去传入神经小鼠视网膜平铺制备中星形细胞的膜片钳记录

本实验的总体目标是对平铺小鼠视网膜制备物中的内层视网膜神经元进行全细胞膜片钳记录。该方法有助于解答视网膜神经生物学领域中的关键问题，例如神经元的多样性及其在正常和病理条件下的突触连接特性。该技术的主要优势在于能够同时保留视网膜中的纵向和横向连接，从而可对具有显著横向成分的视网膜神经环路进行研究。

通常，初次接触该方法的人会遇到困难，因为视网膜是一种薄而脆弱的组织，必须小心谨慎且耐心地操作。然而，熟练掌握该方法的最佳途径是练习。开始此操作时，将小鼠眼球在洁净的纸巾上轻轻滚动，以去除任何血液。

然后，将眼球浸入通有碳氧混合气体的哺乳动物任氏液中。接着，用23号针头在角膜缘处打孔，并用显微剪沿角膜缘将眼球切成两半。随后，用精细镊子移除角膜和晶状体。

对于视网膜铺片，用精细镊子轻轻将整个视网膜从色素上皮层剥离，并从边缘向视神经乳头方向做四个1.5至2毫米的垂直切口。随后，将打孔的硝酸纤维素膜浸入培养皿中，用镊子轻轻将视网膜（神经节细胞层朝上）拖拽至膜上。然后，在制备视网膜全铺片时，将视神经乳头置于中心孔中。

随后，将带有视网膜的膜转移至另一个干净的培养皿中。用细毛笔轻轻将视网膜展平成马耳他十字形，并将四个边缘均铺在孔上。用一张干燥的滤纸吸去硝酸纤维素膜上的液体，并用镊子和毛笔去除玻璃体和内界膜。

在将组装好的样本转移至底部带有密封玻璃盖玻片的记录槽之前，确保所有视网膜边缘均完全贴附于膜上。使用真空脂将膜固定在盖玻片上，并用胞外液重新水化视网膜。注意避免在组装过程中夹入任何气泡。

接下来，将灌流室置于直立显微镜的载物台上。以每分钟约 3 毫升的速度，向灌流室持续灌注 34 摄氏度的含碳合气外部溶液。首先在 10 倍物镜下观察视网膜。

然后，使用60倍水浸物镜在微分干涉差（DIC）和落射荧光模式下观察GCL和INL神经元。为了观察表达tdTomato的SACs，采用白色LED光源，并结合554纳米的激发滤光片和581纳米的发射滤光片。在此步骤中，通过注射器滤器将内液过滤至定制的后填充毛细管中。

然后，将灯丝插入新拉制的微电极毛细管中，并将内液 dispensing 至尖端附近，直至溶液覆盖银电极丝超过五毫米。随后，将微电极毛细管固定在电极夹持器上，通过连接一个10毫升塑料注射器的吸吮管施加负压或正压，以调节电极内部压力。接下来，在物镜下定位微电极，并将其下降至视网膜上方约100微米处。

在当前的跟随模式下，使用直流偏移将静止的直流电压信号调零。当移液管位于浴液中时，在电流钳模式下通过移液管注入固定幅度的方波电流，以测量移液管电阻。通过调节Raccess旋钮补偿差异，并根据其读数计算移液管电阻。

随后，缓慢将电极移至视网膜上方约10微米处。对电极施加正压。接着，观察当移液管尖端接近视网膜时，其附近反射光的变化。

迅速但轻柔地将移液管推入内核层（GCL），并立即解除正压。将移液管朝向标记的神经元移动，避免接触其他神经元、血管以及Müller细胞的终足。如有需要，可施加额外正压，以防止电极堵塞。

接下来，将移液管尖端移至标记的神经元附近，直至观察到凹陷。然后，释放正压，使质膜回弹至移液管尖端。向移液管施加 20 至 120 皮安的负电流，以促进吉欧姆封接的形成。

在释放正压后，让细胞膜自然回弹非常重要，因为细胞膜与移液管口之间形成良好的密封对于记录后维持细胞形态至关重要。如有必要，可施加轻微的负压，将质膜吸入移液管内。密封形成后需等待五分钟再破裂细胞膜，以允许灌流充分清除溢出的胞内溶液。

在膜破裂后，保持电流钳模式，打开桥式平衡，并使用 Raccess 旋钮进行调节。通过将细胞钳制在反转电位，以电压钳模式记录兴奋性和抑制性突触后电流。记录完成后，轻柔地将移液管从胞体上移开。

将组装结构从孵育腔转移至洁净的培养皿中。随后，将视网膜从原硝酸纤维素膜上分离，并重新贴附于另一张平坦的硝酸纤维素膜上，此过程无需打孔，以确保固定过程中视网膜的平整性。组织现可进行染色。

这些图像表明，通过 tdTomato 荧光可可靠地识别 GCL 和 INL 中的胆碱能细胞，并可在微分干涉差（DIC）显微镜下对其进行全细胞膜片钳记录。通过电流钳记录可揭示其膜电位的振荡特性，而在电压钳条件下，分别将细胞钳制在 0 毫伏和负 75 毫伏时，可揭示由抑制性和兴奋性突触电流驱动的振荡。此处，记录后对细胞进行的组织学表征显示，其具有典型星形无长突细胞（SAC）的树突形态及在内丛状层（IPL）中的分层分布特征。

在进行该操作时，重要的是要记住，需以紧密且精细的方式将视网膜膜组件固定在记录室中，并在再水化过程中避免在膜下截留气泡，以获得可记录的样本。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如双膜片钳记录），以回答更多科学问题，例如目标多个细胞的振荡是否由相同的突触机制驱动。该技术建立后，将为视网膜神经生物学领域的研究人员探索光感受器退变视网膜中邻近视网膜神经元之间振荡的同步性提供新的途径。

观看本视频后，您应能够充分理解如何去除玻璃体并制备视网膜平铺片，以对内层视网膜神经元进行靶向全视野膜片钳记录。