以 800 倍 G 离心 30 秒并收集上清液 RNA。

使用过量的生物素洗脱并使用最少量的 strep avid 和磁珠以确保适当的特异性洗脱至关重要。这减少了背景 RNA 富集。最后，如文本方案中所述，通过定量 R-T-P-C-R 确定恶性疟原虫转录物的富集程度和微 RNA 富集，以开始多核糖体分离。

首先将 5 毫升 50% 蔗糖溶液放入超速离心管中。然后小心地将 5 毫升 15% 蔗糖溶液铺在 50% 溶液上。接下来，用 perfil 密封梯度管，并小心地倾斜管，直到它水平躺在工作台上。

确保管子处于稳定位置以防止滚动。将试管保持在此位置至少两个小时，以形成梯度。同时，以 3% 至 5% 的剂量收集大约 100 毫升疟原虫感染血液的异步培养物。

然后加入 10 毫升含有 2 毫摩尔环 heide 的培养基，并在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。接下来，将细胞以 500 倍 G 离心 7 分钟，然后用含有 200 微摩尔环海德复苏的 80 毫升 PBS 洗涤两次。将沉淀悬浮在含有放线菌酮的 PBS 中，并将其置于冰上。

沉淀细胞并去除上清液以估计沉淀体积。然后，将细胞溶出最终体积为 4.25 mL 的裂解液，缓冲并在 4 摄氏度下旋转孵育 10 分钟。先前对多核糖体分析和疟疾致病物种的尝试主要显示单核细胞，因为核细胞裂解导致多核糖体分解成单核细胞区。

在这里，我们利用同时裂解红细胞和寄生虫的裂解缓冲液来保存恶性疟原虫的多核糖体模式，将裂解物转移到微量离心管中，然后在 4 摄氏度下以 16， 000 倍 G 旋转 10 分钟。在单独的预冷 5 毫升超速离心管中，使用带有 27 号针头的注射器加入 1.25 毫升冷的 0.5 摩尔蔗糖垫溶液。小心地将 3.75 毫升裂解物上清液放在蔗糖垫上方。

将样品在 4 摄氏度下以 366， 000 倍 G 离心 146 分钟。在此期间，将蔗糖杀灭的超速离心管缓慢放回垂直位置，并在冰上静置至少 15 分钟。从超速离心机中取出裂解物后，小心地将上清液收集在 15 mL 锥形瓶中。

将上清液储存在零下 80 摄氏度，以保存未被核糖体结合的 RNA 组分。接下来，将核糖体沉淀重悬于 500 μL Resus 悬浮液中，通过移液缓冲 5 分钟以混合将样品在 4 摄氏度下以 16， 000 倍 G 离心 10 分钟。要去除不溶性物质，请小心地去除梯度管上的参数密封，以避免干扰梯度，然后用注射器和 27 号针头将核糖体悬浮液放在顶部。

4 摄氏度下以 200， 000 倍 G 离心试管 180 分钟后，将梯度储存在 4 摄氏度，直到准备好加载到分馏塔上。将空的超速离心管放入梯度分级分离器中，用不含 RNA 的水洗涤系统五分钟。在洗涤过程中，将 UV 吸光度检测器的灵敏度设置为 254 纳米至 0.2。

尽管这可能需要根据信号进行调整。接下来，当水流经检测器时，将基线信号设置为零。清洗除尘器后，反转流经分馏器的流体以清空管路，然后取出空的超速离心管。

通过 FRACTIONATOR 运行 60% 蔗糖溶液，直到它离开针装置。然后将加载的梯度管放在加载室的顶部并拧紧密封。用针刺穿管子的底部。

然后将分馏器的流速重置为 12.5 x 10，并在微量离心管中收集 18 秒的馏分。在第一滴梯度溶液进入微量离心管之前，开始 60% 蔗糖溶液的正向流动以洗脱馏分。开始收集和实时记录 254 纳米信号的吸光度。

当吸收信号在 50% 和 60% 蔗糖溶液的界面处急剧下降时，停止流速和记录。将梯度级分储存在零下 80 摄氏度。然后反转流体流动，直到 60% 溶液从超速离心管中排空。

取出试管并开始分析下一个梯度。用 microRNA 4 5 1 转染红细胞，然后回收生物素化的 micro NA mRNA 杂交体，揭示 PKAR 融合转录本的富集。模拟或无关的 micro RNA 转染未富集 PKAR 转录本。

数据显示了 40 s 和 60 s 核糖体亚基、a DS 核糖体和包含指定数量的核糖体的多核糖体组分的 elucian 峰。核糖体与从红细胞内的 PCI 分离的转录物相关。Northern 血液分析表明，核糖体和多核糖体与 18 S 和 28 SRNA 相关。

除了该程序，还可以进行其他方法，如 R nase H 消化、核糖核酸酶保护测定和 Northern 印迹，以额外验证 microRNA MR 的存在。NA 融合。观看本视频后，您应该对如何将 microRNA 转染到红细胞中，然后用总 RNA 捕获小 RNA（包括嵌合转录本）有很好的了解。您还应该能够回收多核糖体以确定核糖体占有率，从而确定这些融合转录本的翻译潜力。