生活多巴胺能神经元可靠的鉴定中脑培养使用RNA测序和TH-启动子驱动的EGFP表达

该程序的总体目标是使用酪氨酸羟基酶驱动的 eGFP 表达、单细胞收获和 RNA 测序文库生成可靠地鉴定中脑培养物中的活多巴胺能神经元。这种方法可以帮助回答帕金森病和药物成瘾领域的关键问题，因为它可以对培养物中已鉴定的活多巴胺能神经元进行基因表达和电生理测定。该技术的优点是它提供了一种在原代腹侧中脑培养物中可靠地识别活的而不是固定的多巴胺能神经元的方法。

演示该程序的第一部分将是 Henry Lester 实验室的技术人员 Charlene Kim。首先用镊子牢牢地放在鼻子上稳定小鼠胚胎的头部，以便可以接触到背表面。使用另一只手握住的镊子捏住中脑脊之前的皮肤层和颅骨，然后沿中线粗略地剥开皮肤和颅骨。

将镊子放在脊周围，一个尖端位于皮层和系膜之间，另一个尖端位于小脑上方。捏住并移除整个中脑。将中脑放在解剖显微镜下用冷 HBSS 培养皿中。

在解剖显微镜下，翻转大脑段，以便现在可以接触到腹侧。现在有四个象限可见。用镊子轻轻抓住脑膜并向上拉离大脑，去除所有脑膜和脉管系统。

接下来，将一把镊子放入大约位于节段中心的心室中。然后要分离中脑，在背侧捏一捏，然后在每侧内侧捏一捏。通过在两侧进行横向切割来获取较低的两个象限。

腹侧被盖区和黑质致密部位于腹下段，看起来很密集。将含有 VTA 和 SNC 的解剖组织放入培养皿的单独区域的新鲜 HBSS 中。解剖所有脑段后，使用镊子和 11 号手术刀将每个中脑切片切成大小大致相等的碎片。

然后，使用大口径 P1000 移液器吸头将所有四分之一的中脑段转移到 15 mL 锥形管中。让组织沉淀并去除 HBSS 后，加入 500 微升木瓜蛋白酶溶液。在 37 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟。

孵育后，使用大口径 P1000 吸头仅将中脑片段转移到 1 毫升等分试样的 DNase I 溶液中，并让这些片段沉降到试管底部。然后，仅将中脑节段转移到含有 1 毫升冷停液的 15 毫升试管中。用 1 毫升新鲜的终止液代替第二次冲洗，并用 P1000 移液器吸头上下移液 7 次以研磨细胞。

然后通过将 200 微升 4% BSA 溶液缓慢移液到试管底部，将细胞悬液铺在下面。以 280 x g 离心 6 分钟后，用 P1000 吸出上清液，并将细胞重悬于 1 mL 铺板培养基中。使用血细胞计数器进行细胞计数，然后用铺板培养基将细胞悬液稀释至每微升 1000 个细胞。

吸出层粘连蛋白后，立即将 120 μL 细胞悬液接种到聚-D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养皿上，以确保涂层不会干燥并形成不平整的表面。然后，孵育 1 小时后，小心地将 3 mL 培养基添加到培养皿的未接种区域，以尽量减少对细胞的破坏。培养三周后，用 2 毫升不含 RNase 的 Dulbecco PBS 冲洗培养皿。

删除 DPBS。然后用 1 毫升新鲜的 DPBS 代替进行收获。在倒置落射荧光显微镜上使用 GFP 滤光片组和 40 倍物镜来识别培养物中的荧光 TH 阳性神经元。

使用显微作器将移液管移到细胞体上。然后使用连接到微量移液器支架侧端口的塑料管轻轻吸力，以便将神经元吸入玻璃微量移液器中。立即从沐浴溶液中取出含有细胞的微量移液器，并将吸头放入含有反应缓冲液的 0.2 毫升 PCR 管集合中。

将尖端靠在靠近底部的管子侧面。然后将无菌 21 号注射器针头放在微量移液器的背面，并施加压力以从微量移液器的破损尖端排出剩余的液体。使用台式微量离心机将收集管离心 5 秒钟，然后在干冰中冷冻。

在 PCR 柜中放置冰上试剂或冷却块时，在室温下制备第一种菌株预混液加上 10% 的额外体积。以及 1 微升 3 引物、1 和 1 微升定量 RNA 加标到样品中。然后将样品在热循环仪中于 72 摄氏度孵育 3 分钟，然后将样品直接放在 PCR 冷却架上。

接下来，将 5.5 μL 制备的预混液添加到 PCR 冷却架中的反应管中，轻轻移液混合。离心试管 5 秒后，在热循环仪中孵育，设置为屏幕上显示的参数。为了纯化第一链 cDNA，向样品中加入 25 μL 涡旋室温磁珠。

通过上下吹打整个体积至少 10 次来混合。然后在室温下孵育 8 分钟，让 cDNA 与磁珠结合。然后将样品和磁珠放在磁分离装置上，直到液体完全透明且上清液中没有珠子。

吸出并丢弃上清液。离心样品 5 秒钟，以收集试管侧面的液体。将样品放在磁分离装置上 30 秒。

然后用 P10 移液器去除所有剩余的上清液，只留下带有结合 DNA 的珠子。加入 50 μL ds-cDNA PCR 预混液，然后运行第二链合成 PCR 程序以获得双链 cDNA。该直方图显示了在 TH-eGFP 阳性细胞生成的单细胞多巴胺能 RNA 测序文库中检测到的蛋白质编码基因的数量，以每百万个映射读数中每 kb 转录本碱基的片段数表示。

在单细胞文库中检测到 6， 000 至 8， 000 个蛋白质基因。一旦掌握了这项技术，可以在 4 到 5 周内完成，包括提取细胞的时间、允许培养细胞的成熟、细胞收获和文库生成步骤、文库的测序和初步分析。在尝试此过程时，重要的是要记住为 RNA 寻找文库生成和细胞收获保持无 RNAse 的工作空间，在整个细胞培养过程中保持无菌技术，并制作具有适当直径的移液器用于单细胞收获。

不要忘记，与多聚甲醛一起工作可能非常危险，应始终采取预防措施，例如使用通风柜、避免皮肤和眼睛接触、远离热源和明火以及穿着适当的个人防护服。按照这个程序，可以执行其他方法，如基因表达和基因网络分析，以回答其他问题，如药物治疗如何影响多巴胺能细胞中的蛋白质表达。