星爆无长突细胞的膜片钳在Deafferentated小鼠视网膜的平板安装准备

此协议演示了如何从一台安装在准备视网膜神经元进行全细胞膜片钳记录。

该程序的总体目标是在平面安装小鼠视网膜制备中从视网膜内神经元进行全细胞膜片钳记录。这种方法可以帮助回答视网膜神经生物学领域的关键问题，例如神经元的多样性、它们在正常和病理条件下的突触连接。这种技术的主要优点是保留了垂直和横向连接，从而可以研究具有大横向成分的视网膜回路。

一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为视网膜是一种薄而脆弱的组织，必须非常小心和耐心地处理。然而，练习是掌握它的最佳方法。要开始此过程，请在干净的纸巾中滚动鼠标眼球以去除任何血液。

然后，将它们浸入碳化哺乳动物林格溶液中。接下来，用 23 号针在角膜缘上打一个孔，然后用微型剪刀沿着角膜缘切开，将眼球一分为二。然后，使用细镊子去除角膜和晶状体。

对于视网膜整体安装，用细镊子轻轻地将整个视网膜从色素上皮上剥离，然后从边缘向视神经头做四个 1.5 到 2 毫米的正交切口。之后，将打孔的硝酸纤维素膜浸入培养皿中，轻轻地将视网膜拖到上面，GCL 面朝上。然后，在准备全安装视网膜时，将视神经头放入中心孔中。

随后，将带有视网膜的膜转移到另一个干净的培养皿中。用细画笔轻轻地将视网膜弄平为马耳他十字架，然后将所有四个边缘放在孔上。用一张干燥的滤纸吸干硝酸纤维素膜，然后用镊子和油漆刷去除玻璃体和内部限制膜。

在将组件转移到记录室中之前，确保所有视网膜边缘都完全附着在膜上，底部有密封的玻璃盖玻片。用真空润滑脂将膜固定到盖玻片上，并用外部溶液为视网膜再水化。小心不要在组件下方捕获任何气泡。

接下来，将腔室放在正置显微镜的载物台上。用 34 摄氏度的碳化外用溶液以每分钟约 3 毫升的速度填充腔室。首先在 10 倍主观镜头下检查视网膜。

然后，使用 60 倍水浸透镜在 DIC 和落射荧光设置下观察 GCL 和 INL 神经元。为了可视化表达 SAC 的 tdTomato，请将白光 LED 光源与 554 纳米的激发滤光片和 581 纳米的发射滤光片结合使用。在此过程中，通过针式过滤器将内部溶液过滤到定制的回填细丝中。

然后，将细丝插入新拉出的微量移液器中，并在尖端附近分配内部溶液，直到溶液覆盖银电极丝超过 5 毫米。然后，用吸力将微量移液器固定在电极支架上，通过抽吸拉力，可以通过推或拉连接的 10 毫升塑料注射器管的柱塞来调节电极内的压力。接下来，将移液器放在物镜下方，并将其降低到视网膜上方约 100 微米处。

在 Current follower 模式下，使用 DC offset 将稳定的 DC 电压信号归零。当移液器在浴中时，通过移液器注入固定振幅方波电流，测量电流钳模式下的移液器电阻。通过转动 Raccess 旋钮来中和差异，并使用其上的读数来计算移液器阻力。

之后，慢慢将电极置于视网膜上方约 10 微米处。对电极施加正压。然后，观察移液器吸头接近视网膜时的反射变化。

快速但轻柔地将移液器压入 GCL 并立即降低正压。将移液器移向标记的神经元，避免接触其他神经元、血管和 Muller 细胞的末端。如果需要，施加更大的正压，以防止电极堵塞。

接下来，将移液器吸头放在标记的神经元附近，直到看到一个凹坑。然后，释放正压，让质膜反弹回移液器吸头上。对移液器施加 20 至 120 皮安的负电流，以帮助形成千兆级密封。

释放正压后让细胞膜反弹很重要，因为在膜和移液器开口之间自然形成的良好密封对于在记录后保持细胞形态非常重要。如有必要，轻轻吸力将质膜拉入移液器中。密封形成后等待 5 分钟以破坏细胞膜，以便通过超输液清除溢出的内部溶液。

膜破裂后，在电流夹模式下，打开电桥平衡并使用 Raccess 旋钮进行调整。通过将细胞保持在反向电位，在电压钳模式下记录兴奋性和抑制性突触后电流。记录后，轻轻地从 soma 中取出移液器。

将组件从腔室转移到干净的培养皿中。然后，将视网膜分离并重新连接到另一个扁平的硝酸纤维素膜上，无需打孔，以确保固定过程中视网膜的平坦度。组织现在可以进行染色了。

这些图像表明，GCL 和 INL 中的胆碱能细胞都可以通过 tdTomato 荧光可靠地识别，并在 DIC 下靶向全细胞膜片钳记录。它们的膜电位的振荡可以通过电流钳记录来揭示，而抑制性和兴奋性突触电流驱动的振荡是通过在电压钳条件下将细胞分别保持在零毫伏和负 75 毫伏来揭示的。在这里，记录细胞的 hoke 后组织学特征表明 IPL 中典型的 SAC 树突形态和分层水平。

在尝试此过程时，重要的是要记住将视网膜膜组件固定在记录室中，并以紧密而精致的方式补充水分，而不会将气泡捕获在下面，以提供可记录的样本。按照这个程序，可以执行其他方法，如双膜片钳记录，以回答其他问题，如目标多个细胞的振荡是否由相同的突触机制驱动。开发后，这项技术为视网膜神经生物学领域的研究人员探索光感受器退化视网膜中相邻视网膜神经元之间振荡的同步性铺平了道路。

看完这个视频后，你应该对如何去除玻璃体液和准备视网膜平面支架有一个很好的了解，以便从视网膜内部神经元进行有针对性的全尺寸膜片钳记录。