Name: 体外 富含透明质酸的细胞外基质对神经嵴细胞迁移的影响研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学习体外迁移实验方法，用于研究神经嵴细胞在富含透明质酸的细胞外基质中的粘附与迁移行为。该技术可评估细胞群体及单个细胞的透明质酸降解能力，并支持药物筛选。

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我衷心感谢 Fumitoshi Irie 和 Yu Yamaguchi 在建立本方法过程中给予的鼓励和宝贵建议。本研究得到了日本促进科学协会科研资助项目（Japan Society for the Promotion of Science）的资助（T.I. 项目编号 #19KK0232，T.I. 项目编号 #20H03896）。&#160;在玻璃基底上包被透明质酸（HA）以及在基底上进行原位 HA 降解检测的原始方法见 Yamamoto 等人（2017）8，而 HA/Col1 混合基底的制备方法见 Irie 等人（2021）7。

所有实验程序均经大阪大学牙科研究生院动物伦理委员会批准。
1. 小鼠颅神经嵴细胞的培养
注意：本研究中使用的神经嵴细胞系为 O9-1 细胞，最初来源于从 E8.5 小鼠胚胎中分离的 Wnt1-Cre；R26R-GFP 表达细胞12（见讨论部分）。此处所述的 O9-1 细胞培养方法遵循先前建立的方案13。
<ol>
	<li>准备包被基底膜基质的培养板。
	<ol>
		<li>将基底膜基质（参见 材料表）置于冰上解冻。用预冷的1×PBS按1:50稀释基质，并保持在冰上。</li>
		<li>用10 mL稀释后的基底膜基质溶液包被一个10 cm培养皿。室温孵育1小时，使用前吸除基质溶液。</li>
		<li>用2 mL PBS洗涤培养皿3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在包被基底膜基质的培养板上培养O9-1细胞。
	<ol>
		<li>将完全胚胎干细胞（ES）培养基（参见 材料表）在37 °C水浴中预热。</li>
		<li>轻轻混匀O9-1细胞悬液（参见 材料表），使用自动细胞计数仪（参见 材料表）计数细胞数量。用完全ES细胞培养基将细胞浓度调整至1.1 × 106/mL。</li>
		<li>向包被基质的10 cm培养皿中加入8 mL预热的完全ES细胞培养基，并以每皿1.1 × 106个细胞的密度接种O9-1细胞。在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育。</li>
		<li>次日，更换为新鲜的完全ES细胞培养基（预热至37 °C）。此后每2–3天更换一次新鲜培养基。 
		注意：当细胞融合度达到约80%（接种后3–4天），可用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，进行传代或冻存以备后续使用。O9-1细胞的代表性图像见 图1。</li>
		<li>胰酶消化前，用2 mL 1×PBS洗涤培养皿。加入2 mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育5分钟。检查细胞是否完全脱落；必要时可轻敲培养皿侧壁数次。</li>
		<li>向培养皿中加入2 mL预热的完全ES细胞培养基，将消化后的细胞转移至15 mL锥形管中。以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。然后向管中加入2 mL预热的完全ES细胞培养基，通过移液彻底重悬细胞。按所需细胞密度将细胞接种至新的培养皿中。</li>
		<li>或者，可将细胞沉淀用1 mL含10%二甲基亚砜（DMSO）的细胞冻存液代替完全ES细胞培养基重悬，充分混匀后转移至冻存管中，于−80 °C保存，制备冷冻细胞储备。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. HA/Col1 包被培养皿的制备
注意：在玻璃底培养皿上包被 HA/Col1 的原始方法由 Irie 等人提出7。
<ol>
	<li>在3.5 cm玻璃底培养皿中小心加入50 µL未稀释的三乙氧基硅烷（参见材料表）。室温（RT）避光孵育5分钟。 
	注意：三乙氧基硅烷的孵育时间不应超过5分钟，否则可能影响包被效率并产生不良产物。</li>
	<li>用2 mL蒸馏水快速洗涤3次。每皿加入50 µL以PBS稀释100倍的0.25%戊二醛，室温孵育30分钟。</li>
	<li>用2 mL PBS快速洗涤4次。随后每皿加入300 µL溶于0.2 N乙酸中的I型胶原蛋白，室温孵育1小时。</li>
	<li>用2 mL PBS快速洗涤3次。每皿加入300 µL溶于PBS的200 µg/mL荧光素胺标记的透明质酸钠-H2（FAHA-H2），室温孵育过夜。再次用2 mL PBS洗涤3次。吸除PBS后，在洁净台中将培养皿晾干5分钟。 
	&#8203;注意：FAHA-H2是一种荧光素胺标记的透明质酸钠，其平均分子量范围为1,200–1,600 KDa。可根据实验设计选用适当分子量的透明质酸（HA）。</li>
</ol>
3. HA/Col1包被培养皿上的迁移实验
注意：使用含有定义明确的500 µm无细胞间隙的Col1/HA基质进行基于伤口闭合的实验，该实验采用2孔培养插件（参见材料表）。O9-1细胞表达Tmem2，该蛋白对于细胞外空间中HA的黏附和降解至关重要9（图2和图3）。
<ol>
	<li>干燥包被的玻璃底培养皿后，将2孔培养插件固定于培养皿上，并在插件外部加入1 mL PBS。</li>
	<li>将O9-1细胞以每孔1 × 10⁵个的密度接种至孔板中4 每孔加入含2%胎牛血清（FBS）的100 µL达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM），接种细胞。于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2天。2 加湿培养箱</li>
	<li>用镊子小心地从包被的玻璃底培养皿中取出插件。用 2 mL 1× PBS 轻柔清洗包被的玻璃底培养皿，以去除细胞和细胞碎片。向培养皿中加入 2 mL 含 2% FBS 的新鲜 DMEM。</li>
	<li>现在使用一体式荧光显微镜在单色模式下以高分辨率设置（增益为6 dB，无像素合并）采集相差图像作为起始时间点。本研究中采用4x至20x放大倍数的物镜进行成像（参见 材料表). 
	注意：使用相应的比例尺拍摄相差图像，并以TIFF格式保存。</li>
	<li>在37 °C和5% CO₂条件下继续培养细胞48小时2使用一体式荧光显微镜在培养24 h和48 h时拍摄相差图像。</li>
	<li>在室温下用1 mL 4%多聚甲醛（PFA）固定细胞48小时，固定15分钟，或在4 °C下过夜。随后，用1 mL新鲜PBS洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤3次。</li>
	<li>放置盖玻片并加入封片剂（参见 材料表）以进行进一步的形态学观察。 
	注意：培养皿可立即成像，或在 4 °C 下保存长达 2 个月。</li>
	<li>可选：对细胞进行目标蛋白的免疫标记。 
	注意：本方案旨在使用小鼠来源的单克隆抗vinculin抗体检测黏着斑（focal adhesion, FA）复合物（参见 材料表) 在此作为示例进行描述。
	<ol>
		<li>将培养皿（来自步骤3.6）与0.5 mL封闭缓冲液（含5%正常山羊血清的PBS）于室温孵育60分钟。 
		注意：为一抗选择合适的封闭缓冲液。典型的封闭缓冲液为含有5%正常血清的溶液，该血清应与二抗来源物种相同。</li>
		<li>在抗体稀释缓冲液（含1%正常山羊血清的PBS）中配制稀释的一抗。每孔加入0.5 mL稀释后的一抗，4 °C条件下孵育过夜。 
		注意：选择合适的抗体稀释缓冲液。通常，抗体使用稀释比例为1:50至1:200。</li>
		<li>用 2 mL PBS 每次 5 分钟，清洗 3 次。在抗体稀释缓冲液（含 1% 正常山羊血清的 PBS）中配制稀释的山羊来源抗小鼠二抗。每皿加入 0.5 mL 稀释的二抗，室温孵育 1–3 小时。 
		注意：通常，二抗的使用稀释比例为1:500–1:1,000。DAPI可用于细胞核染色。</li>
		<li>用 PBS 清洗 3 次，每次 2 mL，每次 5 分钟。在盖玻片上加入 50 µL 封片介质。 
		注意：可使用一体式荧光显微镜，配备GFP滤光片（激发光：470/40，发射光：525/50）和TexasRed滤光片（激发光：560/40，发射光：630/75），在单色模式下以高分辨率设置（增益6 dB，无像素合并）对培养皿进行成像。本研究中使用的物镜放大倍数为4x至20x。 
		&#8203;注意：载玻片可在 4 °C 下保存长达 2 个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>打开 ImageJ 1.51s 软件。在 ImageJ 窗口中，从菜单栏选择 文件 &#62; 打开，以打开已保存的图像文件。</li>
	<li>为设置测量尺度，绘制一条与比例尺长度相同的直线。进入 分析 &#62; 设置 尺度，在 设置尺度 窗口的相应输入框中输入该直线的已知距离和单位。</li>
	<li>在细胞间隙之间绘制一条直线，然后按 分析 &#62; 测量，将测量值传输至数据窗口。对每个样本至少测量五个不同位置，并对距离取平均值，以获得具有代表性的样本数据。使用适当的软件进行统计分析（参见 材料表）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

多种细胞外基质（ECM）成分调控神经嵴细胞（NCC）的迁移。例如，透明质酸（HA）对NCC迁移具有正向调控作用2,15。有趣的是，基于Tmem2（一种细胞表面透明质酸酶）基因小鼠模型的研究揭示了HA降解在NCC迁移过程中的必要性9。胶原蛋白在神经管周围ECM中也十分丰富16。研究表明，小型富含亮氨酸的蛋白聚糖——核心蛋白聚糖（decorin）在神经发育过程中调控NCC的迁移17。其他ECM成分，如层粘连蛋白（laminin）和纤连蛋白（fibronectin），也影响NCC的黏附与迁移18。然而，各类ECM成分在NCC迁移中的具体作用仍不明确。
的 体外 本文所述模型旨在研究迁移中的神经嵴细胞（NCCs）在遇到富含透明质酸（HA）的细胞外基质（ECM）时的行为...

神经嵴细胞（NCCs）是一类存在于发育中胚胎的多能细胞群体，起源于神经管形成过程中的神经板边缘。它们参与多种组织的形成，包括周围神经系统、心血管系统、颅面组织以及骨骼1。在神经板边缘发生诱导并确定神经嵴细胞命运后，神经嵴细胞从神经上皮迁移而出，向其衍生组织部位迁移1。
透明质酸（HA）是一种非硫酸化的糖胺聚糖，作为细胞外基质（ECM）的组分广泛分布于多种组织中。在模式系统中，通过敲除透明质酸代谢相关基因，已证实HA在胚胎发育过程中的重要性。例如，在非洲爪蟾（Xenopus）中，透明质酸合成酶基因（Has1 和 Has2）的突变会导致神经嵴细胞（NCC）迁移缺陷以及颅面畸形2。此外，已报道HA结合型蛋白聚糖聚集蛋白聚糖（aggrecan）和多功能蛋白聚糖（versican）对NCC的迁移具有抑制作用3。在小鼠中，Has2基因的缺失会导致心内膜垫形成严重缺陷，从而引起中期妊娠（E9.5–10）致死4,5,6。
跨膜蛋白2（Tmem2）是一种细胞表面透明质酸酶，最近被证明可通过清除黏附位点处基质相关的透明质酸（HA），在促进整合素介导的癌细胞黏附和迁移中发挥关键作用7,8. 近期，Inubushi 等人9 表明缺乏&#160;Tmem2 会导致严重的颅面畸形，这是由于神经嵴细胞迁移/移动及存活异常所致。在之前的研究中9在神经嵴细胞（NCC）形成和迁移过程中分析了Tmem2的表达。在NCC去附着部位以及迁出的Sox9阳性NCC中均观察到Tmem2的表达（图1）。此外，使用 Tmem2-耗竭的小鼠O9-1神经嵴细胞，该研究证明了 体外 表达 Tmem2 对O9-1细胞形成黏着斑并迁移至含透明质酸的基质中至关重要（图2 和 图3)9.
这些结果强烈表明，Tmem2 在富含透明质酸（HA）的细胞外基质（ECM）中对神经嵴细胞（NCC）的黏附和迁移同样具有重要作用。然而，神经嵴细胞在富含透明质酸的细胞外基质中黏附与迁移的分子机制仍不明确。因此，有必要建立一种 体外 利用培养实验系统，充分探究神经嵴细胞在富含透明质酸的细胞外基质中的黏附与迁移行为。
在众多用于检测细胞迁移的方法中，基于细胞伤口闭合的检测法是一种在生理学和肿瘤学领域中常用且简便的方法10该方法因其与相关性而具有实用价值 体内 表型，并可有效确定药物和趋化因子在细胞迁移过程中的作用11通过随时间测量细胞间隙距离，可以评估整体细胞团和单个细胞的迁移能力11. 在本文中，一种经过改进的 体外 基于伤口闭合的实验方法被用于模拟神经嵴细胞向富含透明质酸的神经管周围组织的迁移过程。该方法同样适用于研究不同细胞外基质成分（如胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白），以分析细胞外基质支架在神经嵴细胞迁移中的作用。

<table><tbody><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>CORNING</td><td>Cat. 353003</td><td></td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>Millipore</td><td>Cat. No. BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>2 孔细胞培养插件</td><td>ibidi</td><td>Cat. No. 80209</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 标记的山羊抗小鼠 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. A21422</td><td>来源于山羊的抗小鼠二抗</td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. No. TC20</td><td></td></tr><tr><td>CELLBANKER</td><td>ZENOGEN PHARMA</td><td>Cat. 11910</td><td>细胞冻存液</td></tr><tr><td>I 型胶原蛋白</td><td>Sigma</td><td>Cat. No. 08-115</td><td></td></tr><tr><td>完全 ES 细胞培养基</td><td>Millipore</td><td>Cat. No. ES-101-B</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. 10184322</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>Cat. 11971025</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>Cat. 10270106</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Keyence</td><td>Cat. No. BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>荧光标记的透明质酸</td><td>PG Research</td><td>FAHA-H2</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>Iwaki</td><td>Cat. 11-0602</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma</td><td>Cat. No. G5882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher</td><td>Cat. No. CB-40234</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>单克隆抗连环蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>Cat. No. V9264</td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Fisher</td><td>Cat. 50062Z</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 细胞</td><td>Millipore</td><td>Cat. No. SCC049</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>Cat. 158127</td><td></td></tr><tr><td>三乙氧基硅烷</td><td>Sigma</td><td>Cat. No. 390143</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Millipore</td><td>Cat. No. SM-2003-C</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 透明质酸富集的细胞外基质对神经嵴细胞迁移影响的研究

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

神经嵴细胞（NCCs）是一类起源于神经管背侧区域的高度迁移性细胞。NCCs从神经管迁移而出是其生成及向靶向部位迁移的关键过程。NCCs的迁移路径及其周围的神经管组织包含富含透明质酸（HA）的细胞外基质。为模拟NCCs从神经管向富含HA的周围组织迁移的过程，本研究建立了一种由HA（平均分子量：1,200–1,400 kDa）与I型胶原蛋白（Col1）组成的混合基质迁移实验。该迁移实验表明，NCC细胞系O9-1细胞在混合基质上具有高度迁移能力，并且在迁移过程中，细胞黏着斑部位的HA涂层被降解。 体外 该模型可用于进一步探索神经嵴细胞迁移的机制基础。本方案也可用于评估不同基质作为支架以研究神经嵴细胞迁移。

采用本方案所述方法，在由Col1和高分子量HA（平均分子量：1,200–1,400 kDa）组成的混合基质上进行了迁移实验。位于缺口边缘的O9-1细胞可迅速迁入富含HA的缺口区域（图4）。对黏着斑标志物vinculin进行免疫染色14，结果证实O9-1细胞在HA降解位点处形成了黏着斑（FAs）（图5）。
<img alt="E9.0 胚胎切片，TMEM2 和 Sox9 表达，免疫荧光显微镜示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64749/64749fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：NCCs 中的 TMEM...

本方案概述了一种 体外 适用于参与迁移实验的分子功能分析 体内 神经嵴细胞向富含透明质酸的细胞外基质迁移。

神经嵴细胞（NCCs）是一类起源于神经管背侧区域的高度迁移性细胞。神经嵴细胞从神经管迁移而出的过程……

透明质酸是动物模型中最丰富的细胞外基质之一。已有研究证明透明质酸在胚胎发育中的重要性。该体外模型可用于探索神经嵴细胞如何在富含透明质酸的细胞外基质中黏附和迁移。利用我们的技术，可以随时间评估整个细胞群体以及单个细胞的迁移能力和透明质酸（HA）降解能力。此外，该技术还可用于药物筛选，以发现能够加速或抑制HA降解的化合物。实验开始时，将基底膜基质用预冷的PBS按1:50的比例稀释，并置于冰上保存。用10毫升稀释后的基质溶液包被一个10厘米的培养皿，并在室温下孵育1小时。用2毫升PBS洗涤培养皿三次。为了在基质包被的培养皿上培养O9-1细胞，将完全胚胎干细胞（ES细胞）培养基在37摄氏度的水浴中预热。轻轻混匀O9-1细胞悬液，使用自动细胞计数仪计数细胞数量。然后用完全ES细胞培养基将细胞浓度调整至每毫升110万个细胞。向预先包被的10厘米培养皿中加入8毫升预热的完全ES细胞培养基，并按每皿110万个细胞的密度接种O9-1细胞。在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。次日，更换为预热至37摄氏度的新鲜完全ES细胞培养基。此后每两到三天更换一次新鲜培养基。用两毫升 PBS 清洗培养板，然后加入两毫升预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。在 37 摄氏度下孵育五分钟。向培养板中加入两毫升预热的完全 ES 细胞培养基，将解离的细胞转移至 15 毫升锥形管中。将离心管在300g条件下离心5分钟，弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。向管中加入2毫升预热的完全ES细胞培养基，通过移液彻底重悬细胞。然后按所需细胞密度将细胞接种至新的培养皿中。在避光条件下，向一个3.5厘米的玻璃底培养皿中小心加入50 µL未稀释的三乙氧基硅烷，并在室温下孵育5分钟。用2 mL蒸馏水洗涤培养皿三次，然后每皿加入50 µL用PBS稀释100倍的0.25%戊二醛溶液。室温孵育30分钟后，用2 mL PBS洗涤四次，并在室温下用300 µL溶于0.2 N乙酸中的I型胶原蛋白溶液覆盖培养皿，孵育1小时。再次用2 mL PBS洗涤三次。每皿加入300 µL浓度为200 µg/mL的荧光素胺标记的透明质酸钠H2，在室温下孵育过夜。再用2 mL PBS洗涤三次。干燥包被后的玻璃底培养皿后，将两个带孔的培养插件固定于培养皿中，并在插件外部加入1毫升PBS。将O9-1细胞以每孔10,000个细胞的密度接种至插件内，每孔加入含2%胎牛血清（FBS）的100微升DMEM培养基。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中培养两天，使用一体化荧光显微镜采集相差图像作为起始时间点。用镊子小心地从包被的玻璃底培养皿中取出插入物，并用两毫升 PBS 轻柔洗涤包被的玻璃底培养皿，以去除细胞和细胞碎片。向培养皿中加入两毫升含 2% FBS 的新鲜 DMEM。在 37 °C 和 5% 二氧化碳条件下继续培养 48 小时，并在培养 24 小时和 48 小时后采集相差显微图像。用 PBS 清洗培养皿，随后在 48 小时后加入 1 毫升 4% 多聚甲醛，在室温下固定细胞 15 分钟，或在 4 摄氏度下过夜固定。然后用 1 毫升新鲜 PBS 洗涤培养皿三次，每次 5 分钟。最后，加入封片剂并加盖盖玻片，以进行进一步的形态学观察。本图展示了 E9.0 时期 Tmem2 flag 胚胎神经管的横切面。神经管头端和躯干部位的切片均经 Tmem2 flag 蛋白和透明质酸双标染色。Tmem2 在神经板及神经管边界区域有表达，而这些区域未见透明质酸染色信号。此处展示了神经嵴细胞中 Tmem2 flag 和 Sox9 的双重标记。对 E9.0 胚胎神经管的横切面进行了 Tmem2 flag 和 Sox9 染色。本图显示了在普通培养皿中培养的 Tmem2 耗竭和对照 O9-1 细胞的代表性图像。通过qPCR检测这些细胞中Tmem2的表达，以GAPDH作为内参进行标准化。将Tmem2敲低的O9-1细胞与对照O9-1细胞分别在荧光素标记的透明质酸包被的玻璃盖玻片上培养48小时。透明质酸降解活性在荧光背景下表现为暗区。在Tmem2耗竭的O9-1细胞与对照组O9-1细胞之间，也对透明质酸降解水平进行了定量比较。本图显示了O9-1细胞在黏着斑处对底物结合型透明质酸的降解情况。在由Col1/HA混合底物培养的O9-1细胞上，使用抗vinculin抗体进行了免疫标记。暗点或条带代表 FAHA H2 底物中透明质酸的降解活性。在混合底物上，透明质酸降解位点与黏着斑位置共定位。使用透明质酸（HA）共价包被玻璃底培养皿是本实验方案中的关键步骤，因为包被不充分可能导致透明质酸在细胞黏附和迁移过程中因机械力作用而轻易脱落。为了确保适当的包被，我们使用戊二醛通过醛基偶联将化学固定化的I型胶原蛋白连接到玻璃表面。除了I型胶原蛋白外，也可以使用其他细胞外基质底物，但这些底物必须具有偶联基团，并且由于其化学性质，可能在共价包被到玻璃底培养皿时存在一定的限制。因此，可能需要通过反复试验来确定最佳方案。该实验有助于研究特定分子在神经嵴细胞向透明质酸（HA）或神经管周围HA环境迁移过程中的作用机制。此外，该方法也可用于测试能够加速或抑制此迁移过程的药物。了解Tmem2为何同时具有介导细胞黏附于HA以及降解HA的功能，以及为何在完全黏附位点需要降解HA，具有重要的科学意义。由于透明质酸（HA）是细胞外基质中最常见的物质，因此阐明这一问题的答案在生物学和医学领域具有重要意义。该实验方案具有重要价值，因其可应用于多种细胞类型，包括皮肤成纤维细胞、上皮细胞和癌细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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