Summary
We beschrijven hier een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van Salmonella typhimurium-phagosomes van macrofagen bevattende coating van de bacteriën met biotine en daar.
Abstract
Salmonella typhimurium is een facultatief intracellulaire bacterie die gastro-enteritis bij mensen veroorzaakt. Na de invasie van de lamina propria, S. typhimurium bacteriën zijn snel gedetecteerd en phagocytized door macrofagen en in blaasjes bekend als phagosomes om te worden afgebroken. Isolatie van S. typhimurium-met phagosomes hebben op grote schaal gebruikt om te bestuderen hoe S. typhimurium infectie verandert het proces van rijping van het phagosome ter voorkoming van bacteriële afbraak. Klassiek, het isolement van de bacteriën-bevattende phagosomes is verricht door sacharose kleurovergang centrifugeren. Dit proces is echter tijdrovend, en vereist gespecialiseerde apparatuur en een zekere mate van beweeglijkheid. Hier beschreven is een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van S. typhimurium-phagosomes van macrofagen bevattende coating van de bacteriën met biotine-daar-geconjugeerde magnetische kralen. Phagosomes volgens deze methode verkregen kunnen worden opgeschort in een buffer van keuze, waardoor het gebruik van geïsoleerde phagosomes voor een breed scala van tests, zoals eiwitten, metaboliet, en lipide-analyse. Kortom, deze methode voor de isolatie van S. typhimurium-bevattende phagosomes is specifiek, efficiënte, snelle, vereist minimale apparatuur en is veelzijdiger dan de klassieke methode van isolatie door sacharose verloop-ultracentrifugatie.
Introduction
Macrofagen circuleren gespecialiseerde fagocytische cellen die detecteren, verzwelgen en degraderen van een buitenlandse deeltje in perifere weefsels, variërend van apoptotic cellen tot invasie van micro-organismen zoals bacteriën aanwezig. Oppervlakte receptor-gemedieerde erkenning van pathogen specifieke markers vaak aanwezig op het oppervlak van micro-organismen (bekend als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen of PAMPs) leidt macrofagen een complexe reorganisatie van cellulaire membraan in om te omringen en phagocytize van de pathogeen-1.
Het overspoeld pathogeen is vervolgens opgenomen door de macrofaag in een intracellulair vesikel bekend als phagosome. Door een reeks van kernfusie en kernsplijting evenementen met andere blaasjes zoals Endosomen en lysosomes verwerft de pathogeen-bevattende phagosome een reeks eiwitten die nodig zijn voor de afschaffing van de phagosomal inhoud. Daarom is de enzymatische samenstelling van de phagosome in de loop van dit proces, bekend als phagosome rijping2zeer variabel.
Kort na de fagocytose, de multimeric complexe vacuolar ATPase (v-ATPase) is opgenomen in het phagosome-membraan door fusie met Endosomen3. Dit complex maakt gebruik van ATP aan pomp protonen uit het cytosol naar het lumen van het phagosome4. Verzuring van de phagosome is essentieel voor de gebeurtenissen van de fusie met andere blaasjes5 en voor de activatie van een groot aantal pH-afhankelijke afbraakroutes enzymen6. Een ander multimeric enzymatische complex dat is snel gemonteerd op het phagosome-membraan is het complex van NADPH-oxidase (NOX). NOX complexe oxideert NADPH om te produceren van reactieve zuurstof soorten (ROS) die worden uitgescheiden in de phagosome lumen en die aanzienlijk bijdragen tot het doden van de overspoeld micro-organismen7.
Tijdens de eerste stappen van rijping presenteren phagosomes markeringen typisch zoals Rab5 en Rab7 van vroege en late Endosomen respectievelijk samen met de subeenheid0 V van de v-ATPase-8. Fusie van phagosomes met lysosomen en laat Endosomen resulteert in de blootstelling van de phagocytized pathogen aan een breed scala aan hydrolytische enzymen zoals β-galactosidase9cathepsin proteasen en lipasen. Verzuring van de lumen is ook vereist voor de activering van deze enzymen. Bijvoorbeeld, is het splijten van cathepsin D voor de productie van de actieve korte vorm pH-afhankelijke10. Deze enzymen degraderen van het pathogene agens en bemiddelen van de productie van pathogen afkomstige korte peptides, die door de macrofaag grote histocompatibility complex (MHC) klasse II moleculen naar T cellen activeren een adaptieve immuunrespons11gepresenteerd.
Vandaar, phagosome rijping is cruciaal voor de aangeboren immuunrespons en verbindt de aangeboren en adaptieve takken van het immuunsysteem. Het is geen verrassing dat de ziekteverwekkers geëvolueerd zijn strategieën om te overwinnen afschaffing door macrofagen door het hierboven beschreven proces van rijping van de phagosome. Bijvoorbeeld de intracellulaire bacteriën Mycobacterium tuberculosis en Legionella pneumophila voorkomen dat phagosome rijping remmende v-ATPase vergadering en daaruit voortvloeiende lumen verzuring met12,13 . Andere bacteriën, zoals Listeria monocytogenes of Shigella flexneri induceren porie vorming in het membraan van de phagosome te ontsnappen naar het cytosol14,15. Aan de andere kant, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) is het kundig voor wijzigen van de eigenschappen van de phagosome binnen de vacuole om te zetten in een geschikte locatie voor de replicatie-16. Dit vermogen maakt S. typhimurium een zeer interessant model te bestuderen van de pathogeen-gemedieerde inmenging van phagosome rijping.
S. typhimurium is een facultatief intracellulaire bacterie die gastro-enteritis bij mensen veroorzaakt. Na de invasie van de lamina propria, S. Typhimurium bacteriën zijn snel gedetecteerd en phagocytized door macrofagen en deel uitmaakt van phagosomes17. Sommige rapporten hebben eerder beschreven dat S. typhimurium-met phagosomes presenteren makers voor zowel Endosomen als lysosomen18, en andere studies hebben gevonden phagosome-lysosoom fusion voorkomen op S. Typhimurium infectie19.
In eerste instantie phagosome rijping op S. typhimurium infectie is onderzocht door immunofluorescentie microscopie. De ontwikkeling van technieken voor de isolatie van de bacteriën-bevattende phagosomes ingeschakeld een nauwkeuriger onderzoek van de inhoud van de phagosome in termen van endosome en lysosoom markers. Tot op heden, de belangrijkste methode die wordt gebruikt voor de isolatie van de bacteriën-bevattende phagosomes is de subcellular fractionering op sacharose stap verlopen18,20. Deze methode vereist echter meerdere centrifugeren stappen die kunnen leiden tot mechanische schade aan phagosomes, kunnen invloed hebben op de stabiliteit van de phagosomal componenten (eiwitten en lipiden) en tijdrovend is. Bovendien, het vereist het gebruik van een ultracentrifuge: een stuk van gespecialiseerde apparatuur die niet toegankelijk zijn voor elke laboratorium.
Onlangs, een nieuwe aanpak is toegepast op de isolatie van bacteriële-bevattende phagosomes, waarin de bacteriële pathogenen worden aangeduid met biotinyleerd lipopetide (Lipobiotin) en later geëxtraheerd met behulp van streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen21 . Wij stellen een alternatieve complementaire methode door het labelen van bacteriële oppervlakte amine-bevattende macromoleculen met NHS-Biotine gevolgd door daar-geconjugeerde magnetische kralen. Phagosomes volgens deze methode verkregen zijn hoogverrijkt in endosome en lysosoom markers en kunnen worden gebruikt voor een breed scala van tests, uit eiwit analyse omics analyse. Bovendien, vereist het geen gespecialiseerde apparatuur zoals ultracentrifuges. Bovendien, door het elimineren van de stappen van centrifugeren, zowel de mechanische schade aan phagosomes en de hoeveelheid tijd werkzaam zijn aanzienlijk kleiner zijn. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor de isolatie van de phagosomes met andere bacteriën, zoals de gram-positieve bacteriën Staphylococcus aureus, ook opgenomen in dit manuscript. Kortom, deze methode voor de isolatie van S. typhimurium-bevattende phagosomes is een eenvoudige, kosteneffectieve, en minder tijdrovend dan het klassieke isolement door sacharose verrijkt verloop-ultracentrifugatie, waardoor zeer phagosomes bacteriën bevatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle stappen met betrekking tot het gebruik van pathogene S. typhimurium moeten worden uitgevoerd in een BSL-2 of een hogere biologische veiligheid niveau faciliteit. De cultuur en de coating van S. Typhimurium, evenals de infectie van het beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) moet worden uitgevoerd onder de motorkap van een laminaire flow om verontreiniging te voorkomen. De isolatie van S. typhimurium-bevattende phagosomes kan worden uitgevoerd op een bankje van de laboratorium BSL-2.
de extractie van het beenmerg van muizen voor de differentiatie in macrofagen werd uitgevoerd overeenkomstig institutionele richtsnoeren inzake dierenwelzijn en goedgekeurd door de Noordrijn-Westfaalse staat agentschap voor de natuur, Milieu en bescherming van de consument [Landesamt für Natur, Umwelt en Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; Neen File: 84-02.05.40.14.082 en 84-02.04.2015.A443] en de Universiteit van Keulen.
1. Culturing S. typhimurium
- Inoculate S. typhimurium (SL1344-stam) uit een enkele bacteriële kolonie in hersenen hart infusie (BHI) bouillon met een bacteriële lus 5 mL.
- De bacteriële suspensie in een incubator bij 37 ° C's nachts met schudden Incubeer.
- Op de volgende dag, 1 mL van de bacteriële suspensie in 19 mL BHI Bouillon in een erlenmeyer en Incubeer bij 37 ° C in een broedstoof met schudden.
- Volgen de S. typhimurium groei door het meten van de optische dichtheid (OD) op 600 nm (OD 600) met een spectrofotometer. Metingen moeten worden verricht ongeveer elke 30 min.
- Bij OD 600 bereikt 1.0, bacteriële schorsing uit de incubator en overdracht in tube 50 mL verwijderen. Centrifugeer bacteriën bij 5400 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Verwijderen van supernatant en resuspendeer in 10 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Centrifugeer bij 5400 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriën in 4.9 mL steriele PBS.
2. Coating van S. typhimurium met magnetische kralen NHS-Biotine/streptavidine-geconjugeerd
- Voeg 100 µL van 10 mg/mL Biotine koppelen oplossing (NHS-Biotine opgelost in dimethylsulfoxide, DMSO) vers bereid, tot de bacteriële schorsing bereid in de vorige stap. Bijvoorbeeld, Verdun 5 mg NHS-Biotine in 0,5 mL steriele DMSO. Meng goed door pipetteren op en neer meermaals.
- Splitsen de mix in vijf buizen van 1,5 mL.
- Incubate gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) op een thermoblock met constante schudden bij 350 rpm.
- Centrifugeren buizen bij 15.000 x g gedurende 10 minuten bij RT en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer in 1 mL steriele PBS, centrifuge op 15.000 x g gedurende 10 minuten bij RT en verwijder het supernatant.
- Herhaal stap 2.5 twee meer tijden voor het verwijderen van de overtollige Biotine koppelen oplossing.
- Na de laatste wash, resuspendeer de pellet in 1 mL steriele PBS.
- Breng 100 µL van 10 mg/mL streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen oplossing in een buis 1,5 mL en laat het op de magnetische rek voor 5 min.
- Verwijder het oplosmiddel met een pipet, nemen de magnetische kralen oplossing daar-geconjugeerd uit de magnetische rek en resuspendeer het met 1 mL van biotine gecoat-bacteriële suspensie bereid in stap 2.7.
- Voor 1 h op RT op een thermoblock met constante schudden bij 350 rpm Incubate.
- Plaats van de oplossing op het magnetische rek; 5 min wachten en verwijder met een pipet van de bacteriën die niet op de wand houden (Houd het in een buis aangeduid als " niet-gecoate bacteriën "). De Fractie vast te houden aan de wand van de buis in contact met de magneet is de bacteriën Biotine/streptavidine-gecoate.
- Verwijderen van de buis met de gelabelde bacteriën uit de magnetische rek en resuspendeer in 1 mL steriele PBS.
- Plaats van het weer op de magnetische rek, 5 min wachten en gebruik een pipet voor het verwijderen van de PBS.
- Herhaal stappen 2.13 en 2.14 twee meer tijden om alle bacteriën die niet zijn bekleed met de streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen.
- Na de laatste wash, resuspendeer de gecoat-bacteriën in 500 µL van steriele PBS en label van de buis als " gecoat bacteriën ".
- Rekenen de kolonievormende eenheden (kve) van beide " niet-gecoate bacteriën " en " bekleed bacteriën " oplossingen door plating seriële verdunningen op BHI agar platen. Ongeveer 2 x 10 8 cfu/mL gecoat-bacteriën worden verkregen van 20 mL van eerste bacteriële suspensie met OD 600 voor 1.0. De gecoate-bacteriële suspensie houden bij 4 ° C tot de volgende dag worden gebruikt voor het infecteren van macrofagen.
3. Infectie van BDMDs
- op dezelfde dag als de bacteriën zijn bekleed met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen, plaat volledig de gedifferentieerde BMDMs 22 in 6 cm schotels bij een dichtheid van 5 x 10 6 cellen per schotel.
- Op de volgende dag, centrifugeer de gecoat-bacteriële schorsing bij 15.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) met een concentratie van 10 x 10 6 cfu/mL.
- Te infecteren macrofagen op een veelheid van infectie (MOI) van 10, verwijder het medium van de BMDMs en voeg 5 mL van gecoat-bacteriële suspensie bereid. Optimale MOI kan worden beoordeeld voor elke celtype of experimentele doeleinden van de geïsoleerde phagosomes.
- Incubate op RT gedurende 10 minuten om te synchroniseren van fagocytose.
- Incubate bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator voor 30 min tot fagocytose. Andere celtypes kunnen vereisen verschillende incubatie keer om internalisering van de bacteriën.
- Verwijderen de bacteriën-bevattende medium van de schotels en spoel de cellen met RPMI driemaal te verwijderen bacteriën niet-geïnternaliseerd.
- Ten slotte voeg 10 mL van RPMI met 10% FBS en 50 µg Mo/mL gentamycine te doden alle bacteriën niet-phagocytized.
- Broeden de besmette BMDMs bij 37 ° C met 5% CO 2, totdat de gewenste tijd wijs. De gewenste tijdstip moet experimenteel worden bepaald volgens de bacteriën en celtype gebruikt en het doel van de analyse. Voor de studie van de vroege gebeurtenissen van de fusie van de phagosome-endosome in S. Typhimurium besmette BMDMs, een 30 min incubatie wordt aanbevolen. Voor de analyse van latere gebeurtenissen, kan phagosomes na 2 uur of 4 uur incubatie worden geëxtraheerd. Langdurige incubatie van macrofagen met S. Typhimurium dan 24u resulteert in de dood van de macrofagen. Uitgebreid intracellulaire infectie voordat de phagosome extractie waarschijnlijk tot afbraak van biotine moleculen leiden kan. Echter hebben we niet waarnemen verlies van biotine op gecoat-bacteriën tot 24 h.
4. Isolatie van S. typhimurium-met Phagosomes
- voorbereiden de omvang van de vereiste phagosome isolatie buffer een (50 mM buizen, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) door toevoeging van dithiothreitol (DTT) aan een eindconcentratie van 1 mM, Cytochalasin B voor een finale concentratie van 10 µM, en protease en phosphatase inhibitors als door de fabrikant aanbevolen.
Opmerking: DTT en Cytochalasin B moeten worden toegevoegd aan de phagosome isolatie buffer A altijd onmiddellijk voordat gebruiken. Cytochalasin B verstoort het cytoskelet, vergemakkelijking van de breuk van de celmembraan. - Op het gewenste tijdstip wijs, verwijder het medium van de geïnfecteerde cellen en wassen met steriel PBS opgewarmd op RT.
- Toevoegen 750 µL van phagosome isolatie A buffer per schotel en incubeer 20 min op ijs. Wanneer u verschillende cel nummers, de hoeveelheid isolatie buffer A proportioneel moet worden aangepast.
- Voeg toe 250 µL van phagosome isolatie buffer B (50 mM buizen, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM Mannitol en 68 mM sacharose). Rock de plaat om ervoor te zorgen dat de buffer het volledige oppervlak van de schotel bereikt. Wanneer u verschillende cel nummers, de hoeveelheid isolatie buffer B proportioneel moet worden aangepast.
- Verwijderen van de cellen van de schotel door voorzichtig afschrapen met behulp van een rubberen politieagent en hen overbrengen in een tube pre gekoeld 1,5 mL.
- Wordt de celsuspensie passeren door een 26G naald met behulp van een injectiespuit 1 mL minstens 15 keer (één aspiratie plus één uitwerpen van de graven van de opschorting van de cel als één keer). Dit is voldoende om de cytosolische inhoud van BMDMs vrij te geven. Het aantal passeert de naald moet worden geoptimaliseerd voor elk celtype.
- Plaats van de celsuspensie op het magnetische rek en 5 min wachten. De deeltjes die zijn gekoppeld aan de magneet zijn de phagosomes met gecoate - S. Typhimurium. De schorsing de rest van de cellulaire componenten bevat.
- Spoel de suspensie in een tube van 1,5 mL aangeduid als " cytosol ".
- De buis met de geïsoleerde phagosomes verwijderen uit het magnetische rek en resuspendeer hen in 1 mL steriele PBS.
- Plaats van de opschorting van de phagosome op de magnetische rek, 5 min wachten en verwijderen van de PBS. Herhaal stap 4.9 en 4.10 te wassen van de geïsoleerde S.
- typhimurium-bevattende phagosomes.
- Ten slotte Verwijder de PBS en resuspendeer de phagosomes in de vereiste buffer, bijvoorbeeld in een radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer voor eiwit analyse. Ongeveer 50-200 µg eiwit wordt verkregen per monster volgens dit protocol, afhankelijk van het aanvankelijke bedrag van cellen en de MOI van infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolatie van bacteriën-bevattende phagosomes door dit protocol vereist de biotinylation van de bacteriën als een eerste stap. We daarom beoordeeld de effectiviteit van S. typhimurium biotinylation door analyse van de confocal microscopie van BMDMs geïnfecteerd met biotinyleerd mCherry -S. typhimurium aangeduid met Cy5-daar. Kort, BMDMs waren besmet, zoals beschreven in dit protocol met mCherry -S. typhimurium eerder biotinyleerd maar niet geïncubeerd met magnetische kralen daar-geconjugeerde. Na 30 min incubatie bij 37 ° C, waren de cellen gewassen met warme PBS en vaste met 4% formaldehyde voor 20 min op RT. fixatie werd tegengehouden door uitgebreide wassen met PBS. De cellen werden dan permeabel met 3% Triton in PBS voor 5 min op RT. besmet BMDMs werden vervolgens geïncubeerd met Cy5-daar gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Na het uitgebreide wassen, waren de monsters voor analyse voorbereid door confocale microscopie (Figuur 1). Niet biotinyleerd mCherry -S. Typhimurium werd gebruikt als negatieve controle. Fluorescent signaal van Cy5-daar werd waargenomen uitsluitend in biotinyleerd mCherry -S. typhimurium, bevestigt dat biotinylation van de bacteriën was succesvol. Microscopische analyse werd uitgevoerd op een confocal microscoop met behulp van "60 X O2 NB: 1.40" doelstelling. Excitatie golflengten voor de fluorochromes waren 405 nm (DAPI), 559 nm (mCherry), en 635 nm (Cy5) en bet spanning werd vastgesteld op 574v, 565v en 443v, respectievelijk.
Sinds de immuunrespons in macrofagen in gang gezet door S. typhimurium is grotendeels afhankelijk van de macrofaag oppervlakte receptor activering door bacteriële liganden, we volgende getest als de coating van S. typhimurium met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen kan het wijzigen van de aangeboren immuunrespons bij besmette BMDMs. We beoordeeld eerst of coating van S. typhimurium kon veranderen de fagocytische capaciteit van BMDMs door confocale microscopie. BMDMs waren besmet, zoals beschreven in dit protocol met mCherry -S. Typhimurium gestreken met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen of met niet gestreken mCherry -S. typhimurium. Na 30 min incubatie bij 37 ° C, werden de cellen gewassen met warme PBS en vaste met 4% formaldehyde voor 20 min op RT. Na het uitgebreide wassen met PBS, waren de monsters voor analyse voorbereid door confocale microscopie. Zoals blijkt uit Figuur 2, phagocytized macrofagen gecoat en ongecoat mCherry -S. typhimurium even.
Vervolgens geanalyseerd wij de ontstekingsreactie veroorzaakt door S. typhimurium bekleed met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen (Figuur 3). Supernatant van de BMDMs besmet met coated en uncoated S. typhimurium werden verzameld na 24 h van infectie voor de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA) voor secreted Interleukine-6 (IL-6). De coating van S. typhimurium met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen de ontstekingsreactie van de macrofagen niet aanzienlijk gewijzigd.
Om te beoordelen van de zuiverheid van de bacteriën-bevattende phagosomes verkregen door gebruik te maken van dit protocol geanalyseerd wij geïsoleerde mCherry -S. typhimurium-phagosomes bevattende immunoblotting. Met behulp van specifieke antilichamen tegen de mCherry-tag, vonden we aanzienlijke verrijking van uiting van de mCherry S. typhimurium in geïsoleerde phagosomes in vergelijking met de cytosolische breuk verkregen uit hetzelfde monster (Figuur 4). Geïsoleerde phagosomes met mCherry - S. typhimurium , dat was niet eerder bedekt met biotine werden gebruikt als een negatieve controle. Deze resultaten tonen aan dat dit protocol zorgt voor de zuivering van phagosomes die zijn hoogverrijkt bij bacteriën.
Wij vervolgens uitgevoerd immunoblot analyse van endosome en lysosoom markers in geïsoleerde phagosomes met S. typhimurium (Figuur 5). De meeste van de endosome en lysosoom markers werden duidelijk waargenomen in phagosomes geïsoleerd op 4 uur na infectie in vergelijking met 30 min. De verrijking van de endosomal markers Rab5 en Rab7, evenals het lysosoom markeringen v-ATPase (zowel V0 en V1 subeenheden) en cathepsin D, werden waargenomen. Interessant is dat werd alleen de gekloofd vorm van cathepsin D in geïsoleerde phagosomes op 4 uur na infectie waargenomen. De splitsing van de Pro-cathepsin D (48 kDa) voor de productie van het actieve formulier (33 kDa) treedt alleen op in de phagosomes maar niet in het cytosol, demonstreren de specificiteit van dit protocol voor phagosome isolatie.
Aangezien markeringen van organellen, zoals mitochondriën of endoplasmatisch reticulum (ER) worden vaak gedetecteerd in preparaten van bacteriën-bevattende geïsoleerde phagosomes, de S. typhimurium-met geïsoleerde phagosomes waren gesondeerd met specifieke antilichamen tegen de mitochondriale vervoerder Tomm20 en de ER eiwit calnexin (Figuur 6). We testten ze ook met een antilichaam tegen de glycolyse enzym GAPDH om te beoordelen van cytosolische verontreiniging in de geïsoleerde phagosomes. We vonden zowel mitochondriën en ER markeringen in S. typhimurium-geïsoleerd phagosomes maar geen cytosolische besmetting.
Om te bestuderen van de veelzijdigheid van het protocol voor isolatie van bacteriën-bevattende phagosomes, Biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen wordt coating procedure toegepast voor de gram-positieve bacterie S. aureus. Door met de dezelfde fixatie en kleuring protocol als beschreven voor het mCherry -S. typhimurium (Figuur 1) succesvolle biotinylation voor de groen fluorescente proteïne (GFP) hebben bevestigd die wij waarin -S. aureus (Figuur 7). Bovendien, we verrijking van de markering van de endosome Rab7 en het lysosoom markeringen v-ATPase (V0 subeenheid) gedetecteerd en cathepsin D door immunoblot analyse van geïsoleerde GFP -S. aureus-met phagosomes (Figuur 8). Het splijten van cathepsin D in zijn volwassen vorm was alleen aantoonbaar na 4 uur van infectie in de geïsoleerde phagosome monsters maar niet in de cytosolische breuken. Geïsoleerd van S. aureus-met phagosomes vrij waren van cytosolische verontreiniging zoals blijkt uit de immunodetection van GAPDH.
Kortom, hebben we aangetoond dat onze phagosome isolatie protocol mogelijk het isolement van hoogverrijkt bacteriën-bevattende phagosomes, vrij van cytosolische besmetting maakt. De geïsoleerde phagosome preparaten kunnen worden gebruikt voor de analyse van endosome en lysosoom markers te bestuderen phagosome de rijping. Bovendien werd aangetoond dat dit protocol kan worden gebruikt voor zowel gram-positieve als gram-negatieve bacteriën en dat de labeling procedure niets aan de immuunrespons van de macrofagen verandert.
Figuur 1: Fluorescentie microscopie analyse van biotinyleerd S. typhimurium met behulp van Cy5-streptavidine. BMDMs waren besmet voor 30 min met mCherry -S. typhimurium , dat biotinyleerd ("biotinyleerd S was. T."), zoals beschreven in dit protocol. Niet biotinyleerd mCherry -S. typhimurium ("Niet biotinyleerd S. T.") werd gebruikt als een negatieve controle. Na fixatie en permeabilization van de cellen, werden monsters geïncubeerd met Cy5-daar gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Fluorescentie signaal van de kern (DAPI), mCherry -S. typhimuriumen Cy5-daar zijn geanalyseerd met behulp van de confocal microscopie. Signaal van de Cy5-daar kan alleen worden gedetecteerd in de bacteriën eerder aangeduid met biotine, dus om efficiënte biotinylation te bevestigen. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Microscopische analyse van de BMDMs besmet met mCherry -S. typhimurium bekleed met biotine en magnetische kralen daar-geconjugeerde. BMDMs waren besmet met mCherry -S.typhimurium aangeduid met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen, zoals beschreven in dit protocol. Na het toestaan van de macrofagen aan phagocytize van de bacteriën voor 30 min, werden cellen vastgesteld met 4% formaldehyde voor 20 min op RT. De gecoate bacteriën phagocytized door macrofagen werden vervolgens geanalyseerd door confocale microscopie. Analyse toonde aan dat de inname van gecoate bacteriën ("Flatcoated S. T.") vergelijkbaar is met de inname van labelloze mCherry bacteriën ("niet bekleed S. T."), waaruit blijkt dat labelen met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen verandert niet fagocytose van S. typhimurium door macrofagen. Kernen werden gekleurd met DAPI voor microscopie Visualisatie. Gegevens worden weergegeven als ± S.E.M. betekenen, en de statistische significantie berekend aan de hand van de student t-test wordt vertegenwoordigd als * = p < 0,05; ** = p < 0,01; p = < 0,001. Schaal bar = 40 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: IL-6 secretie door BMDMs besmet met biotine-en-streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen, met het label S. typhimurium labelloze St.o.v.. typhimurium . BMDMs waren besmet met S. typhimurium bekleed met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen, zoals beschreven in dit protocol. Na 24 h van besmetting, werden supernatant verzameld voor verdere analyse van IL-6 secretie door ELISA. Supernatant vormen BMDMs besmet met niet gestreken S. typhimurium werden gebruikt als een besturingselement. De inductie van IL-6 secretie door gecoate S. typhimurium was niet significant verschillend in vergelijking met die van ongecoat S. typhimurium. Gegevens worden weergegeven als ± S.E.M. betekenen, en de statistische significantie berekend aan de hand van de student t-test wordt vertegenwoordigd als * = p < 0,05; ** = p < 0,01; p = < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: bacteriële verrijking in geïsoleerde phagosomes. Verrijking van mCherry-gelabeld S. typhimurium in geïsoleerde phagosomes verzameld na 30 min en 4 h van besmetting werd vergeleken met de cytosolische breuk. Β-actine werd gebruikt als een besturingselement laden. De negatieve controle verwijst naar phagosomes geïsoleerd met behulp van ongecoat S. typhimurium bij 30 min na infectie. Zoals verwacht, de uiteindelijke uitvoer van isolatie van de phagosome met behulp van labelloze S. typhimurium aanwezig aanzienlijke bedragen van mCherry of β-actine, demonstreren de specificiteit van het protocol niet. 20 µg eiwit werd per monster geladen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Analyse van endosome en lysosoom markers in geïsoleerde S. typhimurium-met phagosomes. De verrijking van de endosome markers Rab5 en Rab7, en het lysosoom markeringen v-ATPase (V0 en V1 subeenheden) en het cathepsin D werd geanalyseerd in geïsoleerde S. typhimurium-met phagosomes gewonnen na 30 min en 4 h van besmetting. Β-actine werd gebruikt als een besturingselement laden. 20 µg eiwit werd per monster geladen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Analyse van de mitochondriën, ER en cytosolische markeringen in geïsoleerde S. typhimurium-met phagosomes. De cytosolische markering GAPDH, de calnexin van de marker ER en de mitochondriale markering Tomm20 in S. typhimurium phagosomes geïsoleerd op 30 min en 4 uur na infectie werden geanalyseerd door immunoblotting en vergeleken met de corresponderende cytosolische breuken. 20 µg eiwit per monster werden geladen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Microscopische analyse van GFP -S. aureus geïnfecteerde macrofagen. BMDMs waren besmet met S. aureus uiting van groen fluorescent proteïne (GFP) label with Biotine zoals beschreven in de methodologie voor het labelen van S. typhimurium. Na het toestaan van macrofagen tot phagocytize van de bacteriën voor 30 min, werden de cellen vastgesteld. Ongecoate S. aureus ("niet biotinyleerd S. A.") werden gebruikt als negatieve controle. Na fixatie en permeabilization van de cellen, werden monsters geïncubeerd met Cy5-daar gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Het fluorescent signaal van de kern (DAPI), GFP -S. aureusen Cy5-daar werden geanalyseerd door confocale microscopie. Het signaal van Cy5-daar kan alleen gezien worden in de bacteriën eerder aangeduid met biotine, om efficiënte biotinylation te bevestigen. Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: Analyse van endosome en lysosoom markers in geïsoleerde S. aureus-bevattende phagosomes. S. aureus-met phagosomes geïsoleerd op 30 min, 2 uur en 4 uur na infectie, werden geanalyseerd door immunoblotting voor phagosomal markers Rab5, Rab7 en v-ATPase in vergelijking met de overeenkomstige cytosolische breuken. 20 µg eiwit per monster werden geladen. Monsters werden ook getest met een specifiek antilichaam tegen GAPDH, aan te tonen dat geïsoleerd S. aureus-met phagosomes zijn vrij van cytosolische besmetting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een nieuwe methode voor de isolatie van S. typhimurium-phagosomes bevattende coating van de bacteriën met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen wordt hier beschreven. Na de zachte verstoring van het celmembraan, kunnen bacteriën-bevattende phagosomes worden gemakkelijk gewonnen met behulp van een magnetische rek. We laten zien dat etikettering van de bacteriën de capaciteit van het pathogene agens oplevert behoudt voor het opwekken van ontsteking en niets aan de fagocytische eigenschap van de gastheercel verandert. Nog belangrijker is, phagosomes volgens deze methode verkregen zijn verrijkt met bacteriën en endosome/lysosoom markeringen en verstoken van cytosolische besmetting.
Deze methode biedt verschillende voordelen in vergelijking met de traditionele phagosome isolatie methode die gebruikmaakt van sacharose verlopende scheiding. Het elimineert de tijdrovende meerdere centrifugeren stappen, waardoor de onderzoeker te hanteren meer monsters in minder tijd en zuiverder phagosome monsters krijgen gemakkelijk doordat het aantal stappen wassen. Het gebruik van dit protocol elimineert de noodzaak voor gespecialiseerde en gevoelige apparatuur, zoals ultracentrifugatie. Hoge snelheid centrifugeren kan wijzigen van de kenmerken van de blaasjes en verminderen de uiteindelijke opbrengst22, dat in dit protocol wordt vermeden. We hebben ook aangetoond dat de coating van S. typhimurium met biotine en daar-geconjugeerde magnetische kralen verandert niets aan de fagocytische capaciteit van macrofagen. Bovendien, de inductie van IL-6 door macrofagen besmet met naam S. typhimurium was ongewijzigd ten opzichte van macrofagen besmet met labelloze bacteriën. Daarom coating van S. Typhimurium er niet toe brengt belangrijke veranderingen in hun pathogeniteit. Om onze kennis, coating van S. typhimurium vormt geen beletsel voor het gebruik van de geïsoleerde phagosomes voor elk van de gebruikte laboratorium analysetechnieken.
S. typhimurium-met phagosomes geïsoleerd door deze methode zijn verrijkt met bacteriën en huidige typische endosomal en lysosomale markers, zoals de v-ATPase subeenheden V0 V1 en de gekloofd volwassen protease cathepsin D, die alleen in de geïsoleerde phagosome breuken kan worden opgespoord. Daarnaast vonden we mitochondriën en ER markeringen in geïsoleerde S. typhimurium-met phagosomes. Interactie van phagosomes met de ER heeft breed bestudeerd hoewel de hoeveelheid eiwitten uit de ER aanwezig zijn in pathogen-bevattende phagosomes kunnen variëren met het pathogene agens studeerde en het celtype. Bijvoorbeeld zijn phagosomes met Brucella abortus geïsoleerd van niet-professionele fagocyten rijk aan ER markeringen23 maar niet degene van macrofagen24geïsoleerd. Calnexin is eerder ontdekt in S. Typhimurium-bevattende phagosomes geïsoleerd door sacharose kleurovergang18. Ook is nauwe interactie van inerte kraal-bevattende phagosomes- en mitochondriën eerder gemelde25, de aanwezigheid van Tomm20 in geïsoleerde phagosomes. Eiwitten mitochondriaal gevonden in geïsoleerde phagosomes met L. pneumophila26 of Mycobacterium27. Echter, de detectie van mitochondriën componenten in preparaten van geïsoleerde pathogen-bevattende phagosomes met behulp van de methode van de kleurovergang centrifugeren sacharose is vaak is vermoedelijk te wijten zijn aan de soortgelijke dichtheid van dit organel en de pathogeen-bevattende phagosome en dus aspecifieke28. Onze methode vermijdt dergelijke een probleem van de besmetting en betrouwbaardere gegevens suggereren dat mitochondriale membraan met de phagosomal membranen mengen kunnen biedt. Kortom, het zal moeilijk zijn om te voorkomen dat ER en mitochondriale markeringen in de pathogeen-bevattende geïsoleerd phagosomes preparaten, afhankelijk van het celtype host en het pathogene agens oplevert. De aanbevolen methode voor de verificatie van de zuiverheid van de geïsoleerde phagosomes is gelabeld-bacteriën en specifieke tag antilichamen te gebruiken voor het opsporen van bacteriën door de Western Blot. Ook laten we zien dat deze isolatie-methode kan worden aangepast voor andere micro-organismen met beschikbare oppervlakte amine groepen die biotinyleerd worden kunnen. Als voorbeeld hebben wij met succes toegepast ons protocol om te isoleren van de S. aureus-met phagosomes. Phagosomes met S. aureus geïsoleerd met behulp van dit protocol zijn verrijkt met lysosoom en endosome markeringen zoals v-ATPase (V0 subeenheid) en Rab7, respectievelijk, maar vertonen niet cytosolische markeringen zoals GAPDH.
Endosomal/phagosomal blaasjes bieden unieke omgevingen voor de afbraak van pathogenen, maar behouden de antigenen voor signalering het adaptieve immuunsysteem. Hoewel, phagosomes en het rijpingsproces uitgebreid onderzocht is, blijft de communicatie in de phagosome op verschillende ziekteverwekkers hosting ongrijpbaar. Het is ook onduidelijk hoe metabole veranderingen in cellen phagosome rijping en de inhoud ervan wijzigen. Daarom geeft het protocol hier gedetailleerde meer kansen om te studeren biogenese van phagosome en zijn functie in het kader van verschillende aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Onderzoek in de Robinson's lab wordt ondersteund door financiële middelen van Keulen Excellence Cluster op cellulaire Stress reacties in Aging-Associated ziekten, Universiteit van Keulen, Duitsland (CECAD; gefinancierd door de DFG binnen het Excellence-initiatief van de Duitse federale en staat regeringen) en subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln fortuin en Maria-Pesch Stichting van de Universiteit van Keulen, Duitsland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
