Name: 生活多巴胺能神经元可靠的鉴定中脑培养使用RNA测序和TH-启动子驱动的EGFP表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 了解利用TH启动子驱动的EGFP表达和RNA测序技术可靠鉴定中脑培养中存活多巴胺能神经元的方法。该技术有助于研究帕金森病和药物成瘾领域的基因表达与电生理特性。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（DA017279、AG033954、DA037743）、迈克尔·J·福克斯基金会以及加州理工学院创新计划的资助，后者支持了加州理工学院米勒德和穆里尔·雅各布斯遗传学与基因组学实验室的建设。我们感谢Brian Williams对RNA-Seq文库建库方案的优化及提供的协助。我们感谢Henry Amrhein提供的计算技术培训。我们感谢Barbara J. Wold提供仪器设备和实验室空间。我们感谢Igor Antoshechkin在文库测序及设施管理方面的支持。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在此，我们利用荧光标记从异质性细胞群体中分离单个细胞，随后通过单细胞RNA测序对每个细胞进行分析。我们发现，所收获并测序的所有活体TH-eGFP细胞均确实为多巴胺能神经元，这一结论基于以下三种与多巴胺（DA）相关的基因转录本的存在：TH、DDC 和&#160;slc6a3。所有TH-eGFP阳性细胞均表达这三种基因，RNA-Seq检测结果证实了这一点。该结果与电生理学研究一致，后者显示每个TH-eGFP阳性细胞均表现出与多巴胺能神经元相关的离子通道特征8, 9。在本实验方案中，我们采用了GENSAT酪氨酸羟化酶-eGFP小鼠品系10作为活体多巴胺能神经元的可靠标记。在野生型（WT）培养物中，目前尚无可靠方法仅依据形态学特征来识别活体多巴胺能神经元。尽管我们在识别和记录多巴胺能神经元方面具有丰富经验，但在野生型培养物中，所收获的十个疑似多巴胺能细胞中仅有三个确为多巴胺能神经元。此外，我们还观察到，并非所有TH阴性细胞均为GABA能细胞。我们根据Gad1转录本的存在以及多巴胺相...

帕金森病（Parkinson's Disease, PD）是一种无法治愈的年龄相关性神经退行性疾病。这种相对常见的疾病的病因至今尚未完全明确。该病在全脑范围内出现广泛的神经元丢失，尤其在黑质（Substantia Nigra, SNc）中的多巴胺能神经元发生显著变性，导致临床上出现运动迟缓、肌强直和震颤等典型症状。
包含黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元的原代混合培养物在帕金森病研究中具有重要意义。腹侧被盖区（VTA）的多巴胺能神经元与奖赏及成瘾行为密切相关。腹侧中脑（VM）原代混合胚胎培养物同时含有SNc和VTA多巴胺能（DA）神经元以及GABA能神经元。VM原代培养物可用于神经保护性检测，并有助于阐明多巴胺能神经元的选择性易损性。目前尚无可靠方法仅通过形态学特征来鉴定培养物中的多巴胺能细胞。本文中，我们建立了一套技术，用于鉴定并分离单个多巴胺能神经元，并构建单细胞、高通量RNA测序文库。
我们报告了从间脑培养物中分离的单个多巴胺能神经元和GABA能神经元的代表性RNA转录组数据。该方案可用于神经保护、神经退行性变以及药理学检测，以研究各种处理对多巴胺能/GABA能转录组的影响。由于多巴胺能神经元在原代腹侧中脑（VM）培养物表达的神经元中仅占极小比例，能够在活体培养物中可靠地识别这些神经元，将有助于拓展单细胞研究的范围。这些新技术将推动对细胞水平发生机制的理解，并可能在神经科学和分子生物学其他领域具有应用价值。

<table><tbody><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>沃辛顿生化公司&amp;nbsp;</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Hanks平衡盐溶液（HBSS），1×</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>供体马血清</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>培养基：Neurobasal培养基</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>含有稳定形式L-谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）的培养基：GlutaMAX</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>35050-061</td><td>终浓度为 0.5 mM。</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>17504-044</td><td>50倍浓缩储备液，终浓度为1倍。</td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>L2020</td><td>储存于 -20 &amp;deg;20℃ &amp;micro;L 等分试样</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I (DNase)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>蓝色移液器吸头 P1000</td><td>索伦森生物科学</td><td>&amp;nbsp;有限公司 10130</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 浅层培养皿</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 水浴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C，5% 湿度培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛（PFA）</td><td>电子显微镜科学公司&amp;nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Equitech&amp;nbsp;</td><td>SD-0100HI</td><td>100% 储备液，终浓度 1%。</td></tr><tr><td>标准型手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-14</td><td></td></tr><tr><td>镊子 - 2x3 齿</td><td>Fine Science Tools</td><td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>镊子 - 杜蒙特 #55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>镊子 - 杜蒙特 #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS，pH 7.4</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）1×</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>21 G针头</td><td>BD PrecisionGlide 针头</td><td>305167</td><td>100根针</td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>model P-87</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>&amp;nbsp;MP-285</td><td></td></tr><tr><td>测序试剂盒：SMARTer Ultra Low RNA建库试剂盒（适用于Illumina测序）</td><td>Clontech</td><td>634936</td><td>100 次反应，包含 Advantage2 PCR 试剂盒</td></tr><tr><td>寡核苷酸（12 &amp;micro;M)：SMARTer IIA 寡核苷酸（12 &amp;micro;M</td><td></td><td></td><td>来自 SMARTer 试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>逆转录酶（100单位）</td><td>SMARTcribe 逆转录酶</td><td></td><td>来自 SMARTer 试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>引物1</td><td>3&amp;rsquo; CDSIIa 引物&amp;nbsp;</td><td></td><td>来自 SMARTer 试剂盒</td></tr><tr><td>引物2</td><td>IS PCR 引物</td><td></td><td>来自 SMARTer 试剂盒</td></tr><tr><td>50x 2 聚合酶混合液</td><td>50x Advantage 2 聚合酶混合液</td><td></td><td>来自 SMARTer 试剂盒</td></tr><tr><td>10x PCR缓冲液</td><td>10x Advantage 2 PCR 缓冲液</td><td></td><td>来自 SMARTer 试剂盒</td></tr><tr><td>RNA spike-in</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>PCR冷却架</td><td>IsoFreeze PCR冷却架</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA样本制备试剂盒&amp;nbsp;</td><td>（Illumina/Nextera）Nexter</td><td>FC-121-1030</td><td>24 个样品</td></tr><tr><td>PCR预混液</td><td>Nextera PCR主混合液（NPM）</td><td></td><td>来自 Nextera 试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR引物混合物（PPC）&amp;nbsp;</td><td>Nextera PCR引物混合液（PPC）&amp;nbsp;</td><td></td><td>来自 Nextera 试剂盒</td></tr><tr><td>荧光计</td><td>Qubit ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>HS DNA BioAnalyzer试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>5067-4626</td><td>110 次反应</td></tr><tr><td>电泳系统&amp;nbsp;</td><td>安捷伦 2100 生物分析仪</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>磁珠：Agencourt AMPure&amp;nbsp;</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A63880</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>RNA酶清除湿巾：RNAse Zap湿巾</td><td>Ambion</td><td>AM9786</td><td>尺寸 100 张</td></tr><tr><td>Qubit ds HS 检测试剂盒</td><td>分子探针&amp;nbsp;</td><td>Q32854</td><td>500 次检测</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒：Qiaquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>（Kimax-51，外径 1.5 - 1.8 mm）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige（或同等品牌）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>测序仪</td><td>Illumina HiSeq 仪器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENSAT 酪氨酸羟化酶-eGFP 小鼠品系&amp;nbsp;</td><td></td><td>MMRRC 货号：000292-UNC</td><td>Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat 转基因小鼠种质资源区域研究中心</td></tr></tbody></table>

利用rna测序和th启动子驱动的egfp表达在中脑培养物中可靠鉴定活体多巴胺能神经元

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

在帕金森病（Parkinson's Disease, PD）中，大脑广泛出现神经元丢失，尤其是黑质致密部（SNc）的多巴胺能神经元显著变性，导致运动迟缓、肌强直和震颤。利用荧光标记物在原代腹侧中脑（Ventral Mesencephalic, VM）培养物中识别活的多巴胺能神经元，为研究这些神经元的选择性易损性提供了一种替代方法，而无需依赖固定细胞的免疫染色。本文中，我们分离、解离并培养小鼠VM神经元达3周，随后利用eGFP荧光（由酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase, TH）启动子驱动）在培养物中鉴定多巴胺能神经元。使用玻璃微量移液管将单个神经元收集至微量离心管中。接着对收集的细胞进行裂解，并进行cDNA合成以及转座酶介导的&#34;标签片段化（tagmentation）&#34;，以构建单细胞RNA测序文库1,2,3,4,5。在通过质量控制检测后，对单细胞文库进行测序，并进一步分析以测定基因表达水平。我们报告了从腹侧中脑培养物中分离的单个多巴胺能神经元和GABA能神经元的转录组结果。结果显示，所有被收集并测序的活TH-eGFP细胞均为多巴胺能神经元。这些技术将在神经科学和分子生物学领域具有广泛的应用前景。

本文报道了一种从表达由酪氨酸羟化酶启动子序列驱动的eGFP的小鼠中培养腹侧中脑神经元、从培养物中分离单个荧光神经元，并利用RNA测序（RNA-seq）检测其RNA转录组的实验方案（图1）。数据分析显示，所有经分离并测序的TH-eGFP阳性细胞均为多巴胺能神经元，依据是这些细胞均表达以下三种与多巴胺（DA）相关的基因转录本：TH、多巴脱羧酶（DDC）以及多巴胺转运体DAT（slc6a3）。所有TH-eGFP阳性细胞均通过RNA-Seq检测到这三个基因的表达。在每个单细胞RNA-Seq文库中，可检测到6,000至8,000个蛋白编码基因（图2）。这些多巴胺能神经元除表达多巴胺相关转录本外，还强烈表达多种烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）亚基（表1）。我们观察到，并非所有TH阴性细胞均为GABA能神经元；因此，我们根据RNA-seq检测到Gad1转录本的存在，将细胞定义为GABA能神经元。被定义为GABA能神经元的细胞不表达多巴胺相关转录本，但如前所述，表达GABA合成的关键基因...

在帕金森病（Parkinson's Disease, PD）中，黑质致密部（Substantia Nigra, SNc）的多巴胺能神经元发生退化，导致运动功能障碍。本文报道了一种实验方案：从酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase, TH）启动子驱动eGFP表达的转基因小鼠中分离腹侧中脑神经元进行培养，从培养物中获取单个荧光标记的神经元，并利用RNA测序技术检测其转录组。

利用RNA测序和TH启动子驱动的eGFP表达在中脑培养物中可靠鉴定活体多巴胺能神经元

在帕金森病（Parkinson's Disease, PD）中，大脑广泛出现神经元丢失，黑质致密部（SNc）的多巴胺能神经元退化尤为显著，……

本实验的总体目标是利用酪氨酸羟化酶驱动的eGFP表达，在中脑培养物中可靠地鉴定出活体多巴胺能神经元，并通过单细胞捕获及RNA测序文库构建实现分析。该方法有助于解答帕金森病和药物成瘾研究领域中的关键问题，因为它能够在体外培养中对已鉴定的活体多巴胺能神经元进行基因表达分析和电生理检测。该技术的优势在于，它提供了一种可在原代腹侧中脑培养物中可靠识别活体（而非固定）多巴胺能神经元的方法。本操作的第一部分将由亨利·莱斯特实验室的技术员Charlene Kim进行演示。首先用镊子牢固地夹住小鼠胚胎的吻部以固定其头部，使背部表面暴露可及。然后用另一只手握住的镊子夹住中脑嵴前方的皮肤层和颅骨，在中线处将皮肤和颅骨向尾侧剥离。用镊子夹住脊部，一端置于大脑皮层与中脑之间，另一端置于小脑上方。夹取并移除整个中脑，将中脑放入含有冷HBSS的培养皿中，并置于解剖显微镜下。在解剖显微镜下，将脑组织切片翻转，使腹面朝上以便操作。此时可见四个象限。用镊子轻轻夹住脑膜，向上牵拉，远离脑组织，以去除所有脑膜和血管结构。接下来，将镊子的一侧尖端插入脑室，位置大约位于该节段的中心。然后，通过背侧捏合，再在两侧进行内侧捏合，以分离中脑。通过在两侧进行横向切割，取下下方的两个象限。腹侧被盖区和黑质致密部位于腹侧下部，该区域呈现致密状态。将含有VTA和SNC的已解剖组织置于培养皿的另一区域的新鲜HBSS中。完成所有脑段的解剖后，使用镊子和11号手术刀将每个中脑部分切成大小大致相等的四等份。然后，使用宽口P1000移液器吸头将所有四等分的中脑组织段转移至一个15毫升的锥形管中。待组织沉淀后，吸除HBSS，加入500微升木瓜蛋白酶溶液。在37°C水浴中孵育15分钟。孵育结束后，使用宽口P1000吸头仅将中脑节段转移至含有1毫升DNase I溶液的离心管中，并让节段沉降至管底。随后，仅将中脑节段转移至含有1毫升冷终止溶液的15毫升离心管中。用1毫升新鲜终止溶液替代第二次洗涤液，并使用P1000移液器吸头上下吹打7次，以机械解离细胞。然后用移液器将200微升4% BSA溶液缓慢加入离心管底部，以形成底层。在280 × g条件下离心6分钟后，用P1000移除上清液，并将细胞重悬于1毫升铺板培养基中。使用血细胞计数板进行细胞计数，随后用铺板培养基将细胞悬液稀释至每微升1000个细胞。在吸除层粘连蛋白后，立即将细胞悬液120微升接种到涂有聚-D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白的培养皿中，以确保包被层不会干燥并形成不均匀表面。随后，孵育一小时后，向培养皿中未接种细胞的区域小心加入三毫升培养基，以尽量减少对细胞的扰动。培养三周后，用两毫升无RNase的Dulbecco磷酸盐缓冲液冲洗培养皿。移除 DPBS，然后加入一毫升新鲜 DPBS 用于收获细胞。使用倒置落射荧光显微镜，配备 GFP 滤光片组和 40 倍物镜，鉴定

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

生活多巴胺能神经元可靠的鉴定中脑培养使用RNA测序和TH-启动子驱动的EGFP表达

介绍了一种从E12.5小鼠胚胎中脑制备器官型脑片的方法。这些器官型脑片培养物可用于观察多巴胺能神经元或其他腹侧中脑神经元的行为。...

胚胎腹侧中脑组织切片培养：一种体外研究多巴胺能神经元发育的体系 in vitro

为了评估中脑多巴胺能神经元发育过程中基因的功能及其调控机制，我们描述了一种方法，该方法涉及将质粒DNA构建体进行卵内电穿孔转染至鸡胚中脑腹侧多巴胺能神经元前体细胞中。in ovo...

in ovo 鸡胚中脑电穿孔技术用于研究多巴胺能神经元发育中基因功能

本文介绍了两种已建立的实验方法，用于研究黑腹果蝇（Drosophila）中多巴胺能（DA）神经元随年龄增长而发生的神经退行性变化：攀爬/惊吓诱导的负向趋地性实验，可用于研究DA神经元功能退化的效应；以及酪氨酸羟化酶免疫染色，用于在全脑制片中识别并计数DA神经元。...

评估神经退行性表型 黑腹果蝇 通过攀爬实验和全脑免疫染色检测多巴胺能神经元

多巴胺能神经元在大脑中发挥着重要的调节作用，其丢失与帕金森病相关。在本视频中，我们展示了如何从胚胎小鼠中脑分离培养原代中枢多巴胺能神经元。此类培养体系可用于研究这些神经元对各种应激因素高度敏感的特性。...

小鼠多巴胺能神经元的原代培养

帕金森病期间中脑多巴胺能神经元退化的原因尚未完全明确。细胞培养系统为研究这些神经元的神经生理特性提供了重要工具。本文介绍了一种优化的方案，可用于 体外...

从胚胎啮齿类动物脑组织中分离、培养及长期维持原代中脑多巴胺能神经元

在伏隔核中鉴定多巴胺 D1-α 受体对于阐明中枢神经系统疾病期间 D1 受体功能障碍至关重要。我们采用了一种新型的 RNA 原位 杂交检测方法，以可视化特定脑区中的单个 RNA...

通过一种创新的RNA 原位检测技术鉴定啮齿类动物伏隔核中的多巴胺D1-α受体

已建立一种在培养的黑腹果蝇（Drosophila）脑外植体中重新激活静息态神经干细胞的方法。利用该方法，可在调控神经干细胞静息、进入及退出过程中，将系统性信号与组织内在信号分离开来。...

培养条件下神经干细胞的再激活 果蝇 脑组织外植体

本方案描述了人类中脑多巴胺能神经元的细胞培养，随后进行免疫染色，并通过获取的显微高内涵图像生成神经元表型谱，从而识别由遗传或化学调控引起的表型变化。...

人源干细胞衍生中脑多巴胺能神经元的表型分析

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。...

完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

本研究介绍了一种利用多孔膜插入物分离轴突mRNA的稳健方法，可实现全神经元与神经突起的分离及RNA纯化。结合RTddPCR技术，该方法能够对低拷贝转录本进行绝对定量，以高灵敏度、高重复性和广泛的实验适用性促进mRNA运输和局部翻译的研究。...

使用多孔膜插入物和RTddPCR分离与定量轴突mRNA

了解利用TH启动子驱动的EGFP表达和RNA测序技术可靠鉴定中脑培养中存活多巴胺能神经元的方法。该技术有助于研究帕金森病和药物成瘾领域的基因表达与电生理特性。

利用RNA测序和TH启动子驱动的eGFP表达在中脑培养物中可靠鉴定活体多巴胺能神经元

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