用 BIBAC 二元矢量生成单拷贝插入的转基因植物
March 28th, 2018
使用 pBIBAC 的二进制向量, 可以生成具有完整单拷贝插入的转基因植物, 这是一个简单的过程。在这里, 提出了一系列的协议, 指导读者通过生成转基因拟南芥植物的过程, 并测试植物的完整性和复制数量的插入。
该方法的总体目标是以有效的方式生成携带完整的单拷贝插入转移 DNA 或 T-DNA 的转基因植物。BIBAC-Gateway 载体是一种有价值的工具，用于生成转基因植物，这些植物携带完整的单拷贝插入目标序列，显示出稳定的基因表达。使用 BIBAC-Gateway 载体，可以使用 Gateway 重组技术以最小的工作量插入感兴趣的序列。
所有 BIBAC 衍生物，包括 BIBAC-Gateway 载体，都适用于将大的转基因 DNA 片段转移到植物基因组中。BIBAC-GW 载体可用于将目标序列插入许多植物系统，例如玉米、水稻和番茄。有两种 BIBAC-GW 质粒可用。
BIBAC-RFP-GW 质粒包含一个在种皮中表达的 DsRed 基因。BIBAC-BAR-GW 质粒包含一个对草铵膦产生抗性的基因。两种载体都包含一个卡那霉素抗性基因作为细菌中的选择标记。
要将感兴趣的序列插入二进制向量，请首先准备网关入口和二进制向量，如文本协议中所述。为了进行 Gateway 反应，根据供应商的建议，在室温下在 1.5 mL 微量离心管中制备 LR 复合反应。混合 100 至 300 ng 超螺旋入门克隆和 300 ng BIBAC-Gateway 载体。
用 TE 将混合物的体积调整至 16 微升。最后，加入 4 μL LR Clonase 酶混合物，涡旋混合。将混合物在 25 摄氏度下孵育 1 小时。通过向混合物中加入 2 μL 蛋白酶 K 溶液来终止 LR 反应。
混合并在 37 摄氏度下孵育 10 分钟，然后继续转化为大肠杆菌，如文本实验步骤中所述。为了准备拟南芥植物进行转化，在温室或气候控制的生长室中种植拟南芥植物，直到它们开花。夹住第一个螺栓以允许更多次级螺栓出现。
植物在剪下后四到六天就可以浸泡了，此时植物有许多未成熟的花头，没有很多受精的角果。要进行花浸渍，请将花序浸入农杆菌悬浮液中 5 到 10 秒。使用温和的搅动。
用保鲜膜包裹植物的地上部分以保持高湿度，并用盒子盖住花盆，让植物在黑暗中保持。将植物在温室或生长室中孵育两天。两天后，取下盒子和保鲜膜，在温室或生长室中将植物培养至成熟。
为了提高转化效率，相同的植物可以在第一次浸泡后 7 天重新浸泡。接下来，当转化后的植物成熟干燥时，收获种子。汇集并分析用与单个集合相同的构建体转化的植物种子。
如果用 BIBAC-RFP-Gateway 质粒衍生物转化植物，则通过使用荧光显微镜分析种子来识别转基因植物。为了检测种皮中的 DsRed 表达，请在 560 纳米的激发波长和 600 至 650 纳米的发射波长下对种子进行成像。使用镊子将荧光种子与非荧光种子分开。
为了筛选用 BIBAC-BAR-Gateway 质粒衍生物转化的转基因植物，将种子播种在装满土壤的托盘中。通过将种子悬浮在 0.5x MS 培养基中的 0.1% 琼脂中，并使用 1 毫升移液器铺展种子，确保种子在托盘上均匀分布。通过在 4 摄氏度下孵育种子至少两天来刺激种子以同步方式发芽。
这可以在播种之前或之后完成。播种后 2 周和 3 周，用 0.5% 草铵膦 - 铵溶液喷洒幼苗。每 1 平方米使用 500 毫升草铵膦溶液。
将存活的幼苗转移到花盆中。通过 PCR 分析草铵膦抗性植物是否存在感兴趣的构建体。通过使用限制性内切酶的 DNA 印迹确定 T-DNA 整合的数量及其完整性。
该方法允许鉴定基因组中相同或不同位点的单个和重复整合。使用一系列限制性摘要来识别可能的不同集成模式。选择一种在 T-DNA 中间切割一次的酶，以便能够独立探测限制性位点的上游和下游序列。
此外，选择一种酶或酶组合，一次切掉整个目标序列。注意仅使用对胞嘧啶甲基化不敏感的限制性内切酶。按照文本实验步骤中的详细说明，进行 DNA 印迹分析后，进行印迹分析。
分析取决于所使用的限制策略。当使用在 T-DNA 中间有一个限制性位点的策略分析印迹时，计数检测到的片段数量。在这种策略中，杂交片段的数量表明 T-DNA 整合的数量。
比较用探针检测的 T-DNA 左侧和右侧的片段数量。如果使用两个探针检测到不同数量的杂交片段，则存在反向重复序列中的多个 T-DNA 整合或未完全整合的 T-DNA。为了鉴定 T-DNA 的串联和反向排列，请根据标记条带的大小估计印迹上杂交片段的大小，并将估计的大小与根据限制性策略计算的预期片段大小进行比较。
为了检查感兴趣的转基因序列是否完整，请分析根据策略制备的印迹，限制性位点位于目标序列的末端。根据标记条带的大小估计印迹上杂交片段的大小，并将其与预期大小进行比较。完整的插入会产生具有定义长度的单个片段。
与预期长度的任何偏差都表示集成不完整。显示了用于确定 T-DNA 整合的数量和完整性的 DNA 限制和印迹策略。ScaI 限制性位点将报告基因序列分为使用 bar 探针时检测到的左边界近端部分和使用 eYFP 探针时检测到的右边界近端部分。
BglII 和 PciI 限制性位点位于 T-DNA 内，报告基因构建体之外。双重消化会产生具有确定大小的片段，任何偏差都表明插入不完全。鉴定出的杂交片段数量反映了 T-DNA 插入的数量。
将一个含有 9 个转基因基因 DNA 的印迹与 bar 和 eYFP 探针杂交。几个泳道表示具有单个 T-DNA 整合的转基因。泳道 4 显示两个带条形的片段和一个带 eYFP 的片段，表示 eYFP 序列的截断或右边界周围的反向重复。
泳道 6 显示两个带有 bar 和 eYFP 的片段。一个片段在棒状探针中具有较弱的强度。另一个片段具有高强度，表明两个 T-DNA 插入，其中一个被截短。
观看本视频后，您应该对如何使用 Gateway 重组将目标 DNA 序列整合到 BIBAC-GW 二元载体中，然后进行拟南芥转化、筛选和评估 T-DNA 整合的数量及其完整性有一个很好的了解。生成和表征转基因植物非常耗时。当使用 BIBAC-Gateway 作为二元载体时，可以缩短识别具有完整单拷贝整合的转基因基因的过程。
使用 BIBAC 衍生物生成的转基因中约有一半携带完整的单拷贝整合。通常，个体没有意识到，使用常见二元载体生成的许多转基因植物携带转基因的截短拷贝或显示基因沉默的转基因。使用 BIBAC 衍生物，产生的大多数转基因植物都携带完整的转基因单一整合，很少显示基因沉默。
当使用 BIBAC-GW 生成转基因时，转化足够数量的植物材料很重要，因为 BIBAC 衍生物的整体转化效率低于常用的二元载体。BIBAC-GW 的转化效率一般在 0.2% 到 0.5% 之间在鉴定出携带完整单拷贝 T-DNA 整合的转基因植物后，如果需要，可以进行进一步分析以确定 T-DNA 插入的精确基因组位置。具有完整、单拷贝整合的转基因显示出相似的转基因表达水平。
这表明 T-DNA 在基因组中的整合位置对转基因的表达水平影响不大。
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概述
本文介绍了一种利用BIBAC-Gateway载体生成具有完整单拷贝T-DNA插入的转基因植物的方法。所概述的协议便于高效创建和测试转基因拟南芥植物。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物技术
- 基因工程
- 转基因研究
背景
- BIBAC-Gateway载体允许将大DNA片段插入植物基因组。
- 稳定的基因表达对于转基因植物的功能至关重要。
- Gateway重组技术简化了DNA插入过程。
- 这种方法可以应用于各种植物系统，包括玉米、水稻和番茄。
研究目的
- 提供一种简化的生成转基因植物的方法。
- 确保转基因植物中DNA插入的完整性和拷贝数。
- 提高植物转化技术的效率。
使用的方法
- 利用BIBAC-Gateway二元载体。
- 生成转基因拟南芥植物的协议。
- 评估插入完整性和拷贝数的测试方法。
- 应用Gateway重组技术。
主要结果
- 成功生成具有完整单拷贝插入的转基因植物。
- 转基因系中基因表达的稳定性得到证明。
- 所提供的协议对各种植物物种有效。
- 促进了将大DNA片段插入植物基因组。
结论
- BIBAC-Gateway载体是植物基因工程的强大工具。
- 高效的方法可以显著改善转基因植物的开发。
- 未来应用可能扩展到拟南芥之外的其他植物系统。
常见问题
Executive Industry Relevance
Stable, single-copy transgene integration is critical for reliable trait expression and functional genomics in plant biotechnology pipelines. The BIBAC-GW binary vector system enables efficient generation and identification of transgenic plants with intact, single-copy insertions, reducing gene silencing risk and supporting robust downstream analyses. This capability strengthens early discovery, target validation, and translational research in crop trait development and synthetic biology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of gene function through stable, single-copy transgene expression.
- Reduces confounding effects of multi-copy insertions and gene silencing in functional studies.
- Supports mechanistic de-risking by ensuring integrity and copy number of genetic modifications.
- Facilitates confident target validation in plant systems relevant to trait discovery.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible workflow for generating validated transgenic lines for phenotypic screening.
- Enables quantitative assessment of transgene expression and integration via DNA blotting and PCR.
- Standardizes selection using fluorescence or herbicide resistance markers for efficient screening.
- Prepares robust biological systems for downstream compound or trait evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by ensuring consistent transgene expression across lines.
- Supports continuity from discovery through preclinical trait validation in diverse crop models.
- Reduces late-stage biological risk by minimizing unintended genetic rearrangements.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate traits based on integration quality.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the plant biotechnology pipeline from early discovery through lead identification and preclinical trait validation, supporting both hypothesis-driven and translational research objectives.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling stable gene expression in transgenic plants.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for selection and validation of transgenic events.
- Analytics: Provides robust DNA blotting and PCR-based measurements to assess integration number and integrity.
- Translational Research: Ensures trait continuity and expression stability across plant generations and models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable vector platform adaptable to multiple plant species and trait targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in trait function and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines standardization, reproducibility, and scalability of transgenic plant generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing gene silencing and incomplete integrations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of trait candidates based on integration quality metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant transformation, molecular cloning, and DNA blotting analysis.
- Needs access to growth chambers, fluorescence microscopy, and molecular biology instrumentation.
- Demands cross-team standardization of selection and screening protocols for reproducibility.
- Adaptable to various plant species but transformation efficiency may vary by system.
- Lower transformation efficiency than some binary vectors necessitates sufficient sample throughput.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:00
Inserting Sequences of Interest into BIBAC-GW Binary Vector
2:37
Arabidopsis Transformation
5:37
Characterizing Transgenics for the Number and Integrity of T-DNA Integrations
8:19
Results: Analysis of the Number of T-DNA Insertions in Plants Transformed with BIBAC-Bar-GW Carrying a Reporter Sequence
10:01
Conclusion
