利用BIBAC-GW双元载体产生单拷贝插入的转基因植物

本方法的总体目标是高效地获得携带完整、单拷贝转移DNA（T-DNA）插入片段的转基因植株。BIBAC-Gateway载体是一种有效的工具，可用于获得携带目的序列完整单拷贝插入且基因表达稳定的转基因植株。利用BIBAC-Gateway载体，可通过Gateway重组技术以最小的操作步骤插入目的序列。

所有BIBAC衍生物，包括BIBAC-Gateway载体，均适用于将大型转基因DNA片段转移到植物基因组中。BIBAC-GW载体可用于将目的序列插入多种植物系统，例如玉米、水稻和番茄。目前有两种BIBAC-GW质粒可供使用。

BIBAC-RFP-GW 质粒含有一个在种皮中表达的 DsRed 基因。BIBAC-BAR-GW 质粒含有一个提供对草铵膦抗性的基因。两种载体均含有卡那霉素抗性基因，作为细菌中的筛选标记。

为了将目标序列插入双元载体，首先按照文本方案中所述准备Gateway入门载体和双元载体。进行Gateway反应时，根据供应商的建议，在1.5毫升微量离心管中于室温下配制LR重组反应体系。加入100至300纳克的超螺旋入门克隆质粒和300纳克的BIBAC-Gateway载体。

用TE将混合物体积调至16微升。最后加入4微升LR Clonase酶混合液，涡旋混匀。将混合物在25摄氏度孵育1小时。向混合物中加入2微升蛋白酶K溶液，以终止LR反应。

混合后于37摄氏度孵育10分钟，随后按照文本方案所述进行大肠杆菌（E.coli）转化。为准备拟南芥植株的转化，在温室或气候控制的生长室中培养拟南芥植株，直至其开花。剪除第一轮花序，以促进更多侧生花序的产生。

剪枝后四到六天，当植株具有大量未成熟花序而受精角果较少时，即可进行浸花操作。进行浸花时，将花序浸入农杆菌悬浮液中五到十秒，操作过程中需轻轻震荡。

用保鲜膜包裹植物的地上部分以保持高湿度，并用盒子盖住花盆使植物处于黑暗环境中。在温室或人工气候室中培养植物两天。两天后，移除盒子和保鲜膜，将植物继续在温室或人工气候室中培养至成熟。

为了提高转化效率，可在首次浸染后的第七天对相同的植株再次进行浸染。随后，当转化后的植株成熟并干燥后，收获种子。将用相同载体转化的植株种子合并，并作为一组进行分析。

若植物被转化了BIBAC-RFP-Gateway质粒的衍生物，则通过荧光显微镜分析种子来鉴定转基因植株。为检测种皮中的DsRed表达，以560纳米激发光和600至650纳米发射光对种子进行成像。使用镊子将发出荧光的种子与无荧光的种子分离。

为了筛选经BIBAC-BAR-Gateway质粒衍生物转化的转基因植株，将种子播种于装有土壤的育苗盘中。通过将种子悬浮于0.1%琼脂的0.5×MS培养基中，使用1毫升移液器均匀分散种子，确保种子在育苗盘中分布均匀。将种子在4°C条件下孵育至少两天，以促进其同步萌发。

此步骤可在播种前或播种后进行。播种后两周和三周，用0.5%的草铵膦铵溶液喷洒幼苗。每平方米使用500毫升草铵膦铵溶液。

将存活的幼苗转移至花盆中。通过PCR分析抗草铵膦铵盐的植株，检测目标载体的存在。使用限制性内切酶进行DNA印迹杂交，确定T-DNA插入的拷贝数及其完整性。

该方法可用于鉴定基因组中相同或不同位点的单次及多次整合事件。通过一系列限制性酶切反应，识别可能存在的不同整合模式。选择一种在T-DNA中间区域仅有一个切割位点的限制性内切酶，以便能够独立地对限制性位点上游和下游的序列进行探针检测。

此外，选择一种或多种能够一次性切割出整个目标序列的酶。注意仅使用对胞嘧啶甲基化不敏感的限制性内切酶。按照文本方案中详述的步骤完成DNA印迹后，进行印迹分析。

分析结果取决于所采用的限制性酶切策略。当使用在T-DNA中间有一个限制性酶切位点的策略分析印迹时，需计数检测到的片段数量。在此策略中，杂交片段的数量提示T-DNA插入的拷贝数。

使用T-DNA左侧和右侧的探针检测到的片段数量进行比较。如果两个探针检测到的杂交片段数量不同，则表明存在多个T-DNA以反向重复形式插入，或存在未完全整合的T-DNA。为了鉴定T-DNA的串联和反向排列情况，可根据标记条带的大小估算印迹上杂交片段的大小，并将估算的片段大小与基于限制性酶切策略计算出的预期片段大小进行比较。

为了检测目的转基因序列是否完整，应分析根据在目的序列两端含有限制性酶切位点的策略所制备的印迹膜。根据标记条带的大小估算印迹膜上杂交片段的大小，并与预期大小进行比较。完整的插入将产生一条具有确定长度的单一片段。

任何与预期长度的偏差均表明整合不完全。图中显示了用于确定T-DNA整合数量及完整性的DNA限制性酶切和印迹分析策略。ScaI限制性酶切位点将报告基因序列分为两部分：使用bar探针时可检测到靠近左边界的部分，而使用eYFP探针时可检测到靠近右边界的部分。

BglII 和 PciI 限制性酶切位点位于 T-DNA 内部，但在报告基因构建体之外。双酶切将产生一个具有确定大小的片段，任何大小偏差均表明插入不完全。杂交片段的数量反映了 T-DNA 插入的拷贝数。

一条包含经 ScaI 消化处理的九个转基因植株基因组 DNA 的印迹，分别与 bar 和 eYFP 探针进行杂交。多个泳道显示转基因植株中存在单拷贝 T-DNA 插入。第 4 泳道显示出两个 bar 片段和一个 eYFP 片段，表明 eYFP 序列可能发生截短，或在右边界附近形成反向重复结构。

第六泳道显示了带有bar和eYFP的两个片段。其中一个片段的bar探针信号较弱，另一个片段信号较强，表明存在两个T-DNA插入，其中一个为截短型。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用Gateway重组技术将目标DNA序列插入BIBAC-GW双元载体，随后进行拟南芥转化、筛选，并评估T-DNA插入的拷贝数及其完整性。转基因植株的获得与鉴定过程耗时较长；而采用BIBAC-Gateway作为双元载体，可缩短筛选获得完整单拷贝插入转基因植株的时间。

使用BIBAC衍生物产生的转基因植株中，约有一半携带完整且单拷贝的插入序列。通常情况下，人们并未意识到，利用常见双元载体产生的许多转基因植物携带的是截短的转基因拷贝，或表现出基因沉默现象。而使用BIBAC衍生物时，所产生的大多数转基因植株均携带完整的单拷贝转基因插入，且极少出现基因沉默。

使用BIBAC-GW生成转基因植株时，必须转化足够数量的植物材料，因为BIBAC衍生物的整体转化效率低于常用的双元载体。BIBAC-GW的转化效率通常在0.2%至0.5%之间。在鉴定出携带完整、单拷贝T-DNA整合的转基因植株后，如有需要，可进一步分析以确定T-DNA插入的精确基因组位置。具有完整单拷贝整合的转基因植株，其外源基因的表达水平相当。

这表明T-DNA在基因组中的整合位置对转基因的表达水平影响较小。