背根神经节神经元和区分脂肪干细胞：一种在体外共培养模型来研究周围神经再生

背根神经节（DRG）是含有外周神经系统的感觉神经元的结构。当解离，它们可以是共培养的SC状脂肪来源的干细胞（ASC），提供了一个有价值的模型来研究在体外神经再生和髓鞘形成，模仿体内环境在损伤部位。

该程序的总体目标是建立脂肪来源的干细胞和背根神经节或 DRG 神经元共培养物，用于研究体外神经再生。这是通过首先从大鼠脂肪组织获得未分化的脂肪来源干细胞来实现的。在第二步中，使用生长因子混合物将细胞分化成 schwan 样细胞。

接下来，从大鼠脊髓中收获 DRG 神经元并在最后一步中进行关联，将神经元固定在分化的干细胞上以产生体外共培养系统。最终，对细胞进行神经元和神经胶质标志物染色，以促进神经突生长、定量并通过扫描电子显微镜成像以进行形态学评估。这种方法可以帮助回答再生医学领域的不同问题，例如脂肪正确的干细胞如何与不同生物材料上的 ug 有机神经元相互作用？

的演示至关重要，因为这涉及由于可及性低和组织尺寸小而难以学习的步骤 在生物柜中。首先使用一把剪刀和无菌剃须刀片将从成年雄性 spro dolly 大鼠身上收获的内脏和腹股沟脂肪精细地切成细稠度。接下来，将所得脂肪浆液转移到装有 15 毫升新鲜制备的过滤器、消毒的 1 型胶原酶溶液的试管中，并将试管放入 37 摄氏度的水浴中，连续搅拌 30 至 60 分钟。

在组织完全解离之前密切监测消化，以提高细胞活力和产量。组织准备好后，通过 100 微米的细胞过滤器过滤。良好的消化将导致均匀的脂肪稠度，在柔和的漩涡中呈米色。

用 15 毫升补充有 FBS 的 37 摄氏度干细胞生长培养基中和消化酶。然后旋转细胞以收集基质血管部分。从脂肪的顶层开始吸出旋囊。

用移液将沉淀重悬于一毫升红细胞 ISIS 缓冲液中。1 分钟后，向细胞中加入 10 mL 新鲜培养基并再次离心以停止裂解。现在小心吸出 S 上清液。

细胞重悬于 10 毫升培养基中，并将细胞接种在 75 平方厘米处。烧瓶温度为 37 摄氏度和 5% 二氧化碳。将细胞维持在亚汇合水平，直到第一次或第二次传代，此时细胞准备好通过用 β more cap、乙醇和视黄酸处理分化成 schwan 样细胞，以在收获脊髓后获得 DRG 神经元。

首先去除任何背侧部分，然后使用无菌和锋利的手术剪刀沿纵轴将脊柱一分为二，露出脊髓组织。将脊柱切成肋骨水平以下的两个较小的段，然后用细镊子轻轻去除所有脊髓组织。注意不要拉扯和去除 DRG 根，DRG 根看起来像直接从根管中伸出的白色细丝。

去除所有核心组织后，使用非常细的镊子拉动整个 DRG 根部，深入垂直管，注意不要损坏神经节的根部。将 DRG 放入一个 60 平方毫米的宠物树培养皿中，其中含有 3 至 4 毫升补充有抗生素的火腿 F 12 培养基。然后在解剖显微镜下，使用无菌镊子和手术刀清除神经节周围任何多余的神经根，以减少卫星细胞污染。

接下来，将 DRG 转移到含有 1.8 毫升新鲜 F 12 培养基的 35 平方毫米培养皿中，并加入 200 微升胶原酶。键入 4 储备溶液。将 DRG 孵育 1 小时，然后用玻璃移液管小心吸出培养基。

注意不要吸入或损坏 DRG。重复胶原酶步骤，用 F 12 培养基洗涤 DRG。第二次洗涤后，向细胞中加入 1.8 毫升 F 12 培养基和 200 微升胰蛋白酶。

去除胰蛋白酶并加入 1 毫升补充有 500 μL FBS 的培养基以阻止酶促反应。然后吸出培养基，用 F 12 培养基轻轻洗涤 DRG 3 次，以去除血清的所有痕迹。现在用 2 毫升新鲜的 F 12 培养基喂养细胞，并使用玻璃移液器小心地将细胞悬液转移到 15 mL 试管中。

上下移液 8 到 10 次以轻轻分离神经元，然后在上颚稳定下来时让上颚积聚在管底部。将旋腹转移到新管中，向上颚中加入 2 毫升新鲜的 F 12 培养基。重复机械解离和将培养基转移到悬浮液中变得均匀。

然后，将细胞悬液重新分级 3 到 4 次，然后通过 100 微米细胞过滤器将所得匀浆悬浮液过滤到新的 50 mL 试管中。在 15 毫升试管中离心细胞，同时缓慢旋转，移液新鲜制备的细胞。15% 牛血清白蛋白沿 15 mL 试管内侧流动，保持 45 度角，形成逐渐的蛋白质轨迹。

使用试管上的数字作为形成轨迹的参考，然后从细胞中吸出 snat，节省最后 500 微升用于复苏，悬浮沉淀并沿着蛋白质轨迹缓慢分配细胞到新试管中。离心细胞后，再次将沉淀重悬于 1 毫升改良的 BS 培养基中，并将细胞接种在少量培养基中。在 24 孔板中放置 2 小时，当细胞附着后，加入新鲜的 BS 培养基，每毫升补充 15 纳克神经生长因子。

DRG 细胞还可用于与天鹅细胞样脂肪干细胞共培养，方法是将它们接种在种子前细胞的顶部。这些图像证明了 schwan 细胞样脂肪干细胞对 DRG 神经突发芽的重要性，在以聚己内酯膜为底物的共培养模型中。在没有天鹅细胞样脂肪干细胞的情况下，在未经处理的表面上没有观察到神经突，而在共培养系统中神经突的形成明显改善。

平均而言，在干细胞存在的情况下，每个细胞体的神经突数量显着增加。事实上，正如这些图像所示，DRG 神经元发芽神经元的能力优先与分化的干细胞一起发生，如黄色箭头玫瑰所示。所以看完这个视频后，现在应该能够获得 lib 衍生的干细胞并解离 DGen 神经元。

但您还应该能够建立一个模型来研究外周平均变性。