Name: 背根神经节神经元和区分脂肪干细胞：一种在体外共培养模型来研究周围神经再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 了解背根神经节神经元与脂肪干细胞共培养技术，用于研究周围神经再生机制。该方法通过体外模型分析神经突生长及细胞相互作用，为再生医学提供重要实验基础。

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本工作由英国国家健康研究所、医学科学院以及英国手外科协会资助。我们还衷心感谢美国Acorda Therapeutics公司持续提供GGF-2。作者最后要感谢Giorgio Terenghi教授多年来对我们团队的宝贵支持与指导，这些支持与指导促成了本实验方案的建立与优化。

注意：所有涉及动物的实验均按照英国1986年《动物（科学程序）法案》进行。
1. 实验设置
<ol>
	<li>在开始组织和细胞收获之前，检查所有工具是否无菌。如有必要，对一把锋利的手术剪、一把极细镊子和一把细标准镊子进行高压灭菌。在细胞接种前，根据需要使用紫外线灭菌、乙醇处理或蒸汽灭菌对每种基质进行灭菌。</li>
	<li>干细胞收获与分化培养基的制备
	<ol>
		<li>制备干细胞生长培养基，包含添加了10%胎牛血清（FBS）、200 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素（PS）的最低必需培养基（α-MEM）。</li>
		<li>通过将10 mg佛司可林溶解于2.436 ml无菌二甲基亚砜中，配制10 mM佛司可林储备液。使用时终浓度为14 μM。</li>
		<li>通过将50 mg全反式维甲酸溶解于1.43 ml无菌二甲基亚砜中，配制35 mg/ml全反式维甲酸储备液。使用时终浓度为350 ng/ml。</li>
		<li>将10 μg冻干粉溶于100 μl无菌蒸馏水中，配制血小板源性生长因子（PDGF）储备液（100 μg/ml）。使用时终浓度为5 ng/ml。</li>
		<li>将50 μg冻干粉溶于500 μl无菌蒸馏水中，配制碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）储备液（100 μg/ml）。使用时终浓度为10 ng/ml。</li>
		<li>制备干细胞分化培养基，即在干细胞生长培养基中添加14 µM佛司可林、126 ng/ml胶质细胞生长因子-2（GGF-2）、5 ng/mL血小板源性生长因子（PDGF）和10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经元收获与解离所需培养基及储备液的制备
	<ol>
		<li>通过向Ham’s F12培养基中加入1%青霉素-链霉素（PS）和1% N2补充剂，配制Bottenstein和Sato（BS）培养基28。若使用24孔板，按每孔500 µl计算所需总体积。</li>
		<li>在Ham’s F12培养基中配制浓度为1.25% wt/v的IV型胶原酶储备液，过滤除菌后分装为200 µl每份，于-20 °C保存。</li>
		<li>在Ham’s F12培养基中配制浓度为2.5% wt/v的牛胰蛋白酶储备液，过滤除菌后分装为200 µl每份，于-20 °C保存。</li>
		<li>在F12培养基中用经滤膜除菌的1 mg/ml无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）溶液配制浓度为5 µg/mL的神经生长因子（NGF）储备液，分装为200 µl每份，于-20 °C保存。NGF复溶后不得再次过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如未进行表面修饰，可根据需要使用多聚-D-赖氨酸（0.1 mg/ml，室温孵育15分钟）和/或层粘连蛋白（2–10 µg/cm2，37 °C孵育2小时）对盖玻片或培养板进行包被，以促进神经元贴附和 neurite（神经突）生长。</li>
	<li>使用前始终将培养基在37 °C水浴中预热。</li>
</ol>
2. 脂肪来源干细胞（ASC）的获取及其向施万细胞表型的分化
<ol>
	<li>从成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠的内脏脂肪和腹股沟脂肪中收获 ASC
	<ol>
		<li>开始前，准备一个含有 10–15 ml Hank's 平衡盐溶液（HBSS）的离心管，加入 1% v/v 的青霉素-链霉素（PS）溶液，并置于冰上保存，直至进行脂肪组织采集。</li>
		<li>通过颈椎脱位和断头处死大鼠。剃除大鼠体毛，切开腹部皮肤，暴露内脏器官，注意避免出血。从成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠中取出包裹胃和肠道的内脏脂肪（通常呈黄色脂肪样质地）以及围绕睾丸的腹股沟脂肪。将脂肪组织转移至含有冰上预冷 HBSS 的离心管中。</li>
		<li>在 II 级生物安全柜中，使用剪刀和无菌剃刀片将脂肪组织精细剪碎，直至形成均匀细小的组织碎片，随后转移至含有 15 ml 新鲜配制并经滤膜除菌的 0.2% wt/v I 型胶原酶溶液的离心管中。</li>
		<li>将离心管置于 37 °C 水浴中，在持续振荡条件下酶解脂肪组织 30 分钟至 1 小时。密切观察消化过程，在组织完全解离前停止消化，以提高细胞活力和得率。使用 100 µm 细胞滤器过滤未完全解离的组织碎片。 
		注：良好的组织消化效果表现为脂肪组织呈现均一质地，轻轻摇晃离心管时肉眼可见呈浅褐色外观。</li>
		<li>加入 15 ml 含胎牛血清的干细胞生长培养基（37 °C 预热）以中和酶活性，随后在 160 g 条件下离心 10 分钟，收集位于管底的基质血管组分（SVF），其中包括干细胞。</li>
		<li>此时，可将细胞沉淀重悬于 1 ml 红细胞裂解缓冲液中，以去除红细胞污染。充分吹打混匀 1 分钟后，加入 10 ml 新鲜干细胞生长培养基，在 160 g 条件下离心 10 分钟。</li>
		<li>小心吸除上清液，注意勿扰动底部的细胞沉淀。将细胞重悬于 10 ml 干细胞生长培养基中，转移至 75 cm2 培养瓶，于 37 °C、5% CO2 条件下培养。维持细胞亚汇合状态至第 1–2 代，每 3 天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ASC 向施万细胞表型的分化
	<ol>
		<li>在第 1–2 代时，从 75 cm2 培养瓶中移除干细胞生长培养基，更换为 10 ml 新鲜配制并经滤膜除菌的含 1 mM β-巯基乙醇的培养基。于 37 °C、5% CO2 条件下培养 24 小时。此阶段需注意，在开始诱导分化前应以较低密度（30%）接种细胞。</li>
		<li>用 HBSS 轻柔洗涤细胞，吸除后加入 10 ml 含 350 ng/ml 视黄酸的培养基。于 37 °C、5% CO2 条件下继续培养 72 小时。尽量减少培养基对光的暴露。</li>
		<li>3 天后，用 HBSS 轻柔洗涤细胞，吸除后加入 10 ml 干细胞分化培养基（见步骤 1.2.6）。维持细胞在亚汇合状态，每 3 天更换一次培养基。 
		注：经过约 2 周培养后，ASC 可分化为类施万细胞表型的 ASC，表达其特征性表型（如 Kingham et al.5 所示）。此后可在第 10 代前使用，细胞行为无明显改变29。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 背根神经节（DRG）神经元的收获与解离
<ol>
	<li>通过颈椎脱位和断头处死大鼠，剃除大鼠体表毛发并掀开皮肤以暴露脊柱。使用锋利的剪刀小心切除脊柱，注意保护其中的器官和血管。将脊柱置于培养皿中，转移至II级生物安全柜内，并去除所有背部组织。</li>
	<li>沿纵轴方向用无菌且锋利的手术剪将脊柱切成两半，以暴露脊髓组织。此时，可在肋骨下方水平将脊柱进一步分为两个较小的节段，以便在背根神经节（DRG）神经元分离过程中更易于操作。使用精细镊子轻轻去除所有脊髓组织，注意不要牵拉或移除DRG根部，从而使DRG及其根部仍保留在椎管内并暴露出来。观察从椎管直接伸出的白色丝状结构即为DRG。</li>
	<li>使用极细的镊子从椎管中完整取出整个DRG根（不仅是DRG本身），深入椎管内部操作时注意避免损伤神经节的根部。将DRG转移至含有3–4 ml添加1%青霉素-链霉素（PS）的Ham’s F12培养基的小培养皿（60 mm2）中。若使用不同动物，应分别使用独立的培养皿。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用无菌镊子和手术刀清除围绕神经节的多余神经根组织，以减少胶质细胞污染。将DRG转移至另一个含1.8 ml新鲜F12培养基的小培养皿（35 mm2）中。</li>
	<li>加入200 µl浓度为1.25% wt/v的IV型胶原酶储备液（终浓度为0.125%），将DRG置于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。用玻璃移液管小心吸除培养基，注意避免吸走或损伤DRG。加入添加了0.125% wt/v IV型胶原酶的新鲜F12培养基，按前述条件再次孵育1小时。</li>
	<li>吸除培养基后，用F12培养基轻轻清洗DRG一次。然后加入1.8 ml F12培养基和200 µl胰蛋白酶（终浓度为0.25% wt/v），于37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。</li>
	<li>去除胰蛋白酶溶液，加入含500 µl胎牛血清（FBS）的1 ml F12培养基以终止酶反应。吸除培养基后，用F12培养基轻轻清洗DRG三次，以彻底去除血清残留。</li>
	<li>加入2 ml新鲜F12培养基，用玻璃移液管小心将DRG连同培养基转移至15 ml离心管中。通过反复吹打（约8–10次）进行机械性解离，使用玻璃移液管（也可用塑料吸头替代）轻柔地分散DRG神经元。</li>
	<li>让细胞沉淀自然沉降至管底，将上清液收集至新管中。向沉淀所在的管中加入2 ml新鲜F12培养基，重复使用玻璃移液管进行机械解离。重复此步骤直至悬液均匀（约3–4次），并将所有解离后的DRG细胞收集至同一新管中。该方法可减少机械解离带来的细胞应激，提高神经元存活率。</li>
	<li>使用100 µm细胞滤网将所得的匀浆悬液过滤至新的15 ml离心管中，以去除未解离的组织块和其他碎片。此步骤中，可先将细胞悬液过滤至50 ml离心管，再用玻璃移液管将液体转移至较小的离心管中。以110 g离心5分钟。</li>
	<li>通过将500 µl 30%牛血清白蛋白（BSA）溶液加入500 µl F12培养基中配制15% BSA溶液。沿15 ml离心管内壁缓慢滴加该溶液，形成渐变的蛋白梯度层。操作时建议将离心管倾斜约45°角，并以管壁上的刻度数字为参考，缓慢释放BSA溶液以形成清晰的“轨迹”。</li>
	<li>从步骤3.10中吸除上清液，保留管底约500 µl液体，将细胞沉淀在此余液中重悬。沿步骤3.11预先形成的蛋白梯度层缓慢加入细胞悬液（以管壁刻度为参考），然后以500 g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀重悬于1 ml改良BS培养基中（或根据下文步骤4.5所述，用于施万细胞样ASC/DRG共培养的混合培养基）。 
	注意：重悬DRG神经元的体积可根据所需最终细胞浓度及待接种样本数量进行调整。一只动物提供的细胞足以完成24孔板实验。</li>
	<li>将接种后的样品置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育2小时，以促进细胞贴壁，随后加入添加50 ng/ml神经生长因子（NGF）的新鲜BS培养基。</li>
</ol>
4. SC样ASC与背根神经节神经元的直接共培养
<ol>
	<li>按照步骤 2.2.3 所述，在亚融合状态下培养 SC 样 ASC。在收获 DRG 前 24 小时，吸除干细胞分化培养基，并用 HBSS 洗涤细胞。吸除液体后，加入 3 ml 胰蛋白酶，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 分钟。</li>
	<li>在光学显微镜下检查所有细胞是否已从培养瓶脱离。可轻轻敲击培养瓶以促进细胞脱落。加入 7 ml 培养基以终止胰蛋白酶反应，将细胞悬液收集至 15 ml 离心管中，并在 110 g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 ml 干细胞分化培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并根据所需终浓度稀释细胞悬液。理想情况下，以 20,000 SC 样 ASC/cm2 的密度接种可确保形成融合的细胞层。</li>
	<li>将 SC 样 ASC 接种至基质上，并在 37 °C、5 % CO2 条件下孵育 24 小时，以促进细胞贴壁。</li>
	<li>孵育 24 小时后，吸除培养基，并按照步骤 3.14 和 3.15 所述，将 DRG 神经元接种至细胞层上方。更换为混合培养基，其中含 50% 干细胞分化培养基和 50% BS 培养基。此外，在最终混合培养基中将 FBS 浓度降低至 1–2.5%，有助于避免源自 DRG 解离的污染性卫星细胞增殖。</li>
	<li>将共培养样品置于 37 °C、5 % CO2 条件下孵育，并根据后续实验需求维持培养至相应时间。</li>
</ol>

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作者确认本出版物不存在任何利益冲突。

背根神经节神经元常用于神经细胞的原代培养，以研究轴突切断后神经元的再生 体内本文介绍了一种从成年大鼠中精确分离背根神经节（DRG）的实验方案，旨在减少周围环境中卫星细胞的数量，同时不损害神经元的存活。由于脂肪来源的干细胞（ASC）可分化为类似施万细胞（SC）的表型，是细胞治疗中施万细胞的有效替代来源，本文还详细描述了一种施万细胞样ASC与DRG共培养体系。
众所周知，层粘连蛋白（或层粘连蛋白衍生的肽序列）对神经元存活和 neurite 形成具有促进作用31–33。因此，在进行背根神经节（DRG）神经元培养时，建议预先用层粘连蛋白包被每种基质，以避免神经元细胞功能的丧失。层粘连蛋白包被的概念同样适用于组织工程支架的生物材料基质，例如常用于制备神经导管的聚己内酯（PCL）30。此外，先前的研究表明，纤维蛋白基质是三维神经元培养的适宜材料11。
除了蛋白质包被外，共培养模型为背根神经节神经元的存活提供了有价值的条件，并为研究外周神经系统损伤后神经元与施万细胞之间的相互作用提供了适宜的环境。细胞还可被移植 体内 通过使用神经装置来缩短自体细胞在损伤部位的募集时间。这一点在严重损伤中尤为重要，因为严重损伤可能导致细胞衰老/死亡以及肌肉萎缩。尽管施万细胞（SC）是参与周围神经再生和髓鞘形成过程最重要的胶质细胞，但其数量有限且增殖速度较慢，因此不适合用于组织工程应用。34ASC 是一种有效的替代来源，因其来源丰富且能够分化为施万细胞（SC）表型，表达特定的胶质细胞标志物，并表现出与天然施万细胞相似的功能特性。19ASC 还能够产生蛋白质和生长因子5 这可能有利于在共培养系统中促进背根神经节（DRG）神经元的神经突形成与延伸。然而，可根据实验需求建立两种不同的共培养系统。本文提出的方法是对本实验室已建立的成熟方案进行修订后的版本。11 并且涉及这两种细胞类型之间的直接接触（直接共培养），其中第二种细胞类型（DRG神经元）被接种在其他细胞（类施万细胞的脂肪来源干细胞）的上层。该方法基于先前的研究发现，即在接种神经元培养物时，基质上存在胶质细胞层具有重要意义。35–37这种效应可能是由于通过ASC以及干细胞表面其他信号沉积的DRG整合素与细胞外基质（ECM）分子之间的细胞间相互作用所致。此外还观察到，降低培养基中的血清蛋白含量可减少源自DRG神经元解离过程中产生的污染性卫星细胞的增殖，同时不影响ASC的功能。然而，包括少量施万细胞（SC）在内的卫星细胞很难从DRG神经元培养物中完全清除，因此在共培养体系中仍会有少量残留细胞存在。因此需要特别注意，这些少量亚群细胞也可能参与髓鞘形成过程 体外 研究，回忆存在的自体细胞 体内 损伤后。第二种方法（此处未展示）涉及使用细胞培养小室，避免两种不同细胞类型之间的直接接触（间接共培养）。然而，它并不能代表 体内 神经再生过程中的条件（神经元细胞生长长神经突的能力下降），但该方法可用于研究特定细胞群体释放到培养基中的可溶性因子对其他细胞的影响38.

周围神经损伤较为常见，英国每年约发生9,000例，主要发生在年轻且处于工作年龄的人群中1。尽管已有显微外科神经修复技术，但仍无法实现功能的完全恢复，常导致手部感觉障碍、运动功能下降以及频繁出现疼痛和冷不耐受2。此类损伤对患者及其日常生活活动能力造成深远且持久的影响，仅有不到60%的患者能够重返工作岗位3。
损伤后，神经元和施万细胞（SC）的表型与形态发生变化，以创造适宜的微环境，促进轴突出芽。在神经完全横断的情况下，神经被分为近端和远端残端；其中近端残端是再生过程发生的起点，而远端残端则经历沃勒变性（Wallerian degeneration），在此过程中，施万细胞脱离受损的轴突，去分化并增殖。这一过程对于清除髓鞘碎片以及为神经再生做准备至关重要4,5。轴突出芽由远端残端的施万细胞释放的神经营养因子和趋化因子所支持，并由沃勒变性后遗留的基底膜引导6,7。施万细胞沿再生的轴突排列，形成 Büngner 带，有助于引导轴突向靶器官生长，并减少在神经内膜管外的分支。再支配完成后，施万细胞形成新的髓鞘包裹再生的轴突，但感觉和运动功能仅能部分恢复8。
背根神经节（DRG）是位于脊柱椎间孔内的结构，包含支配外周器官的感觉神经元细胞。经分离后，可作为合适的 体外 用于神经再生研究的模型9–11，包括髓鞘形成的研究。特别是，成年DRG神经元模拟了 体内 这些细胞的特性为组织工程中研究周围神经修复的新策略提供了强有力的工具。
共培养体系代表了一种模拟复杂生物学相互作用的动态系统 体外 特定环境中两种（或多种）细胞类型之间的相互作用 体内 环境。这些细胞共培养模型的优点之一是能够对细胞外环境进行灵活且高度可控的调控。背根神经节（DRG）神经元经常被用于与施万细胞（SC）建立共培养系统，以模拟两种细胞类型在周围神经系统中的实际相互作用。10,12–14已证明，施万细胞（SC）可分泌细胞外基质（ECM）蛋白和生长因子，显著增强背根神经节（DRG）神经元的存活能力并促进其神经突起的 sprout（出芽）。15,16然而，施万细胞（SC）增殖所需时间较长，尽管细胞培养技术已取得进展，但仍难以获得足够数量的细胞用于组织工程应用。此外，获取自体SC需要牺牲一段健康神经。因此，SC来源的差异对于组织工程及体外神经再生测试均具有重要意义。在此背景下，脂肪来源干细胞（ASC）可被视为构建组织工程化周围神经修复材料的一种有价值的替代选择17,18先前的研究表明，这些细胞能够分化为类似施万细胞的脂肪来源干细胞（ASC），并表达典型的胶质细胞标志物，如 S-100、p75 和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。19，以及髓鞘蛋白零（P0）20还观察到胶质细胞分泌多种神经营养因子，如脑源性神经营养因子（BDNF）、神经生长因子（NGF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）。21,22因此，类似施万细胞的脂肪来源干细胞可作为促进周围神经再生的工具，这一点已通过以下两方面得到证实 体外 和 体内 研究23–26此外，与其他类型的干细胞相比，ASC 可通过微创手术获取，且数量更多；脂肪组织中干细胞的频率比骨髓中高 100 至 1,000 倍。27，且与SC和骨髓间充质干细胞相比具有更高的增殖速率。
本研究旨在提供一种详细的实验方案，以高效分离收获背根神经节（DRG）神经元和脂肪来源的干细胞（ASC），其中后者将被诱导分化为类似施万细胞（SC-like）的细胞。这两种细胞类型的共培养体系将为未来研究DRG神经元的神经突起 sprouting 能力以及在不同神经组织工程支架上髓鞘形成机制提供一个非常实用的实验平台。

<table><tbody><tr><td>100 &amp;micro;m细胞滤筛</td><td>BD 生物科学</td><td>352360</td><td>70 &amp;mu;m 细胞筛（货号 352350）可作为替代方案使用</td></tr><tr><td>15 ml 塑料管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 塑料管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 烧瓶</td><td>康宁</td><td>BC301</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸 &gt;98% 高效液相色谱</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>ARA-C 补充剂</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子（154个氨基酸）</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A9205</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>Gibco</td><td>17100-017</td><td>注意：该胶原酶仅用于脂肪组织消化</td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004188</td><td>注意：该胶原酶仅用于解离DRG外植体</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biosera</td><td>FB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td></td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50253</td><td>锐器应按规定妥善处理</td></tr><tr><td>胶质细胞生长因子-2（GGF-2）</td><td>Acorda Therapeutics</td><td></td><td>GGF-2 由 Acorda Therapeutics 公司慷慨捐赠。对于可商业获取的替代品，我们推荐 NRG1-&amp;beta;1 (R &amp;amp; D Systems，Abingdon）用于干细胞分化，终浓度为 200 ng/ml</td></tr><tr><td>F12 HAM 营养混合液</td><td>Sigma</td><td>N6658</td><td>37℃预热 &amp;deg;除非另有说明，否则在水浴中保持 C</td></tr><tr><td>汉克&amp;rsquo;Hanks 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>37℃预热 &amp;deg;除非另有说明，否则在水浴中保持在 C</td></tr><tr><td>N-2 补充剂（100 倍浓缩）</td><td>Invitrogen</td><td>17502</td><td></td></tr><tr><td>小鼠颌下腺神经生长因子2.5s蛋白&amp;nbsp; (NGF)</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（PS）</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[页眉]</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>康宁</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>重组人PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>37℃预热 &amp;deg;在水浴中，用于使细胞从组织培养瓶上脱落</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（2倍牛胰腺）</td><td>沃辛顿生物化学</td><td>LS003703</td><td>用于背根神经节（DRG）的解离</td></tr><tr><td>最低必需培养基Eagle（MEM）</td><td>Sigma</td><td>M8042</td><td>37℃预热 &amp;deg;除非另有说明，否则在水浴中保持 C</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>在生物安全柜中配制溶液</td></tr></tbody></table>

背根神经节神经元与分化后的脂肪源性干细胞：一种 体外 共培养模型用于研究周围神经再生

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

背根神经节（DRG）神经元位于脊柱椎间孔内，可用于构建一种 体外 一种有助于研究神经再生与髓鞘形成的系统。周围神经系统中的胶质细胞——施万细胞（Schwann cells, SC），在这些过程中起关键促进作用；因此，共同研究这些细胞成分之间的相互作用至关重要。背根神经节（DRG）神经元与胶质细胞的直接接触可通过特定膜受体感知额外刺激，进一步增强神经元反应。施万细胞会向培养基中释放生长因子和蛋白质，从而提高神经元存活率，并促进神经突的出芽与延伸。然而，施万细胞需要较长的增殖周期，且需牺牲健康神经以获取细胞来源，限制了其在组织工程中的应用。将脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells, ASC）诱导分化为施万细胞表型，是构建与DRG神经元共培养模型以研究神经再生的可行替代方案。本研究提供了一套详细且可重复的操作步骤，用于从成年大鼠中分离获取DRG神经元和ASC，将ASC定向诱导为施万细胞表型，并将两种细胞在直接共培养系统中联合使用，以探究周围神经系统中神经元与施万细胞之间的相互作用。该技术在优化用于周围神经修复的组织工程结构方面具有重要应用潜力。

分离的DRG神经元培养物是一种合适的 体外 用于研究神经再生的模型。然而，未经处理的基质无法为背根神经节（DRG）的附着及神经突的延伸提供适宜的环境。具有施万细胞样特性的脂肪来源干细胞（SC-like ASC）能够分泌生长因子和趋化因子19 这可以增强背根神经节（DRG）神经元在培养基中释放时的神经突起 sprouting 能力。因此，培养系统中施万细胞样脂肪源性干细胞（SC-like ASC）的存在在调控 DRG 功能方面可发挥重要作用。
本方案（图1）描述了进行施万细胞样脂肪干细胞（SC-like ASC）与背根神经节（DRG）神经元直接共培养的操作流程，在该过程中，神经元细胞与先前接种的施万细胞样ASC直接接触。该操作的主要难点在于从不同动物获取的DRG神经元数量存在高度变异性。因此，实验结果有时难以比较，在接种过程中需特别注意，以确保每次实验获得可比的细胞密度。本方案已优化，通过使用BSA梯度（步骤3.11）尽可能减少DRG神经元解离后残留的卫星细胞数量。此外，可根据Kingham 等11所述，在BS培养基中添加阿糖胞苷（ARA-C）以进一步减少卫星细胞群体。然而，处理时间的选择必须与DRG及施万细胞样ASC的活力进行仔细权衡，因为培养基中ARA-C的存在也会影响细胞活力。因此，几乎难以实现完全无卫星细胞的培养体系。
图2展示了在使用未经处理和化学修饰的聚己内酯（PCL）薄膜作为基底的共培养模型中，施万细胞样脂肪源性干细胞（SC-like ASC）对背根神经节（DRG）神经突生长的重要作用。如步骤4.5所述，将DRG神经元在含有50% BS培养基和50%干细胞分化培养基的混合溶液中培养3天，培养过程中有或无SC-like ASC的存在。培养结束后，细胞用4%多聚甲醛固定，并使用β-tubulin III（标记DRG神经元）和S100（标记SC-like ASC）进行染色，以观察细胞形态并研究DRG神经元伸出神经突的能力。在未处理的表面且无SC-like ASC存在的条件下，未观察到神经突的生成（图2A）；而在共培养体系中，神经突的形成明显改善（图2C）。平均而言，每个细胞体的神经突数量在干细胞存在时从0显著增加至3个。扫描电子显微镜（SEM）分析结果（见图3）进一步验证了上述发现。特别是，SEM图像显示DRG神经元生成神经突的能力主要发生在与SC-like ASC相邻的区域，如图3C中黄色箭头所示。
需要指出的是，在含有背根神经节（DRG）神经元的培养体系中，使用层粘连蛋白修饰的基质（包括层粘连蛋白衍生的肽段）常被视为神经元细胞培养的适宜条件，对神经突的形成和延伸具有显著促进作用30–32。然而，图2D和图3D所示结果表明，化学信号与生物信号的联合作用可进一步增强DRG神经元的反应。
<img alt="脂肪细胞传代培养与背根神经节神经元提取示意图；DRG/dASC共培养过程。" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 直接DRG-施万细胞样ASC共培养系统的制备。 背根神经节（DRG）神经元和脂肪源性干细胞（ASC）分别取自成年雄性Sprague-Dawley大鼠的脊柱以及内脏和腹股沟脂肪组织。通过一系列酶消化反应处理脂肪组织后，ASC被诱导分化为施万细胞样细胞，并在亚融合状态下维持培养直至使用。施万细胞样ASC在DRG提取前24小时预先接种于各培养基质上。在实验当天，通过一系列酶消化和机械操作提取并解离DRG神经元，随后将神经元接种至已预先铺好的施万细胞样ASC上层，并在混合培养基（含50%干细胞分化培养基和50%改良BS培养基）中继续培养至检测时为止。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经细胞的荧光显微镜图像，突出显示细胞结构和生长分化。" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 不同培养条件下背根神经节（DRG）神经元的荧光图像。 (A) 未经处理的PCL薄膜； (B) RGD修饰的PCL薄膜；(C) 在未经处理的PCL薄膜上与类施万细胞表型的脂肪来源干细胞（SC-like ASC）共培养；(D) 在RGD修饰的PCL薄膜上与SC-like ASC共培养。细胞在含有50%改良BS培养基和50%干细胞分化培养基的混合溶液中培养3天。随后，细胞用4%多聚甲醛固定，经Triton-X溶液透化处理，并用1%牛血清白蛋白（BSA）封闭非特异性结合位点。神经元细胞使用抗β-tubulin III抗体（FITC标记，绿色）染色，SC-like ASC使用抗S-100抗体（AlexaFluor568标记，红色）染色。最后，细胞核用DAPI染色（蓝色）。图像使用荧光显微镜（Olympus BX60，日本）采集。（经de Luca et al.30许可重印。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多孔支架上细胞黏附的扫描电镜分析；显微照片突出显示细胞形态。" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 不同培养条件下背根神经节（DRG）神经元的扫描电镜（SEM）图像。 (A) 未经处理的PCL薄膜；(B) RGD修饰的PCL薄膜；(C) 在未经处理的PCL薄膜上与类施万细胞表型的脂肪源性干细胞（SC-like ASC）共培养；(D) 在RGD修饰的PCL薄膜上与SC-like ASC共培养。黄色箭头指示SC-like ASC与DRG之间的接触点，证实了共培养系统中两者存在直接相互作用。细胞在培养条件下维持3天后，用2.5%戊二醛固定。经梯度乙醇脱水（50%、70%、90%、100%）后，细胞最终用六甲基二硅氮烷冲洗并干燥，随后固定于样品台并进行金溅射处理，用于SEM分析。图像使用扫描电镜（Zeiss EVO60，英国）在10 kV加速电压下获取。（经de Luca et al.30许可重印。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

背根神经节（DRG）是包含周围神经系统感觉神经元的结构。经分离后，可与类似施万细胞的脂肪源性干细胞（ASC）进行共培养，从而为研究提供有价值的模型 体外 神经再生与髓鞘化，模拟 体内 损伤部位的微环境

背根神经节（DRG）神经元位于脊柱椎间孔内，可用于构建一种体外系统，以促进……

本实验的总体目标是建立脂肪来源干细胞与背根神经节（或称DRG神经元）的共培养体系，用于体外研究神经再生。首先从大鼠脂肪组织中获取未分化的脂肪来源干细胞；第二步，利用多种生长因子的混合物将这些细胞诱导分化为类似施万细胞的表型。接下来，从大鼠脊髓中分离背根神经节（DRG）神经元，并在最后一步中将这些神经元接种到已分化的干细胞上，以建立体外共培养系统。最终，对细胞进行神经元和胶质细胞标记物染色，以促进神经突生长并进行定量分析，同时通过扫描电子显微镜成像以评估其形态学特征。该方法有助于回答再生医学领域的不同问题，例如脂肪来源的干细胞在不同生物材料上如何与背根神经节神经元相互作用？该方法的演示至关重要，因为该操作涉及在生物安全柜中进行的步骤，而由于组织可及性低且体积微小，这些步骤难以掌握。首先，使用剪刀和无菌剃须刀片将从成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠中获取的内脏脂肪和腹股沟脂肪精细切碎，直至形成均匀的糊状物。接着，将所得脂肪悬液转移至含有 15 毫升 freshly prepared 过滤除菌的 I 型胶原酶溶液的离心管中，并将离心管置于 37°C 水浴中，在持续震荡条件下消化 30 至 60 分钟。密切观察消化过程，在组织完全解离之前停止消化，以提高细胞活力和得率。当组织消化至理想状态时，通过100微米细胞滤网过滤。良好的消化结果应呈现均一的脂肪状质地，轻柔晃动时呈米白色。用 15 毫升添加了 FBS 的 37 摄氏度干细胞生长培养基中和消化酶。然后离心细胞以收集基质血管组分。从脂肪的顶层开始吸弃上清液。用移液器将沉淀物重悬于1毫升红细胞ISIS缓冲液中。1分钟后，加入10毫升新鲜培养基终止裂解，并再次离心收集细胞。然后小心吸除上清液S。将细胞重悬于10毫升培养基中，并将细胞接种至75平方厘米的培养瓶中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养。保持细胞处于亚融合状态，直至第一代或第二代传代，此时可通过β-巯基乙醇和视黄酸处理，使细胞分化为类施万细胞，从而在收获脊髓后获得背根神经节神经元。首先去除所有背部组织，然后使用无菌且锋利的手术剪沿纵轴将脊柱切成两半，暴露脊髓组织。在肋骨下方水平将脊柱切成两个较小的节段，然后用精细镊子轻轻取出全部脊髓组织。注意不要牵拉和移除背根神经节（DRG）根部，这些结构呈白色细丝状，直接从椎管中发出。当所有核心组织被完全移除后，使用极细的镊子轻轻牵拉整个背根神经节（DRG）根部，深入椎间孔通道，注意避免损伤神经节的根部。将背根神经节置于一个60平方毫米的培养皿中，内含3至4毫升添加了抗生素的Hams F12培养基。随后在解剖显微镜下，使用无菌镊子和手术刀清除环绕神经节的多余神经根，以减少卫星细胞的污染。接下来，将背根神经节转移至一个含有1.8毫升新鲜F12培养基的35平方毫米培养皿中，并加入200微升IV型胶原酶储备液。将背根神经节孵育1小时，然后用玻璃移液管小心吸除培养基。注意操作时不要吸出或损伤背根神经节（DRG）。重复胶原酶处理步骤，并用F12培养基洗涤DRG。第二次洗涤后，向细胞中加入1.8毫升F12培养基和200微升胰蛋白酶。去除胰蛋白酶，并加入一毫升添加了500微升胎牛血清（FBS）的培养基以终止酶促反应。然后吸除培养基，并用F12培养基轻轻冲洗背根神经节（DRG）三次，以彻底去除血清残留。接着，加入两毫升新鲜F12培养基重悬细胞，并使用玻璃移液管小心地将细胞悬液转移至15毫升离心管中。轻柔吹打8到10次以解离神经元，然后静置使腭组织沉降到管底。将上清液转移至新管中，并向腭组织中加入2毫升新鲜F12培养基。重复进行机械解离并转移培养基，直至悬浮液变得均匀。然后将细胞悬液反复吹打重悬3至4次，随后通过100微米细胞滤网过滤，将所得的匀浆悬液收集至新的50毫升离心管中。将细胞在15毫升离心管中离心，当离心机处于缓慢旋转时，用移液器沿45度倾斜放置的15毫升离心管内壁缓缓加入新配制的15%牛血清白蛋白，以形成渐变的蛋白梯度。以离心管上的数字作为成形轨迹的参考，然后吸出细胞中的上清液，保留最后500 µL用于重悬，悬浮细胞沉淀，并沿蛋白轨迹缓慢将细胞滴加至新的离心管中。离心后再次将细胞沉淀重悬于1 mL改良BS培养基中，并用少量培养基接种细胞。在24孔板中孵育2小时，待细胞贴壁后，加入新鲜的BS培养基，该培养基中添加15 ng/mL神经生长因子，并在解离后继续培养。将DRG细胞接种于预先接种的细胞之上，也可用于与施万细胞样脂肪干细胞进行共培养。这些图像展示了在采用聚己内酯薄膜作为基底的共培养模型中，施万细胞样脂肪干细胞对DRG神经突起生长的重要作用。在未处理的表面且缺乏施万细胞样脂肪干细胞的情况下，未观察到神经突起的形成；而在共培养体系中，神经突起的形成明显改善。平均而言，在干细胞存在的情况下，每个细胞体的神经突数量显著增加。事实上，正如这些图像所示，背根神经节（DRG）神经元出芽形成神经突的能力更倾向于与已分化的干细胞共同发生，如玫瑰红色箭头所指示。因此，在观看本视频后，您应能够获得源自干细胞的细胞，并分离DRG神经元。但你也应该能够建立一个模型，用于研究外周平均变性。

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背根神经节神经元和区分脂肪干细胞：一种<em&gt;在体外</em&gt;共培养模型来研究周围神经再生

本文描述了一种利用培养的成年小鼠背根神经节神经元进行轴突再生遗传学研究的体外模型。该方法包括重新悬浮和再接种步骤，以允许经历遗传操作的神经元重新生长轴突。该策略对于利用基于RNA干扰的蛋白敲低技术进行轴突再生的缺失功能研究尤为有用。...

成年背根神经节神经元培养体系中的轴突再生遗传学研究

本视频演示了一种利用分离的小鼠背根神经节（DRG）组织建立背根神经节或DRG组织块培养及DRG分离细胞模型的方法。这些模型有助于在受控环境中研究涉及神经元-胶质细胞相互作用的多种机制。...

生成背根神经节外植体及解离细胞培养

本视频展示了一种从背根神经节（DRG）中分离神经元的方法。从大鼠脊柱分离背根神经节（DRG），经酶处理后，通过机械解离获得单细胞悬液。利用密度梯度离心法将神经元与胶质细胞分离，并在生长培养基中进行培养。...

一种用于神经元培养的背根神经节收获与解离技术

本视频展示了背根神经节外植体与施万细胞的共培养模型。在共培养条件下，抗坏血酸可促进施万细胞向髓鞘形成细胞分化。髓鞘形成施万细胞会多次包裹轴突，形成髓鞘，这对神经功能至关重要。...

背根神经节外植体与施万细胞共培养以实现神经元髓鞘化

本方案介绍了一种在成年大鼠中通过背根神经节（DRG）注射病毒载体并同时造成背根 crush...

背根神经节注射与背根挤压损伤作为感觉轴突再生的研究模型

本报告重点介绍了利用小鼠背根神经节的器官型培养和分离的原代培养体系，以研究与神经元-胶质细胞相互作用、神经可塑性、神经炎症以及对病毒感染反应相关的多种机制。...

成年小鼠背根神经节外植体与分离细胞模型用于研究神经可塑性及对包括病毒感染在内的环境损伤的反应

背根神经节（DRG）原代培养常用于研究感觉神经元中的生理功能或与病理相关的过程。本文中，我们展示了利用腰段DRG培养物，在使用选择性激动剂刺激神经肽FF受体2型后，检测神经递质释放的方法。...

背根神经节的分离与原代培养以研究神经递质释放

我们提出一种体外模型，用于评估嗅鞘施万细胞（OEG）在神经损伤后的神经再生能力。该模型基于将成年视网膜神经节细胞（RGN）的轴突切断后，与OEG单层细胞共培养，并通过分析RGN轴突及胞体-树突标志物，进而研究轴突再生情况。...

轴突切断的大鼠视网膜神经节细胞与嗅鞘施万细胞共培养，作为成年神经元轴突再生的体外模型

在背根神经节与施万细胞的共培养体系中，可以研究周围神经系统的髓鞘形成。该模型为观察和量化周围髓鞘化过程，以及研究感兴趣化合物对髓鞘影响提供了实验机会。...

大鼠背根神经节外植体与施万细胞共培养体系中周围神经轴突的体外髓鞘化

本方案提供了一种从成年Sprague...

收获、包埋及在多区室装置中培养背根神经节以研究外周神经元特征

本方案描述了建立小鼠背根神经节（DRG）全组织培养和分散培养的方法，以及利用这些培养系统评估肿瘤-神经相互作用的应用。...

建立 体外 背根神经节培养模型：探究癌症-神经相互作用的互补方法

了解背根神经节神经元与脂肪干细胞共培养技术，用于研究周围神经再生机制。该方法通过体外模型分析神经突生长及细胞相互作用，为再生医学提供重要实验基础。

背根神经节神经元与分化后的脂肪源性干细胞：一种体外共培养模型用于研究周围神经再生

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背根神经节神经元与分化后的脂肪源性干细胞：一种 体外 共培养模型用于研究周围神经再生

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