Name: 背根神经节分离与原代培养对神经递质释放的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学习背根神经节分离与原代培养技术，用于研究感觉神经元的神经递质释放机制。该方法采用幼年大鼠腰椎背根神经节，通过酶解消化和细胞培养，建立接近生理条件的体外模型，为外周痛觉机制研究提供可靠实验基础。

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感谢 M. Calkins 博士在英文编辑方面的帮助。本研究由长庚纪念医院（CMRPD1F0482）、长庚大学健康老龄化研究中心（EMRPD1G0171）以及科技部（105-2320-B-182-012-MY2）提供资助。

本研究中涉及实验动物的所有方法均经长庚大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准（CGU 13-014）。
1. 采集实验大鼠腰段背根神经节
<ol>
	<li>使用2至3周龄的Sprague-Dawley（SD）大鼠进行腰段背根神经节（DRG）的采集。 
	注意：超过4周龄的大鼠所采集的DRG神经元在本文所述的培养条件下生长不佳。</li>
	<li>将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌。</li>
	<li>使用替来他明与唑拉西泮1:1混合液（20 mg/kg，腹腔注射（IP））对大鼠进行麻醉，并等待其在脚趾夹捏试验中不再出现足部回缩反应。 
	注意：本实验方案中可成功使用不同的麻醉策略。</li>
	<li>使用商用断头器对大鼠实施断头处死。</li>
	<li>使用断头器将大鼠躯干从前肢至股骨之间部分分离。采集区域示意图见图1A。 
	注意：尾侧切割线应位于股骨稍前方。若脊柱切割位置过高，将导致腰段L6背根神经节被切除。</li>
	<li>沿胸骨纵向剪开，并使用解剖剪去除所有器官/组织（见图2A-a）。</li>
	<li>沿躯干侧面剪开以获取大鼠背部组织，并去除皮肤。解剖后背部躯干的实物图见图1B。</li>
	<li>在采集DRG前将组织置于冰上预处理。清除手套上的毛发和血液，并用75%乙醇对手套进行消毒后再进行下一步操作。</li>
	<li>去除覆盖腰椎的肌肉组织。首先沿脊柱两侧（左侧和右侧）各做一纵行切口，并做一横向侧方切口以标记腰椎的头端界限。随后使用骨剪钳去除脊柱背侧肌肉（见图2A-b）。</li>
	<li>使用骨剪钳去除椎骨的背侧部分，暴露脊髓。</li>
	<li>使用解剖剪（见图2A-c）和镊子（见图2A-d）将脊髓移除。</li>
	<li>从最后一根肋骨对应的胸椎（胸椎13）开始计数椎骨，以确定腰段背根神经节的位置。椎骨位置示意图见图1C。</li>
	<li>使用显微剪将双侧腰段背根神经节（L1-L6）剪下（见图2A-f），放入含有2 mL冰浴无血清培养基的35 mm培养皿中。去除连接相邻背根神经节之间的神经纤维（如图1C所示），然后将其转移至培养皿中，以提高培养纯度。 
	注意：采集的背根神经节可在冰上保存于培养基中约1小时。在此期间，可对多只大鼠实施安乐死以获得更大数量的背根神经节样本。</li>
</ol>
2. 大鼠腰段DRG原代培养
注意：以下步骤应在层流罩内进行。
<ol>
	<li>在1×DMEM-F12培养基中配制含10%胎牛血清、100 mM丙酮酸钠和1×青霉素/链霉素的培养液。</li>
	<li>用200 µg/mL的多聚-L-赖氨酸对细胞培养处理过的24孔板进行包被，作用2小时后用无菌水洗涤。</li>
	<li>使用前，将培养皿在37 °C CO2培养箱中用1 mL培养基预孵育至少30分钟。</li>
	<li>将含有背根神经节（DRG）的35 mm培养皿转移至超净工作台，用无血清培养基通过移液重复清洗DRG三次。 
	注意：转移至工作台前，应先用75%乙醇清洁培养皿外表面。一个35 mm培养皿可容纳来自多只大鼠的DRG（具体数量取决于实验设计需求）。</li>
	<li>用无菌镊子将来自单只或合并多只大鼠的DRG转移至新的35 mm培养皿中，该培养皿内含有2 mL I型胶原酶IA（1 mg/mL，溶于无血清培养基）（图2A-e）。 
	注意：胶原酶溶液应通过0.22 µm注射器滤器过滤除菌。</li>
	<li>将DRG在37 °C CO2培养箱中用胶原酶溶液消化30分钟。</li>
	<li>吸除胶原酶溶液，并用2 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS）清洗DRG三次。 
	注意：可能会有残余纤维或组织从DRG脱落进入溶液中，可在清洗时用移液器将其去除。</li>
	<li>向含有DRG的35 mm培养皿中加入2 mL预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37 °C CO2培养箱中继续消化30分钟。</li>
	<li>用玻璃移液管将2 mL含DRG的溶液转移至15 mL离心管中。 
	注意：DRG可能粘附于玻璃移液管壁，因此操作需谨慎。为避免细胞损失，可将含DRG的溶液保留在玻璃移液管的锥形末端（约0.5 mL），然后缓慢但连续地转移至离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下以290 × g离心5分钟，弃上清，加入2 mL无血清培养基重悬DRG沉淀。</li>
	<li>重复步骤2.10两次，最后一次更换为预热的完全培养基。</li>
	<li>使用火焰抛光的巴斯德移液管（长度230 mm，尖端内径1 mm）手动吹打DRG约60次。参见图2B中火焰抛光与未抛光巴斯德移液管尖端孔径的对比照片。 
	注意：火焰抛光后的巴斯德移液管内径比对照管约小10%，且锥形末端内壁更光滑。吹打过程中应避免产生气泡。</li>
	<li>从CO2培养箱中取出经多聚-L-赖氨酸包被的培养皿，吸除预孵育的培养基，将解离后的细胞接种至包被好的培养皿中。</li>
	<li>将一只大鼠（双侧L1-L6节段，共12个DRG）的DRG细胞接种至24孔板的四个孔中；每孔约含5 × 104个细胞。 
	注意：该密度适用于检测释放的降钙素基因相关肽（CGRP）或P物质（SP），也适用于免疫染色。若用于Western blot或RNA提取，应将一只大鼠（双侧L1-L6）的DRG细胞接种至6孔板的一个孔中。</li>
	<li>次日更换培养基，加入10 µM阿糖胞苷（Ara-C）和100 ng/mL神经生长因子（NGF），之后每两天更换一次培养基。 
	注意：若已采集胸段脊柱来源的DRG，也可采用本方案进行培养。</li>
</ol>
3. 在DRG细胞中转染NPFFR2 siRNA
<ol>
	<li>根据制造商提供的说明书进行NPFFR2 siRNA和对照siRNA的转染。 
	注意：如果所选转染试剂与本实验使用的试剂不同（参见材料表），则需要对说明书中的方案进行相应调整。</li>
	<li>细胞接种后第3天，更换为0.5 mL预热的无血清培养基，将背根神经节（DRG）置于37 °C的CO2培养箱中孵育1&#160;h。</li>
	<li>将50 nM siRNA（溶于1 µL无RNase的水中）加入12.5 µL无血清培养基中。</li>
	<li>将2.5 µL转染试剂加入10 µL无血清培养基中。</li>
	<li>用移液器将步骤3.3和3.4中的溶液混合，并在室温下孵育该混合转染溶液10分钟。</li>
	<li>将转染溶液加入含有背根神经节（DRG）的24孔板中，通过轻轻摇动使溶液与培养基混匀。 
	注意：若需对多个孔进行转染，应同时加入多个转染溶液。</li>
	<li>将背根神经节（DRG）置于37 °C的CO2培养箱中继续孵育6小时。</li>
	<li>向24孔板中每孔加入0.5 mL含有20%胎牛血清、100 mM丙酮酸钠和1×青霉素/链霉素的1×DMEM-F12培养基，并添加10 µM Ara-C和100 ng/mL神经生长因子（NGF）。</li>
	<li>将背根神经节（DRG）置于37 °C的CO2培养箱中继续孵育66小时（在48小时时更换新鲜培养基）。</li>
</ol>
4. 从原代背根神经节细胞释放神经递质
<ol>
	<li>细胞接种后第6天（siRNA转染72小时后），更换为200 µL无血清培养基，将细胞置于37 °C CO2培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>加入1 µL刺激性化学物质，通过移液轻轻混匀培养基。将培养皿置于37 °C CO2培养箱中孵育指定时间。 
	注意：本文中，培养的细胞使用NPFFR2激动剂dNPA（D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2，5 nmol）刺激1小时。</li>
	<li>从培养皿中收集培养基，在4 °C条件下以5,000 x g离心5分钟，以去除悬浮杂质。</li>
	<li>收集离心后的上清液，根据需要使用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释样品。使用酶联免疫分析（EIA）试剂盒检测神经递质水平。 
	注意：此处分析CGRP水平前将上清液按1:100稀释；分析SP水平前未对上清液进行稀释。</li>
</ol>
5. CGRP 和 SP 免疫放射分析
<ol>
	<li>根据CGRP或SP EIA试剂盒制造商的说明书立即分析样品。 
	注意：具体操作步骤将根据所使用的试剂盒不同而有所差异。</li>
	<li>使用试剂盒中提供的洗涤缓冲液将CGRP EIA孔板清洗5次。</li>
	<li>向CGRP EIA孔中加入100 µL样品和100 µL抗CGRP乙酰胆碱酯酶（AChE）示踪剂；向SP EIA孔中加入50 µL样品、50 µL抗SP AChE示踪剂和50 µL抗SP抗血清。</li>
	<li>使用试剂盒中提供的塑料封膜密封CGRP和SP检测孔。</li>
	<li>在4 °C条件下孵育过夜。</li>
	<li>使用CGRP或SP洗涤缓冲液清洗孔板5次，并彻底去除孔内残留液体。</li>
	<li>向相应的CGRP或SP EIA孔中加入200 µL试剂盒提供的Ellman's试剂。</li>
	<li>将CGRP孔在室温下孵育30分钟，SP孔在室温下孵育90分钟。两种检测均需避光操作。</li>
	<li>在414 nm波长下读取酶标板数据，并根据相应的EIA仪器计算结果。 
	注意：操作过程中始终避免用手接触孔板底部，在加入Ellman's试剂前，使用镜头清洁纸擦去孔底的水渍。</li>
</ol>

<ol><li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBear%2C+MF+%22Neuroscience%3A+exploring+the+brain%22">Neuroscience: exploring the brain</a>. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).</li>
<li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+dynamics+of+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+neural+science%22">Principles of neural science</a>. , 3 edn, McGraw-Hill, Health Professions Division. (2000).</li>
<li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11557989">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li>
<li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li>
<li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperalgesia+and+allodynia%3A+peripheral+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Joint+Bone+Spine%22%5BJournal%5D)">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li>
<li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li>
<li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li>
<li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+from+form+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li>
<li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li>
<li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+its+role+in+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Anestesiol%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain%3A+an+in+vivo+and+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126(2011).</li>
<li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Reg+Anesth+Pain+Med%22%5BJournal%5D)">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li>
<li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li>
<li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li>
<li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures%3A+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li>
<li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+A+transcriptomic+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li>
<li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li>
<li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670(2015).</li>
<li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li>
<li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li>
<li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li>
<li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文中，我们展示了大鼠腰段背根神经节（DRG）的采集、酶解离及培养方法。在神经生长因子（NGF）的神经营养支持下，接种细胞后3天内即可观察到DRG神经元轴突的延伸。通过降钙素基因相关肽（CGRP）蛋白染色后，可清晰观察到延伸的轴突，该蛋白在胞体中合成并沿轴突纤维运输。同时，卫星细胞的突起也向外延伸，使得这些可分裂的胶质细胞在数天内即可围绕神经元分布。采用本方案培养的原代DRG细胞适用于研究调控感觉神经元的细胞机制。在此，我们使用NPFFR2特异性激动剂dNPA刺激培养的DRG神经元释放神经肽CGRP和P物质（SP）。NPFFR2是神经肽FF（NPFF）的特异性受体，已有报道表明其参与疼痛感知与调控通路22,23。通过使用NPFFR2 siRNA进一步验证了CGRP和SP释放的NPFFR2依赖性。
背根神经节（DRG）培养物包含感觉神经元和卫星胶质细胞。卫星胶质细胞为神经元提供代谢支持，并维持神经元功能9,</...

感觉神经元的细胞体位于背根神经节（DRG）内。这些神经元为假单极神经元，支配外周组织和中枢神经系统。感觉神经元的外周神经末梢分布于肌肉、皮肤、内脏器官和骨骼等多种组织中。 它们将外周感觉信号传递至脊髓背角的神经末梢，随后信号通过不同的躯体感觉上行通路传至大脑1,2。躯体感觉使机体能够感受（即触觉、痛觉和温度觉）并感知运动与空间方位（本体感觉）1,3。初级传入轴突可分为四个亚类，包括对骨骼肌本体感觉起反应的I类（Aα）纤维、对皮肤机械感受器起反应的II类（Aβ）纤维，以及对疼痛和温度起反应的III类（Aδ）和V类（C）纤维。其中只有C纤维无髓鞘，其余纤维均不同程度地具有髓鞘。
伤害性感受器是初级感觉神经元，可被具有组织损伤潜能的有害刺激（机械性、热性和化学性刺激）激活。这些神经元由有髓鞘的Aδ纤维和无髓鞘的C纤维组成1,4。Aδ纤维表达神经生长因子（NGF，trkA受体）、CGRP和SP的受体。C纤维可分为肽能性和非肽能性C纤维。其中，非肽能性C纤维表达胶质细胞源性神经营养因子（GDNF，RET和GFR受体）、凝集素IB4以及ATP门控离子通道亚型（P2X3）5,6,7。伤害性感受器可通过离子通道的表达加以区分，并可被神经营养因子、细胞因子、神经肽、ATP或其他化学物质激活8。在受到刺激时，感觉神经元末梢可释放包括CGRP、SP和谷氨酸在内的神经递质，传递至脊髓背角以传导伤害性感觉信号2。背根神经节（DRG）不仅包含神经元，还含有卫星胶质细胞。卫星细胞包绕感觉神经元，为其提供机械和代谢支持9,10。有趣的是，越来越多的证据表明，DRG中的卫星胶质细胞可能参与调控痛觉感知11。
已有报道指出，感觉神经元是最常被用作原代神经元细胞的类型12，并被广泛应用于电生理学、信号转导以及神经递质释放的研究。它们也常用于探索神经元发育、炎症性疼痛、神经病理性疼痛、皮肤感觉（如瘙痒）和轴突生长等细胞机制12,13,14,15。背根神经节（DRG）原代培养可采用解离神经元的方式，以评估单个或多个细胞内的生化变化，使科学家能够开展在实验动物体内无法实施的研究。最近，已成功从人类器官捐献者获取的组织中培养出DRG，这可能极大促进转化医学研究16。另一方面，感觉神经元也可通过DRG组织块培养的方式进行培养。DRG组织块培养可保留神经元原有的组织结构，包括施万细胞和卫星胶质细胞，特别适用于研究神经元与非神经元细胞之间的相互作用17。DRG原代培养可在2.5小时内简便完成。其细胞组成和特性高度反映来源DRG的真实情况，因此可根据实验需求选择性地采集特定部位的DRG（如腰段或胸段DRG）。胚胎期和新生期DRG神经元的培养需要神经生长因子（NGF）以维持存活并诱导轴突生长，而成年动物DRG神经元的培养则无需在培养基中添加神经营养因子12,17。此外，目前已有 commercially available DRG-杂交瘤细胞系，例如ND7/23和F11，这些细胞系无需使用实验动物。然而，由于缺乏瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1）的表达（TRPV1是小直径感觉伤害性神经元的重要标志物），以及基因表达谱与真实神经元不一致，限制了它们的应用范围18。近年来，已从小鼠（MED17.11）20和大鼠（50B11）19中建立了永生化DRG神经元细胞系，适用于药物靶点研究中的高通量筛选。然而，这些细胞系的基因表达谱尚未全面鉴定，因此将这些永生化细胞与真实感觉神经元进行比较的验证实验仍在持续进行中。
NPFFR2 在背根神经节（DRG）中合成，并被转运至脊髓背角的感觉神经末梢21。本文提供了一种培养腰段 DRG 细胞的方案，并使用 NPFFR2 激动剂处理这些细胞，以诱导神经肽 CGRP 和 SP 的释放。为进一步验证其对 NPFFR2 的依赖性，可采用 NPFFR2 小干扰 RNA（siRNA）转染培养的 DRG 细胞进行检测。

<table><tbody><tr><td>替来他明和唑拉西泮混合物（Zoletil）</td><td>Virbac</td><td>Zoletil 50</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1</td><td>培养基</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>培养基</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Biological Industries</td><td>03-033-1</td><td>培养基</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>12400024</td><td>培养基</td></tr><tr><td>多聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P9011</td><td>包被培养皿</td></tr><tr><td>胶原酶 IA</td><td>Sigma</td><td>9001-12-1</td><td>酶消化</td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>培养基</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-051-5</td><td>酶消化</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Hilgenberg</td><td>3150102</td><td>细胞吹打</td></tr><tr><td>阿糖胞苷（Ara-C）</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td>培养基</td></tr><tr><td>神经生长因子（NGF）</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td>培养基</td></tr><tr><td>NPFFR2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-099691-02-0005</td><td>转染</td></tr><tr><td>非靶向 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-001810-10-05</td><td>转染</td></tr><tr><td>NeuroPORTER 转染试剂</td><td>Genlantis</td><td>T400150</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>dNPA</td><td>Genemed Synthesis</td><td>N/A</td><td>NPFFR2 激动剂</td></tr><tr><td>CGRP ELISA</td><td>Cayman</td><td>589001</td><td>酶免疫分析</td></tr><tr><td>SP ELISA</td><td>Cayman</td><td>583751</td><td>酶免疫分析</td></tr><tr><td>CGRP 抗体</td><td>Calbiochem</td><td>PC205L</td><td>免疫组化</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>免疫组化</td></tr></tbody></table>

背根神经节的分离与原代培养以研究神经递质释放

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

背根神经节（DRG）包含感觉神经元的细胞体。这类神经元为假单极神经元，具有两条轴突，分别支配皮肤、肌肉和内脏器官等外周组织以及中枢神经系统中的脊髓背角。感觉神经元负责传递包括触觉、痛觉、温度觉和本体感觉在内的躯体感觉。因此，背根神经节原代培养被广泛用于研究伤害性感受的细胞机制、感觉神经元的生理功能以及神经发育过程。培养的神经元可用于电生理学、信号转导、神经递质释放或钙成像等相关研究。通过背根神经节原代培养，科研人员可培养分离的DRG神经元，以监测单个或多个细胞内的生化变化，克服许多与 体内 实验。与市售的DRG-杂交瘤细胞系或永生化DRG神经元细胞系相比，原代细胞的组成和特性更接近于组织中的感觉神经元。然而，由于单只动物可分离获得的培养用DRG原代细胞数量有限，因此难以开展针对药物靶向研究的高通量筛选。本文描述了DRG的采集与培养步骤。此外，我们展示了使用神经肽FF受体2型（NPFFR2）激动剂处理培养的DRG细胞，以诱导肽类神经递质（降钙素基因相关肽（CRGP）和P物质（SP））的释放。

将大鼠腰段背根神经节（DRG）神经元接种于24孔板中进行培养，培养基中添加Ara-C以抑制胶质细胞增殖，并添加NGF以支持神经元生长。观察活体DRG细胞的形态。如图3所示，在第1天，单个神经元的胞体贴附于培养皿底部，被选中用于观察。从第1天至第3天持续监测轴突生长情况。胶质细胞发生增殖并延伸出突起，包绕感觉神经元的胞体。在另一组培养样本中，通过CGRP蛋白染色以显示神经元的形态。在图4中，CGRP蛋白染色信号出现在感觉神经元的胞浆和轴突中。经DAPI染色后，神经元与胶质细胞的核形态具有明显区别：神经元的细胞核更大且呈更圆的形态，而胶质细胞的细胞核则更倾向于椭圆形（图4B）。
使用选择性 NPFFR2 激动剂 dNPA 刺激 CGRP 和 SP 的释放。此外，通过将细胞转染 N...

背根神经节（DRG）原代培养常用于研究感觉神经元中的生理功能或与病理相关的过程。本文中，我们展示了利用腰段DRG培养物，在使用选择性激动剂刺激神经肽FF受体2型后，检测神经递质释放的方法。

背根神经节（DRG）包含感觉神经元的细胞体。这类神经元为假单极神经元，具有两条支配外周的轴突……

该方法有助于解答感觉研究领域中的关键问题，例如外周伤害性感受。此技术的主要优势在于，能够利用最接近生理条件的模型来研究感觉神经元的细胞机制。从2至3周龄大鼠的躯干中采集腰段背根神经节。首先沿脊柱两侧各做一切口，并做一横向切口以标记腰椎的头端范围。然后使用骨剪钳去除脊柱的背侧肌肉。接着，去除椎骨的背侧部分，暴露脊髓。然后使用解剖剪和镊子取出脊髓。通过从最后一根肋骨处开始计数椎骨来确定腰段背根神经节的位置。此图显示了椎骨的位置。使用显微剪刀采集 L1 至 L6 节段的 12 对腰段背根神经节。去除附着的神经纤维以提高培养纯度。将每个腰段背根神经节转移至含有 2 毫升冰浴无血清培养基的 35 毫米培养皿中。将含有背根神经节的 35 毫米培养皿放入超净台，用无血清培养基通过移液吹打洗涤 3 次。使用无菌镊子将背根神经节（DRGs）转移至一个新的含有两毫升无菌 I 型胶原酶 A 的 35 毫米培养皿中。将组织置于 37 摄氏度的组织培养箱中，在胶原酶溶液中孵育 30 分钟，以开始细胞的解离。孵育结束后，移除胶原酶溶液，并用两毫升 Hank's 平衡盐溶液将背根神经节洗涤三次。接着，向培养皿中加入 2 mL 预热的 0.05% 胰蛋白酶 EDTA，将背根神经节（DRG）在培养箱中消化 30 分钟，操作同前。消化完成后，使用玻璃移液管将含有 DRG 的 2 mL 溶液转移至 15 mL 离心管中。DRG 可能会黏附在玻璃移液管上，因此此步骤应小心操作。通过将含有DRG的溶液保留在玻璃移液管的锥形末端，并缓慢但不间断地将溶液转移至离心管中，可避免实际损失。接下来，在4°C条件下以290 × g离心五分钟。离心后，弃去上清液，并加入另外2 mL无血清培养基以重新悬浮DRG。重复洗涤两次，最后一次离心后用两毫升预热的培养基重悬组织。使用先前准备好的无菌火焰抛光吸管手动吹打 triturate 背根神经节（DRG）约 60 次。接着，从 CO2 培养箱中取出一个每孔含有 1 毫升培养基的多聚-L-赖氨酸包被的 24 孔板。吸弃培养皿中已孵育的培养基。将一只大鼠的DRG细胞接种至四个孔中，每孔接种密度约为500,000个细胞。次日，将培养基更换为添加了10微摩尔阿糖胞苷（AraC）和100纳克/毫升神经生长因子（NGF）的培养基。细胞接种后第三天，将培养基更换为0.5毫升预热的无血清培养基，孵育1小时。孵育期间，每项转染反应中，在12.5微升无血清培养基中加入1微升RNase-free水中溶解的50毫摩尔siRNA。然后，为每孔转染将2.5 µL转染试剂加入10 µL无血清培养基中。用移液器混合两种溶液，并在室温下孵育该混合转染溶液10分钟。10分钟后，将转染溶液加入含有背根神经节（DRG）的24孔板的各孔中，并通过轻轻振荡混匀。孵育6小时后，向每孔细胞中加入0.5毫升含20% FBS、10微摩尔AraC和100纳克/毫升NGF的培养基。最后将DRG置于37°C的CO2培养箱中继续孵育66小时。铺板后第6天，即siRNA转染后72小时，更换培养基为200微升无血清培养基。孵育30分钟后，加入一微升刺激化学物，并用移液器轻轻混匀。此处使用NPFFR2激动剂dNPA及其相应的溶剂。在所需孵育时间结束后，从培养皿中收集培养基，并在4摄氏度下以5000 × g离心5分钟，以去除任何悬浮杂质。收集离心后的上清液，根据需要使用磷酸盐缓冲液进行稀释。使用市售的酶联免疫检测试剂盒测定神经递质水平。在第一天，由箭头指示的单个神经元的胞体已贴附在培养皿底部。如箭头所示，还存在一个胶质细胞。胶质细胞在第2天发生增殖，并延伸出突起以包绕感觉神经元的胞体，该过程在第3天更为显著。在另一培养样本中，通过CGRP蛋白染色以显示神经元的形态。CGRP蛋白染色出现在感觉神经元的细胞质和轴突中。使用DAPI染色时，神经元和胶质细胞的细胞核形态明显不同。神经元的细胞核比胶质细胞更大且更圆。相比之下，胶质细胞的细胞核形状更偏椭圆形。只要操作得当，掌握该技术后可在两个半小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何解剖和培养背根神经节，并将其作为研究潜在生理功能的工具。请注意，与常规细胞系相比，原代细胞的培养操作要困难得多，因此在进行这些操作时，轻柔处理始终是最佳方式。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

背根神经节分离与原代培养对神经递质释放的研究

本文介绍了制备和维护隔室化培养室以培养背根神经节感觉神经元的技术。...

背根神经节神经元在隔室化培养中的制备与维持

在本方案中，我们描述了一种研究胶质细胞异质性对轴突生长影响的新方法 体外 共培养系统。将大鼠皮层胶质细胞培养至汇合后，与高度纯化的大鼠背根神经节神经元进行共培养。在同一培养体系中直接比较不同胶质细胞对神经元黏附和轴突生长的影响。该方法为直接研究胶质细胞异质性对神经元黏附和轴突生长的影响提供了新途径。<br...

研究胶质细胞异质性对轴突生长影响的新共培养方法

本文描述了一种利用培养的成年小鼠背根神经节神经元进行轴突再生遗传学研究的体外模型。该方法包括重新悬浮和再接种步骤，以允许经历遗传操作的神经元重新生长轴突。该策略对于利用基于RNA干扰的蛋白敲低技术进行轴突再生的缺失功能研究尤为有用。...

成年背根神经节神经元培养体系中的轴突再生遗传学研究

本视频演示了从大鼠胚胎中分离背根神经节（DRG）神经元，并将其与施万细胞前体共培养以生成成熟施万细胞的操作流程。分离得到的DRG经过处理以获取神经元和胶质细胞。分离后的细胞通过培养纯化神经元，随后在共培养培养基中与施万细胞样细胞（SCLCs）进行共培养。DRG神经元与SCLCs的相互作用可诱导SCLCs成熟为施万细胞。...

背根神经节神经元的分离及与施万细胞前体共培养以生成施万细胞

本视频演示了一种利用分离的小鼠背根神经节（DRG）组织建立背根神经节或DRG组织块培养及DRG分离细胞模型的方法。这些模型有助于在受控环境中研究涉及神经元-胶质细胞相互作用的多种机制。...

生成背根神经节外植体及解离细胞培养

本视频展示了一种从背根神经节（DRG）中分离神经元的方法。从大鼠脊柱分离背根神经节（DRG），经酶处理后，通过机械解离获得单细胞悬液。利用密度梯度离心法将神经元与胶质细胞分离，并在生长培养基中进行培养。...

一种用于神经元培养的背根神经节收获与解离技术

本视频演示了一种从大鼠脊柱分离和培养背根神经节（DRG）细胞的技术。从脊柱中切除的DRG经酶处理并机械解离，以获得单细胞悬液。细胞在含有抑制剂和生长因子的培养基中培养，这些成分分别用于限制胶质细胞增殖并促进神经元生长。...

建立大鼠脊柱背根神经节原代细胞培养

本视频展示了利用转染的背根神经节细胞，通过神经肽受体激动剂刺激来研究神经递质释放的方法。...

使用神经肽受体激动剂刺激背根神经节感觉神经元

本方案提供了一种从成年Sprague...

收获、包埋及在多区室装置中培养背根神经节以研究外周神经元特征

本方案描述了建立小鼠背根神经节（DRG）全组织培养和分散培养的方法，以及利用这些培养系统评估肿瘤-神经相互作用的应用。...

建立 体外 背根神经节培养模型：探究癌症-神经相互作用的互补方法

背根神经节（DRG）包含初级感觉神经元的胞体，并将外周感觉信号传递至脊髓。本方案描述了一种适用于小鼠背根神经节的解剖方法，可实现结构完整神经节的标准化分离、解剖节段的准确定位、为初学者提供直观操作指导，并减少操作过程中的组织损伤。...

小鼠背根神经节的解剖与分离

学习背根神经节分离与原代培养技术，用于研究感觉神经元的神经递质释放机制。该方法采用幼年大鼠腰椎背根神经节，通过酶解消化和细胞培养，建立接近生理条件的体外模型，为外周痛觉机制研究提供可靠实验基础。

背根神经节的分离与原代培养以研究神经递质释放

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