Name: 用 BIBAC 二元矢量生成单拷贝插入的转基因植物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学习使用BIBAC-Gateway二元载体系统生成单拷贝插入的转基因植物。该方法利用Gateway重组技术高效转化拟南芥，确保外源基因完整整合与稳定表达，适用于玉米、水稻等多种作物。

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本研究由荷兰技术基金会STW（12385）资助，该基金会是荷兰科学研究组织（NWO）的一部分，并由荷兰经济事务部部分资助（向MS提供的OTP资助编号12385）。&#160;我们感谢美国康奈尔大学的Carol M. Hamilton提供了pCH20质粒，该质粒是BIBAC-GW载体的骨架。

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<li>Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+new+and+established+methods+to+determine+T-DNA+copy+number+and+homozygosity+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants.</a> Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).</li>
<li>Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+PCR+and+Quantitative+PCR+as+Alternative+Methods+to+Southern+Blotting+Analysis+to+Assess+Transgene+Copy+Number+and+Characterize+the+Integration+Site+in+Transgenic+Woody+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Genet%22%5BJournal%5D)">Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants.</a> Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

获得具有单拷贝、完整插入外源基因的转基因植株，关键在于所选用的双元载体。BIBAC系列载体已被用于将目的序列递送至多种植物物种23,24,25,26,27,28。BIBAC载体（包括BIBAC-GW）能够高效地实现单拷贝整合：每株系平均插入拷贝数为1.5至2，而大多数常用双元载体的平均插入拷贝数为3或更高5,9,29。相较于其他BIBAC载体，BIBAC-GW载体的主要改进在于可通过Gateway重组位点便捷地插入目的序列12...

在产生转基因植物时，通常的目标是使整合的外源基因稳定表达。这可以通过外源基因以完整单拷贝形式整合实现。多个拷贝的整合可能提高外源基因的表达水平，但也可能导致基因沉默。当插入序列以串联或反向重复形式排列时，外源基因沉默的可能性更高。1,2,3,4二元载体被用作穿梭载体 农杆菌介导的转化实验将目标序列导入植物基因组。整合到植物基因组中的拷贝数取决于双元载体在 根癌农杆菌5,6. 许多常用的双元载体均为高拷贝载体，因此可产生较高的外源基因平均拷贝数：3.3 至 4.9 拷贝 拟南芥5.
通过使用在A. tumefaciens中拷贝数较低的双元载体（如BIBAC7），或通过从A. tumefaciens染色体上启动T-DNA转移，可降低T-DNA整合的数目5。在这些情况下，外源基因平均整合次数低于25,8,9,10。由于BIBAC衍生物在A. tumefaciens以及Escherichia coli中均为单拷贝，因此能够稳定维持并递送长达150 kb的构建片段11。
GW兼容的BIBAC载体10,12 可通过Gateway克隆技术方便地将目的基因导入载体中。使用Gateway技术不仅极大地简化了克隆流程，还能克服与大分子低拷贝数载体相关的常见问题13,14，例如DNA产量低以及可用于克隆的独特限制性酶切位点有限7,11。pBIBAC-GW衍生物载体有两种类型，分别携带对草铵膦铵盐的抗性（pBIBAC-BAR-GW）或在种皮中表达DsRed荧光（pBIBAC-RFP-GW），用于植物中的筛选（图1）10,12。在这两种载体中，细菌筛选标记均为卡那霉素抗性基因。
pBIBAC-GW 载体结合了以下特点：（1）在遗传操作中易于设计和操作 E. coli，以及（2）完整的单拷贝整合 在植株中 以高效率进行。pBIBAC-GW 载体平均产生 1.7 次整合 拟南芥 约有一半的转基因植株携带单个整合的T-DNA10.
稳定表达外源基因是大多数转基因生物构建的基本要求。通过完整且单拷贝的整合可实现外源基因的稳定表达。然而，在某些情况下，使用携带完整单拷贝整合的转基因植株尤为重要，例如当研究目标涉及基于染色质的过程（如诱变、重组或修复）的效率，以及这些过程对插入位点基因组位置和染色质结构的依赖性时。为了研究寡核苷酸定向诱变（ODM）对局部基因组环境的依赖性，我们构建了一组携带完整单拷贝整合的诱变报告基因的报告株系（图2）10。利用这一系列株系，研究发现尽管外源基因的表达水平较为相似，但整合于不同基因组位点的转基因位点之间，ODM的效率仍存在差异。

<table><tbody><tr><td>硫酸卡那霉素一水合物</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Duchefa</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>利福平</td><td>Duchefa</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>盐酸四环素</td><td>Sigma</td><td>T-3383</td><td></td></tr><tr><td>DB3.1 感受态细胞</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11782-018</td><td>可使用 Invitrogen 的 One Shot &lt;em&gt;ccdB&lt;/em&gt; Survival 2 T1R 感受态细胞 (A10460) 或任何其他具有 ccdB 抗性的 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 菌株代替&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DH10B 感受态细胞</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>18290-015</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase 酶混合液&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>三水合二钠柠檬酸盐</td><td>Merck</td><td>106432</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>二水合乙二胺四乙酸二钠</td><td>Duchefa</td><td>E0511</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Honeywell Fluka</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>一水合 D(+)-葡萄糖</td><td>Merck</td><td>108346</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿，0.1 cm 间隙</td><td>Biorad</td><td>1652089</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪 Gene Pulser</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Calbiochem</td><td>442613</td><td></td></tr><tr><td>90% 一水合 D(+)-麦芽糖</td><td>Acros Organics</td><td>32991</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138454</td><td></td></tr><tr><td>Murashige 和 Skoog 培养基</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>草铵膦铵盐（Basta）</td><td>Bayer</td><td>79391781</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Bio-Rad</td><td>1610433</td><td></td></tr><tr><td>电泳系统</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Merck</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Merck</td><td>100316</td><td></td></tr><tr><td>Hybond N+ 尼龙印迹膜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15358</td><td>或 GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM Chr 印迹纸</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-931</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>乙酰化牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Merck</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 粗颗粒</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17004401</td><td>或 Sephadex G-50 中颗粒 (17004301)</td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠&amp;nbsp;</td><td>US Biological</td><td>S5010</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精子 DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠</td><td>Merck</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>储存式磷屏及暗盒</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>磷成像仪</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Typhoon FLA 7000</td><td></td></tr><tr><td>紫外交联仪</td><td>Stratagene</td><td>Stratalinker 1800</td><td></td></tr><tr><td>保鲜膜（Saran wrap）</td><td>Omnilabo</td><td>1090681</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Merck</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>DNA 标记物 &amp;lsquo;Blauw&amp;rsquo;；DNA ladder</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8070</td><td></td></tr><tr><td>DNA 标记物 &amp;lsquo;Rood&amp;rsquo;；DNA ladder</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8080</td><td></td></tr><tr><td>六核苷酸混合物</td><td>Roche</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>大构建片段试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td></td></tr><tr><td>可热封透明聚乙烯管</td><td>多个供应商</td><td></td><td>管的宽度应大于印迹膜的宽度</td></tr><tr><td>热封仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>膜过滤圆盘</td><td>Merck</td><td>VSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Merck</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>杂交网膜</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2519</td><td></td></tr></tbody></table>

利用bibac-gw双元载体产生单拷贝插入的转基因植物

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

在培育转基因植物时，通常的目标是实现外源基因的稳定表达。这要求外源基因以单拷贝、完整的形式整合到基因组中，因为多拷贝整合常会导致基因沉默。基于细菌人工染色体（pBIBAC-GW）的Gateway兼容型双元载体与其他pBIBAC衍生载体一样，能够高效地实现单拷贝外源基因的插入。相较于原始pBIBAC载体，pBIBAC-GW中已克隆入一个Gateway表达盒，使得目的序列可通过Gateway克隆技术便捷地插入载体的T-DNA区域。通常情况下，使用pBIBAC-GW进行转化的效率为0.2–0.5%，其中约一半的转基因植株含有完整且单拷贝的T-DNA整合。pBIBAC-GW载体提供两种植物筛选标记：抗草铵膦铵盐或种子外壳表达DsRed荧光，同时在细菌中则以卡那霉素抗性作为筛选标记。本文提供一系列实验方案，指导读者完成利用pBIBAC-GW构建转基因植物的全过程：从将目的序列通过重组克隆插入选定的pBIBAC-GW载体，到利用农杆菌（Agrobacterium）进行植物转化、转基因植株的筛选，以及通过DNA印迹杂交检测插入片段的完整性与拷贝数。文中特别关注如何设计DNA印迹杂交策略，以区分单一位点或多位点上的单拷贝与多拷贝整合事件。

利用BIBAC-GW系统，构建了用于研究植物中ODM的报告基因载体10。这些载体首先在Gateway入门载体pENTR-gm12中进行设计，然后通过Gateway LR重组反应插入到pBIBAC-BAR-GW中（图1）。
利用 pDM19（一种带有 mTurquoise-eYFP 报告基因的 BIBAC-BAR-GW 质粒，其 eYFP 阅读框第 120 位含有翻译终止密码子，即 mTurquoise2-eYFP*40）对拟南芥（Arabidopsis）进行遗传转化（图 2）10。共对 126 株拟南芥植株进行了转化（每盆 9 株，共 14 盆）。将这些植株的种子混合后播种于...

使用pBIBAC-GW双元载体可轻松实现具有完整单拷贝插入的转基因植物的构建。本文提供了一系列实验方案，指导读者完成转基因拟南芥植株的构建过程，并对插入片段的完整性及拷贝数进行检测。

利用BIBAC-GW双元载体产生单拷贝插入的转基因植物

在培育转基因植物时，通常的目标是实现外源基因的稳定表达。这需要外源基因以单拷贝、完整的形式整合到基因组中。

本方法的总体目标是高效地获得携带完整、单拷贝转移DNA（T-DNA）插入片段的转基因植株。BIBAC-Gateway载体是一种有效的工具，可用于获得携带目的序列完整单拷贝插入且基因表达稳定的转基因植株。利用BIBAC-Gateway载体，可通过Gateway重组技术以最小的操作步骤插入目的序列。所有BIBAC衍生物，包括BIBAC-Gateway载体，均适用于将大型转基因DNA片段转移到植物基因组中。BIBAC-GW载体可用于将目的序列插入多种植物系统，例如玉米、水稻和番茄。目前有两种BIBAC-GW质粒可供使用。BIBAC-RFP-GW 质粒含有一个在种皮中表达的 DsRed 基因。BIBAC-BAR-GW 质粒含有一个提供对草铵膦抗性的基因。两种载体均含有卡那霉素抗性基因，作为细菌中的筛选标记。为了将目标序列插入双元载体，首先按照文本方案中所述准备Gateway入门载体和双元载体。进行Gateway反应时，根据供应商的建议，在1.5毫升微量离心管中于室温下配制LR重组反应体系。加入100至300纳克的超螺旋入门克隆质粒和300纳克的BIBAC-Gateway载体。用TE将混合物体积调至16微升。最后加入4微升LR Clonase酶混合液，涡旋混匀。将混合物在25摄氏度孵育1小时。向混合物中加入2微升蛋白酶K溶液，以终止LR反应。混合后于37摄氏度孵育10分钟，随后按照文本方案所述进行大肠杆菌（E.coli）转化。为准备拟南芥植株的转化，在温室或气候控制的生长室中培养拟南芥植株，直至其开花。剪除第一轮花序，以促进更多侧生花序的产生。剪枝后四到六天，当植株具有大量未成熟花序而受精角果较少时，即可进行浸花操作。进行浸花时，将花序浸入农杆菌悬浮液中五到十秒，操作过程中需轻轻震荡。用保鲜膜包裹植物的地上部分以保持高湿度，并用盒子盖住花盆使植物处于黑暗环境中。在温室或人工气候室中培养植物两天。两天后，移除盒子和保鲜膜，将植物继续在温室或人工气候室中培养至成熟。为了提高转化效率，可在首次浸染后的第七天对相同的植株再次进行浸染。随后，当转化后的植株成熟并干燥后，收获种子。将用相同载体转化的植株种子合并，并作为一组进行分析。若植物被转化了BIBAC-RFP-Gateway质粒的衍生物，则通过荧光显微镜分析种子来鉴定转基因植株。为检测种皮中的DsRed表达，以560纳米激发光和600至650纳米发射光对种子进行成像。使用镊子将发出荧光的种子与无荧光的种子分离。为了筛选经BIBAC-BAR-Gateway质粒衍生物转化的转基因植株，将种子播种于装有土壤的育苗盘中。通过将种子悬浮于0.1%琼脂的0.5×MS培养基中，使用1毫升移液器均匀分散种子，确保种子在育苗盘中分布均匀。将种子在4°C条件下孵育至少两天，以促进其同步萌发。此步骤可在播种前或播种后进行。播种后两周和三周，用0.5%的草铵膦铵溶液喷洒幼苗。每平方米使用500毫升草铵膦铵溶液。将存活的幼苗转移至花盆中。通过PCR分析抗草铵膦铵盐的植株，检测目标载体的存在。使用限制性内切酶进行DNA印迹杂交，确定T-DNA插入的拷贝数及其完整性。该方法可用于鉴定基因组中相同或不同位点的单次及多次整合事件。通过一系列限制性酶切反应，识别可能存在的不同整合模式。选择一种在T-DNA中间区域仅有一个切割位点的限制性内切酶，以便能够独立地对限制性位点上游和下游的序列进行探针检测。此外，选择一种或多种能够一次性切割出整个目标序列的酶。注意仅使用对胞嘧啶甲基化不敏感的限制性内切酶。按照文本方案中详述的步骤完成DNA印迹后，进行印迹分析。分析结果取决于所采用的限制性酶切策略。当使用在T-DNA中间有一个限制性酶切位点的策略分析印迹时，需计数检测到的片段数量。在此策略中，杂交片段的数量提示T-DNA插入的拷贝数。使用T-DNA左侧和右侧的探针检测到的片段数量进行比较。如果两个探针检测到的杂交片段数量不同，则表明存在多个T-DNA以反向重复形式插入，或存在未完全整合的T-DNA。为了鉴定T-DNA的串联和反向排列情况，可根据标记条带的大小估算印迹上杂交片段的大小，并将估算的片段大小与基于限制性酶切策略计算出的预期片段大小进行比较。为了检测目的转基因序列是否完整，应分析根据在目的序列两端含有限制性酶切位点的策略所制备的印迹膜。根据标记条带的大小估算印迹膜上杂交片段的大小，并与预期大小进行比较。完整的插入将产生一条具有确定长度的单一片段。任何与预期长度的偏差均表明整合不完全。图中显示了用于确定T-DNA整合数量及完整性的DNA限制性酶切和印迹分析策略。ScaI限制性酶切位点将报告基因序列分为两部分：使用bar探针时可检测到靠近左边界的部分，而使用eYFP探针时可检测到靠近右边界的部分。BglII 和 PciI 限制性酶切位点位于 T-DNA 内部，但在报告基因构建体之外。双酶切将产生一个具有确定大小的片段，任何大小偏差均表明插入不完全。杂交片段的数量反映了 T-DNA 插入的拷贝数。一条包含经 ScaI 消化处理的九个转基因植株基因组 DNA 的印迹，分别与 bar 和 eYFP 探针进行杂交。多个泳道显示转基因植株中存在单拷贝 T-DNA 插入。第 4 泳道显示出两个 bar 片段和一个 eYFP 片段，表明 eYFP 序列可能发生截短，或在右边界附近形成反向重复结构。第六泳道显示了带有bar和eYFP的两个片段。其中一个片段的bar探针信号较弱，另一个片段信号较强，表明存在两个T-DNA插入，其中一个为截短型。观看本视频后，您应能充分理解如何利用Gateway重组技术将目标DNA序列插入BIBAC-GW双元载体，随后进行拟南芥转化、筛选，并评估T-DNA插入的拷贝数及其完整性。转基因植株的获得与鉴定过程耗时较长；而采用BIBAC-Gateway作为双元载体，可缩短筛选获得完整单拷贝插入转基因植株的时间。使用BIBAC衍生物产生的转基因植株中，约有一半携带完整且单拷贝的插入序列。通常情况下，人们并未意识到，利用常见双元载体产生的许多转基因植物携带的是截短的转基因拷贝，或表现出基因沉默现象。而使用BIBAC衍生物时，所产生的大多数转基因植株均携带完整的单拷贝转基因插入，且极少出现基因沉默。使用BIBAC-GW生成转基因植株时，必须转化足够数量的植物材料，因为BIBAC衍生物的整体转化效率低于常用的双元载体。BIBAC-GW的转化效率通常在0.2%至0.5%之间。在鉴定出携带完整、单拷贝T-DNA整合的转基因植株后，如有需要，可进一步分析以确定T-DNA插入的精确基因组位置。具有完整单拷贝整合的转基因植株，其外源基因的表达水平相当。这表明T-DNA在基因组中的整合位置对转基因的表达水平影响较小。

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科研

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遗传学

用 BIBAC 二元矢量生成单拷贝插入的转基因植物

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