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Developmental Biology

अलगाव, संस्कृति, और चूहों से अस्थि मज्जा Stromal कोशिकाओं और अस्थिशोषक Progenitors के भेदभाव

Published: January 6, 2018 doi: 10.3791/56750
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

इस अनुच्छेद में, हम वर्तमान तरीकों को अलग करने और हड्डी मज्जा stromal कोशिकाओं और टेम माउस लंबी हड्डियों से स्टेम कोशिकाओं अंतर । दो अलग प्रोटोकॉल अलग कोशिका osteoblasts, adipocytes, और osteoclasts में विस्तार और भेदभाव के लिए उपयुक्त आबादी उपज प्रस्तुत कर रहे हैं ।

Abstract

अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं (BMSCs) नियमित रूप से mesenchymal स्टेम सेल के एक प्रतिनिधित्व के रूप में इस्तेमाल किया एक सेल जनसंख्या का गठन इन विट्रो । वे टेम स्टेम सेल (HSCs), जो लाल रक्त कोशिकाओं को जंम दे सकता है के साथ अस्थि मज्जा गुहा के भीतर रहते हैं, प्रतिरक्षा progenitors, और osteoclasts । इस प्रकार, विभिंन कोशिका आबादी का एक बहुत विषम मिश्रण में अस्थि मज्जा परिणामों से कोशिका की आबादी के निष्कर्षण, प्रयोगात्मक डिजाइन में चुनौतियों का सामना कर सकते है और डेटा व्याख्या पाया । कई अलगाव और संस्कृति तकनीक प्रयोगशालाओं में विकसित किया गया है क्रम में BMSCs और HSCs इन विट्रोके अधिक या कम सजातीय आबादी प्राप्त करने के लिए । यहां, हम BMSCs और HSCs के अलगाव के लिए माउस लंबी हड्डियों से दो तरीके: एक तरीका है कि पैदावार BMSCs और HSCs की एक मिश्रित जनसंख्या और एक विधि है कि दो कोशिका पालन के आधार पर आबादी अलग करने का प्रयास मौजूद हैं । दोनों तरीकों osteogenic और adipogenic भेदभाव प्रयोगों के साथ ही कार्यात्मक परख के लिए उपयुक्त कोशिकाओं प्रदान करते हैं ।

Introduction

प्राथमिक murine BMSCs सामांयतः mesenchymal स्टेम सेल के इन विट्रो मॉडल के रूप में 1980 के दशक के शुरू में अपनी खोज के बाद से1इस्तेमाल कर रहे हैं । वास्तव में, प्लास्टिक की संस्कृतियों-अनुयाई लंबी हड्डियों के अस्थि मज्जा गुहा से फ्लश की क्षमता बनाए रखने के कई अध्ययनों में osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, या adipocytes में अंतर किया जा2,3, 4 , 5. हालांकि, अस्थि मज्जा एक अद्वितीय सहित कई अलग सेल आबादी से बना ऊतक है, लेकिन सीमित करने के लिए, BMSCs, HSCs, endothelial, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं. इस प्रकार, अलगाव और संस्कृति तकनीक अलग सजातीयता के साथ सेल आबादी उपज कर सकते हैं । ऐसी तकनीक का प्रयोग कोशिकाओं से भेदभाव की क्षमता का परीक्षण करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है । उदाहरण के लिए, जब विभिंन पादी के साथ चूहों से कोशिकाओं की तुलना, एक मिश्रित सेल जनसंख्या के साथ शुरू डेटा की व्याख्या सीमा । इसके विपरीत, BMSCs और HSCs की समरूप आबादी प्राप्त करना तकनीकी रूप से मुश्किल हो सकता है और एक पूर्व वीवो मॉडल के प्रतिनिधि के रूप में नहीं हो सकता है ।

हमारी प्रयोगशाला में, हम मुख्य रूप से BMSCs के उपयोग में उनकी क्षमता के कारण osteoblasts, osteoclasts, और adipocytes में विभेदित होने में रुचि रखते हैं । यहां, हम BMSCs और HSCs अलगाव और संस्कृति की तकनीक वर्तमान osteoblastogenesis या इन विट्रो मेंadipogenesis का आकलन करते थे, साथ ही HSCs की संस्कृतियों osteoclasts में अंतर करने के लिए । एक विधि अस्थि मज्जा कोशिकाओं (BMCs) युक्त BMSCs और HSCs सीधे adipogenesis, osteoblastogenesis, और osteoclastogenesis के लिए उपयुक्त की एक मिश्रित जनसंख्या का उपयोग करता है (कुल BMCs कहा जाता है) । इस विधि अस्थि मज्जा microenvironment की कोशिकाओं के बीच पाया विविधता के एक करीब पूर्व vivo प्रतिनिधित्व है । एक अंय विधि गैर से अनुयाई अलग-अनुयाई कोशिकाओं को संस्कृति के प्रयास में "purer" BMSCs और HSCs की आबादी (अनुयाई BMSCs कहा जाता है) । बाद में विधि सेल संस्कृति प्रयोगों BMSCs या HSCs की एक और अधिक सटीक संख्या के साथ शुरू करने के लिए अनुमति देता है और अन्य कोशिका आबादी है कि संस्कृति में रहने के जटिल अप्रत्यक्ष प्रभाव की क्षमता को कम करता है. दोनों तरीकों को पहले से प्रकाशित किया गया है और विभिंन अनुसंधान प्रश्न6,7,8,9पता इस्तेमाल किया ।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और मेन मेडिकल सेंटर अनुसंधान संस्थान में उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. संग्रह ट्यूबों तैयारी

  1. न्यूनतम आवश्यक मध्यम α (मेम α) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन के 1%/Streptomycin के साथ पूरक द्वारा BMSC संस्कृति मीडिया बनाओ ।
  2. प्लेस १०० १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूबों में BMSC संस्कृति मीडिया के µ एल । 3 हड्डियों आमतौर पर एक ही ट्यूब में फिट तो तदनुसार तैयार करेंगे ।
  3. २०० µ l पिपेट युक्तियां पर्याप्त इतना है कि वे केंद्रापसारक ट्यूबों में फिट के सिरों को काट । ट्यूबों के अंदर सुझाव डालें और सुनिश्चित करें कि पलकों बर्फ पर ट्यूबों रखने से पहले बंद कर सकते हैं ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, समाप्त होता है कटौती के साथ ०.७५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में डाला जा सकता है ।

2. चूहों से हड्डियों की फसल

  1. 2 गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन के बाद और उंहें ७०% इथेनॉल के साथ स्प्रे का उपयोग कर जानवरों Euthanize ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि एक ही लिंग और अधिमानतः एक ही उंर से पशुओं का इस्तेमाल कर रहे हैं । हम नियमित रूप से 7 से 8 सप्ताह आयु वर्ग के पशुओं का उपयोग करें । हम एक बेहतर प्रतिनिधि और प्रतिलिपि सेल जनसंख्या उपज करने के लिए प्रयोगात्मक समूहों प्रति कम से कम 3 पशुओं से पूलिंग कोशिकाओं की सिफारिश.
  2. एक विदारक बोर्ड पर अपनी पीठ पर euthanized माउस रखें । पेट पर त्वचा का स्टेंट बनाने के लिए संदंश का प्रयोग करें । एक छोटा सा चीरा (लगभग 1 सेमी) बाँझ विदारक कैंची का उपयोग कर. पीठ के निचले हिस्से और पैरों को बेनकाब करने के लिए अंगों और पैरों की ओर त्वचा को छील लें ।
    1. पैर हटाने के लिए संयुक्त टखने के नीचे कट । कूल्हे पर श्रोणि शिखा के साथ कट करने के लिए hipbone से फीमर सिर अलग । जबकि माउस अभी भी अपनी पीठ पर है, hipbone के बीच में एक चीरा बनाने के लिए दो श्रोणि हड्डियों को अलग ।
  3. एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछे का प्रयोग, ध्यान से मांसपेशियों को दूर femurs, tibias, और श्रोणि हड्डियों ।
    नोट: संभव के रूप में हड्डी से tendons और मांसपेशियों की ज्यादा काटने के रूप में सफाई तेजी से और आसान एक प्रकार का वृक्ष के साथ-मुफ्त पोंछे (उदा, kimwipes) बनाता है । देखभाल का प्रयोग करें जब हड्डियों जोड़ तोड़ के रूप में वे आसानी से टूट जाते है और उनकी कमजोरी कुछ पादी के साथ बढ़ सकता है ।
  4. एक बार सभी नमूनों को विच्छेदित कर दिया गया है, उंहें पंजाब में बर्फ पर जगह और अलगाव के शेष चरणों के लिए एक बाँझ संस्कृति हूड के लिए कदम ।
    नोट: कार्य aseptically जितना संभव हो सकेगा संस्कृतियों में प्रदूषित होने की क्षमता कम हो जाएगी ।
  5. छोटे कटौती (लगभग 1 करने के लिए 2 मिमी) दोनों समीपस्थ और बाहर हड्डियों के बाहर समाप्त होता है पर उन में खोदी गई सुझावों के भीतर रखने से पहले, केंद्रापसारक ट्यूबों ।
    ध्यान दें: इतना है कि मज्जा से बाहर हो सकता है एक पर्याप्त राशि में कटौती करने के लिए सुनिश्चित; हालांकि, देखभाल के लिए सेल की आबादी के रूप में बहुत ज्यादा काटने से बचने के लिए मज्जा अंतरिक्ष के भीतर निकटता के आधार पर भिंन होते है लिया जाना चाहिए ।
  6. 15 एस के लिए कमरे के तापमान पर १०,००० x g पर केंद्रापसारक । सुनिश्चित करें कि सभी मज्जा और फ्लश १.५ एमएल ट्यूब के नीचे गोली लगी है, जबकि हड्डियों आवेषण अंदर है (या तो २०० µ एल प्लास्टिक टिप या ०.७५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब) । एक बार जब सभी मज्जा एकत्र की है, संग्रह ट्यूबों से हड्डियों के साथ आवेषण निकालें ।
    नोट: यदि सभी मज्जा फ्लश है, हड्डियों सफेद दिखाई देगा । हालांकि, अगर मज्जा कुछ हड्डियों में रहता है, काटने की कोशिश फिर से समाप्त होता है और केंद्रापसारक ।

3. सेल सस्पेंशन

  1. एक 25 ग्राम सुई का उपयोग करना, सेल छर्रों ऊपर और नीचे खींचने के लिए धीरे से झुरमुट को तोड़ने के लिए और एक एकल 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सभी नमूनों गठबंधन । नमूनों की ५०० µ l प्रति BMSC कल्चर मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के शीर्ष पर एक ७० µm फिल्टर प्लेस और इस फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन के लिए संभावित हड्डी के टुकड़े को दूर करने के लिए पास ।

4. चढ़ाना और अस्थि मज्जा कोशिकाओं की मिश्रित आबादी की संस्कृति (कुल BMCs)

नोट: कक्ष 5% CO2के साथ एक मशीन में ३७ ° c पर cultureed हैं ।

  1. कोशिकाओं की संख्या की गणना और उंहें १.० x 106 कोशिकाओं में थाली/ कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए मिश्रित संस्कृति के ७२ ज की अनुमति दें ।
    नोट: हम अनुशंसा करते है कमजोर कक्ष निलंबन 20x कल्चर मीडिया में और कमजोर फिर से trypan नीला में एक hemocytometer का उपयोग कर कक्षों की गणना करने से पहले । 7 सप्ताह के लिए पुराने पुरुष C57Bl6/जे चूहों, हम नियमित रूप से लगभग ५० x 106 कोशिकाओं की एक सेल संख्या उपज लेकिन उंर, सेक्स, और तनाव सेल संख्या बहुत प्रभावित कर सकते हैं ।
    नोट: कोशिकाओं की एक मिश्रण आबादी अच्छी तरह से संस्कृति के तल पर संलग्न करना चाहिए.
  2. ७२ h के बाद, मीडिया को निकालें और इसे ताज़ा मीडिया से प्रतिस्थापित करें । मीडिया हर दूसरे दिन बदल रहा है और प्रवाह के लिए जांच जारी है । जब कोशिकाओं 80-100% प्रवाह तक पहुंचने, वे भेदभाव के लिए तैयार हैं ।
    नोट: क्योंकि यह संस्कृति दोनों BMSCs और HSCs के साथ मिश्रित है, यह सीधे osteoblastogenesis, adipogenesis के साथ ही osteoclastogenesis के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

5. चढ़ाना और BMSCs की विभाजित जनसंख्या की संस्कृति (अनुयाई BMSCs)

नोट: कक्ष 5% CO2के साथ एक मशीन में ३७ ° c पर cultureed हैं ।

  1. प्लेट सभी femurs, tibias से एकत्र कोशिकाओं, और एक माउस के श्रोणि हड्डियों में एक 10 सेमी संस्कृति डिश (संस्कृति क्षेत्र के ५५ सेमी2 ) ।
    नोट: जब पूलिंग 2-3 C57BL/6J चूहों, हम आम तौर पर थाली इस ' कुल ' अस्थि मज्जा जनसंख्या में एक १५० cm2 कुप्पी.
  2. मिश्रित संस्कृति के ४८ ज के बाद, संस्कृति मीडिया (गैर अनुयाई HSCs युक्त) को हटा दें । यदि osteoclastogenesis प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाना है, तो गैर-अनुयाई कक्षों की इस जनसंख्या को एक तरफ सेट करें (अनुभाग 7 देखें), यदि नहीं, तो इन कोशिकाओं को महाप्राण और छोड़ें.
  3. संलग्न कोशिकाओं को परेशान न करने के लिए ध्यान से पंजाबियों के साथ थाली धो लें ।
  4. पंजाबियों को हटाने और 1-3 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ०.२५% trypsin और मशीन जोड़कर कोशिकाओं उठा । सेल के सस्पेंशन को सेल मीडिया से जोड़कर trypsin को बुझाएं । इस बिंदु पर, BMSCs, जो अब उठा रहे हैं, गिना जा सकता है (के रूप में पहले चरण ४.१ में किया) और भविष्य के प्रयोगों के लिए चढ़ाया ।
  5. चढ़ाना के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या की गणना । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १,००० x g पर सेल निलंबन के आवश्यक मात्रा के केंद्रापसारक ।
    नोट: कक्ष आमतौर पर अंतिम-बिंदु प्रयोगों के आधार पर चढ़ाया जाता है । उदाहरण के लिए, यदि प्रोटीन/आरएनए अलग किया जा करने के लिए है हम आम तौर पर एक उच्च घनत्व पर थाली (~ 1.0-2.0 x 106 कोशिकाओं को 6-well प्लेट में/
  6. मीडिया निकालें और चढ़ाना के लिए आवश्यक संस्कृति मीडिया की मात्रा में सेल गोली reसस्पेंड । संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं के प्रयोगों के अनुसार प्लेट और उन्हें कुछ दिनों के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देते हैं । जब BMSCs पहुंचते हैं, तो विभेद करने के लिए आगे बढ़ें ।

6. BMSCs का विभेद

  1. Osteoblasts
    1. osteoblast भेदभाव मीडिया बनाने के ८०० µ एल के 1 M β-ग्लिसरॉल फास्फेट और पंजाब में २०० µ एल के लिए पंजाब में ०.५ M ascorbic एसिड की ९९ मिलीलीटर BMSC संस्कृति मीडिया (BMSC संस्कृति मीडिया की संरचना के लिए चरण १.१ देखें) ।
      1. एक बार BMSCs संस्कृतियों (४.३ चरण से या तो कुल BMCs या ५.६ कदम से अनुयाई BMSCs), धाराप्रवाह है उंहें osteoblasts में संस्कृति मीडिया स्विचन द्वारा अंतर मीडिया osteoblast ।
    2. भिंनता मीडिया हर दूसरे दिन बदलें । कोशिकाओं खनिज के सफेद पिंड का उत्पादन शुरू करते हैं । उंहें अच्छी तरह के तल पर नग्न आंखों से कल्पना; यह प्रक्रिया कुछ दिनों के भीतर 3 सप्ताह के लिए हो सकता है ।
      1. osteoblastogenesis का आकलन करने के लिए, धारा 8 में वर्णित के रूप में कुओं पर क्षारीय फॉस्फेट धुंधला और/या वॉन Kossa दाग प्रदर्शन करते हैं ।
        नोट: सेल monolayer के व्यवधान से बचने के लिए थोड़ा सा कोण पर प्लेटों को झुकाकर मीडिया को सावधानी से बदलें ।
  2. Adipocytes
    1. एक साथ मिलाकर adipocyte आधार मीडिया बनाओ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) उच्च ग्लूकोज, भ्रूण गोजातीय सीरम के 10 मिलीलीटर, पेनिसिलिन के 1 मिलीलीटर/Streptomycin, १०० µ एल 20 मिमी Rosiglitazone और १०० µ एल के 2 मिमी इंसुलिन के ९० मिलीलीटर । यदि आवश्यक हो, इस मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर सप्ताह के लिए भेदभाव प्रयोग के दौरान स्टोर ।
    2. ६२.५ mm 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) के २०० µ l को जोड़कर adipocyte प्रेरण मीडिया बनाओ और µ बेस मीडिया के 25 एमएल के लिए 1 मिमी डेक्समेतएसॉनी के 25 adipocyte एल ।
    3. एक बार BMSCs संस्कृतियों (४.३ चरण से या तो कुल BMCs या ५.६ कदम से अनुयाई BMSCs), धाराप्रवाह है adipocyte प्रेरण मीडिया को मीडिया बदल रहे हैं । भेदभाव के इस दिन 0 पर विचार करें ।
    4. ४८ h के बाद, मीडिया को निकालें और adipocyte प्रेरण मीडिया के साथ संस्कृति को ताज़ा करें ।
    5. 4 दिन पर, adipocyte आधार मीडिया के लिए स्विच करें ।
      नोट: लिपिड बूंदों दिन के रूप में प्रदर्शित होने शुरू कर सकते हैं 2 या दिन 4.
    6. 7 दिन पर, कि कोशिकाओं को अधिकतम लिपिड बूंदों जमा है और एक परिपक्व adipocyte के समान एक phenotype प्रदर्शन का पालन करें । इस बिंदु पिछले संस्कृति मत करो, क्योंकि यह कोशिका मृत्यु/

7. Osteoclasts में HSCs का भेदभाव

  1. ५० µ एल के 25 µ जी/NFKB Ligand (RANKL) के रिसेप्टर उत्प्रेरक की एमएल और 15 µ एल के 25 µ जी/macrophage के 25 मिलीलीटर mCSF संस्कृति मीडिया के लिए उत्तेजक फैक्टर (BMSC) को जोड़कर अस्थिशोषक भेदभाव मीडिया बनाओ ।
  2. एक बार कुल BMCs (४.३ कदम से) या गैर अनुयाई कोशिकाओं (५.२ कदम से) के लिए अच्छी तरह से संलग्न हैं, संस्कृति मीडिया अस्थिशोषक भेदभाव मीडिया को बंद किया जा सकता है । भेदभाव मीडिया हर दूसरे दिन की भरपाई ।
  3. अस्थिशोषक संस्कृतियों का निरीक्षण 10x आवर्धन पर एक खुर्दबीन के नीचे हर दिन । निरीक्षण है कि osteoclasts फ्यूज और फार्म multinucleated कोशिकाओं, आमतौर पर भेदभाव के दिन 5-7 के आसपास ।

8. सना

  1. Osteoblasts
    नोट: क्षारीय फॉस्फेट (एपी) धुंधला के लिए, हम अक्सर एक एपी धुंधला किट का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) दिशा निर्देशों के अनुसार.
    1. निम्नलिखित किट निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार एपी धुंधला प्रदर्शन करते हैं ।
      1. महाप्राण मीडिया और पंजाबियों के साथ कुल्ला कोशिकाओं । कमरे के तापमान पर 12 मिनट के लिए पंजाब में 4% Paraformaldehyde (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ।
      2. इस बीच, एपी दाग किट से ५०० µ एल सोडियम नाइट्राइट जोड़ने के लिए ५०० µ l FRV-क्षारीय समाधान और धीरे मिश्रण से रिएजेंट का उपयोग कर ap समाधान; 2 मिनट के लिए खड़े हो जाओ २२.५ एमएल डीएच2ओ और ५०० µ एल Naphthol जोड़ें के रूप में द्वि alkaline । मिश्रण धीरे ।
        चेतावनी: पीएफए विषाक्त है और देखभाल के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
      3. एक बार कोशिकाओं को तय कर रहे हैं, पंजाबियों के साथ कुल्ला और एक अच्छी तरह से एपी समाधान जोड़ने (1 के लिए 2 मिलीलीटर प्रति) । एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर और चलो प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए दाग । समाधान महाप्राण, आसुत जल से धो लें, और थाली सूखी अनुमति देते हैं ।
    2. एक कैमरे का उपयोग कर alkaline फॉस्फेट सकारात्मक कोशिकाओं का पालन करने के लिए दाग कालोनियों की छवियों को प्राप्त करें ।
    3. वैकल्पिक रूप से वॉन Kossa के बजाय alkaline फॉस्फेट दाग प्रदर्शन करते हैं । इसके लिए, आसुत जल के साथ कुओं को अच्छी तरह धोकर किसी भी बचे हुए पंजाबियों को सिल्वर नाइट्रेट के साथ हाला जाएगा।
      1. कमरे के तापमान पर 12 मिनट के लिए पंजाब में 4% पीएफए के साथ कोशिकाओं को ठीक करें । फिर, अच्छी तरह से कवर और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मजबूत प्रकाश को बेनकाब करने के लिए पर्याप्त 5% चांदी नाइट्रेट समाधान जोड़ें ।
    4. चांदी नाइट्रेट समाधान निकालें और आसुत जल के साथ एक अच्छी तरह कुल्ला । कोशिकाओं के लिए 5% सोडियम thiosulfate समाधान जोड़ें और 3 मिनट के लिए खड़े हो जाओ ।
    5. सोडियम thiosulfate को महाप्राण और आसुत जल से धोएं । प्लेट सूखी और नग्न आंखों से काले भूरे रंग में दाग खनिज जमा निरीक्षण करते हैं ।
  2. Adipocytes
    1. तेल लाल ओ (ओरो) धुंधला के लिए, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 10% तटस्थ buffered Formalin का उपयोग कर कोशिकाओं को ठीक ।
    2. इस बीच में, isopropanol के 10 मिलीलीटर में ०.०३५ जी भंग करके ओरो स्टॉक समाधान करना । यह एक 6 अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त है । मिश्रण और एक फिल्टर पेपर (ताकना आकार 11 µm) का उपयोग कर समाधान पारित ।
    3. कमजोर द्वारा ओरो काम समाधान बनाओ ओरो स्टॉक समाधान के 6 आसुत पानी की मिलीलीटर के साथ 9 मिलीलीटर । उपयोग के लिए तैयार जब तक एक झूली कुरसी पर समाधान छोड़ दें ।
    4. आसुत जल में ६०% isopropanol तैयार (एक अच्छी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त बनाने के लिए) ।
    5. एक बार कोशिकाओं के ठीक हो जाने पर, निर्धारण को हटा दें और आसुत जल के साथ एक बार धो लें । 1 मिनट के लिए ६०% isopropanol समाधान के साथ पानी बदलें ।
      नोट: प्लेट tipping करते समय तरल धीरे से जोड़ें; adipocytes बहुत आसानी से उखाड़ लेना ।
    6. isopropanol निकालें और पर्याप्त ओरो काम समाधान जोड़ने के लिए सभी कोशिकाओं को कवर । कमरे के तापमान पर एक कम गति घुमाव पर 15 मिनट के लिए मशीन । ओरो निकालें और आसुत जल के साथ दो बार धो लो ।
      नोट: इस बिंदु पर, ओरो-सना हुआ लिपिड बूंदों माइक्रोस्कोप के तहत visualized किया जा सकता है ।
    7. ओरो के लिए, एक अच्छी तरह से १००% isopropanol की 1 मिलीलीटर जोड़कर ओरो और धीरे से 10 मिनट के लिए घोड़ा द्वारा दाग ।
    8. इस बीच, एक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करने के लिए एक मानक वक्र निंनलिखित 8 ओरो काम समाधान (२,१०० µ g/एमएल) और एक मंदक के रूप में isopropanol का उपयोग कर मानकों के आधार पर बना: ५००, ३५०, ३००, २५०, १५०, १००, ७५, और 0 µ g/एमएल ।
    9. मानकों के २०० µ एल लोड और एक प्लेट पर triplicates में दाग नमूने और ४९० एनएम पर अवशोषक पढ़ें ।
      1. प्रत्येक नमूने मानक वक्र पर आधारित के लिए ओरो की एकाग्रता का निर्धारण ।
        नोट: हम कोशिकाओं की संख्या के लिए एकाग्रता ओरो को सामान्य करने की सलाह देते हैं. सेल संख्या क्रिस्टल वायलेट धुंधला या डीएनए मात्रा द्वारा मात्रा जा सकता है ।
  3. Osteoclasts
    नोट: जब तैयार, हम Tartrate के लिए धुंधला osteoclasts-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप) जाल धुंधला किट का उपयोग सुझाव ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    1. जाल धुंधला के लिए, पंजाब में २.५% glutaraldehyde के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए फिक्स कोशिकाओं । बीच-बीच में एक साथ मिक्स करके ट्रैप सॉल्यूशन बना ५० µ l का फास्ट Garnets बेस सॉल्यूशन, ५० µ l की सोडियम नाइट्राइट, ४.५५ मिलीलीटर की आसुत जल, ५० µ l की Napthol के रूप में-Biphosphate, २०० µ l का एसीटेट सॉल्यूशन और १०० µ l Tartrate सॉल्यूशन.
    2. ३७ ° c में 1 ज के लिए ट्रैप समाधान जोड़ने से पहले, महाप्राण को बंद कर दो बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें ।
    3. एक खुर्दबीन (आवर्धन 10x) के तहत osteoclasts गिनती से पहले आसुत पानी से धो लें । ट्रैप+ कक्ष 3 या अधिक नाभिक के साथ जामुनी दिखाई देते हैं ।

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Representative Results

सेल संस्कृतियों का अवलोकन
दो संस्कृति तकनीक BMSCs और HSCs के शामिल BMCs की एक मिश्रित जनसंख्या पर भेदभाव के आकलन की अनुमति (कुल BMCs, आंकड़ा 1a) या BMSCs से HSCs विभाजन की आबादी (अनुयाई BMSCs, चित्रा 1b) । ४८ मानव संसाधन के बाद मज्जा से कोशिकाओं को अलग कर रहे है और मढ़वाया (चित्रा 1C), वे तेजी से प्लास्टिक की संस्कृति की थाली के नीचे करने के लिए देते है और एक monolayer के रूप में करते हैं । एक बार जब कोशिकाओं संगम (चित्रा 1 d) तक पहुंचने, वे विभेद परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

BMSCs Osteoblasts में विभेदित
BMSCs की धाराप्रवाह संस्कृतियों एक osteogenic ascorbic एसिड और β-ग्लिसरॉल फॉस्फेट (चित्रा 2a, बी) से बना मीडिया का उपयोग कर osteoblasts में अंतर किया जा सकता है । विभेद के कुछ दिनों के बाद osteoblasts क्षारीय फॉस्फेट (चित्रा 2c) व्यक्त करना शुरू कर दीजिये. इसके अलावा भेदभाव osteoid मैट्रिक्स उत्पादन ट्रिगर और अंत में इस मैट्रिक्स के खनिज (चित्रा 2d) होगा । दिलचस्प है, केवल कोशिकाओं की एक अनुपात osteoblasts में इन विट्रोमें अंतर होगा । दरअसल, क्रिस्टल वायलेट (चित्रा 2E) के साथ धुंधला पता चलता है कि नहीं सभी कोशिकाओं alkaline फॉस्फेट या थाली mineralize व्यक्त करते हैं ।

BMSCs Adipocytes में विभेदित
Adipogenesis मिश्रित BMCs की संस्कृतियों पर परीक्षण किया जा सकता है और साथ ही अधिक समरूप सेल जनसंख्या पर । के रूप में osteoblast भेदभाव के साथ मनाया, चाहे मिश्रित आबादी (चित्रा 3) या विभाजित आबादी (चित्र बी) का उपयोग किया जाता है, केवल कोशिकाओं के अनुपात adipogenic हैं । Adipocytes कई लिपिड vacuoles कि ओरो के साथ लाल रंग में दाग किया जा सकता है के साथ गोल दिखाई देते हैं (चित्रा 3सी) । हमारे अनुभव में, इन विट्रो adipocytes हमेशा vivo white adipocytes में मल्टी vacuolated ओमपुरी दिखाई देते हैं । जीनोटाइप या संस्कृति की स्थिति में अंतर एक बिंदु जहां adipocytes अलग और संस्कृति की थाली में तैरने के लिए adipogenesis वृद्धि हो सकती है । इसे हल करने के लिए, adipogenesis प्रयोग एक पूर्व समय बिंदु पर रोका जा सकता है ।

HSCs Osteoclasts में विभेदित
Osteoclastogenesis mCSF और RANKL के साथ मीडिया के पूरक द्वारा संस्कृतियों में प्रेरित किया जा सकता है । HSCs तेजी से फ्यूज करने के लिए multinucleated कोशिकाओं है कि जाल के लिए सकारात्मक दाग (चित्र 4a) बनाने के लिए शुरू करते हैं । उन osteoclasts में सक्षम है resorbing खनिज मैट्रिक्स इन विट्रो और इस तरह osteoclastic गतिविधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 4B).

Figure 1
चित्र 1: BMSCs और HSCs की संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध समयरेखा । विभिन्न संस्कृति तकनीक कोशिकाओं की एक मिश्रित जनसंख्या (ए) या अनुयाई BMSCs (बी) से बना कुल BMCs उपज के लिए । BMSCs संस्कृति की प्रतिनिधि छवि C57B6/जे चूहों ४८ hr से उनके चढ़ाना (C) के बाद और वे HSCs (D) से विभाजित कर रहे हैं के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : BMSCs संस्कृतियों के कुओं की छवियां osteoblasts में विभेदित । BMSCs से पहले (ए) और उसके बाद (ख) osteogenic मीडिया में रखा जा रहा है । Osteoblasts गुलाबी में क्षारीय फॉस्फेट अभिव्यक्ति के लिए दाग हो सकता है (ग) और ब्राउन (डी) में खनिज जमा करने के लिए । क्रिस्टल वायलेट क्रम में भिंनता के बाद सेल संख्या का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (E) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: BMSCs की संस्कृतियों के प्रतिनिधि छवियों adipocytes में विभेदित । ओरो-सना adipocytes BMSCs (ए) और एक विभाजन संस्कृति (बी) की एक मिश्रित जनसंख्या से adipogenic मीडिया में 7 दिनों के बाद प्राप्त की । ओरो (सी) के साथ सना हुआ एक adipocyte की छवि । ठहराव के बाद adipogenic मीडिया में 7 दिनों के बाद ओरो के (डी) और (ई) के बाद क्रिस्टल वायलेट अवशोषित करने के लिए सामांय । डेटा अर्थ के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व त्रुटि पट्टियों के साथ साधन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: HSCs osteoclasts में विभेदित संस्कृतियों । बड़े बैंगनी-गुलाबी multinucleated कोशिकाओं (A) के रूप में दिखने वाले osteoclasts का ट्रैप धुंधला । खनिज की सतह osteoclasts द्वारा छोड़ दिया याला गड्ढ़े के साथ वॉन Kossa द्वारा काले रंग में सना हुआ HSCs से 7 दिनों के बाद (B) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस अनुच्छेद में, BMSCs की संस्कृति के दो तरीकों उनके फायदे और सीमाओं के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं । अस्थि मज्जा से आ रहा अलग कोशिकाओं को एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है. हालांकि, mesenchymal स्टेम कोशिकाओं या osteoclastic progenitors के एक सेल जनसंख्या प्रतिनिधि प्राप्त करने मज्जा गुहा के विविध सेलुलर पर्यावरण के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है ।

संवर्धन अस्थि मज्जा सामग्री की संपूर्णता के एक करीबी प्रतिनिधित्व प्रदान करता है vivo microenvironment में । फिर भी, चूहों के विभिन्न समूहों से अलग कोशिकाओं (पादी, उपचार, उम्र, आदि) की स्थापना में BMSCs या HSCs की एक बहुत अलग संख्या में परिणाम कर सकते हैं इन विट्रो प्रयोग. इसलिए, BMSCs और HSCs को अलग और फिर से चढ़ाना उंहें भिंनता प्रयोग के शुरू में सेल संख्या पर एक बेहतर नियंत्रण की अनुमति देते हैं । हालांकि, सेल संस्कृति के विविधता को कम करने BMSCs या HSCs के परिणामों के रूप में दोनों स्राव कारक है कि प्रभाव mesenchymal और osteoclastic भेदभाव को प्रभावित कर सकता है । अलगाव और BMSCs और HSCs की संस्कृति को डिजाइन करते समय उन सीमाओं पर विचार करना जरूरी है ।

अस्थि मज्जा में मौजूद कोशिका आबादियों की भीड़ आंकड़ों की व्याख्या में चुनौतियां पेश कर सकती है. HSCs और BMSCs के अलावा अस्थि मज्जा microenvironment में भी विभेदित प्रतिरक्षा कोशिकाएँ, लाल रक्त कोशिकाएँ, endothelial कोशिकाएँ होतीहैं, आदि. उन आबादी अनुयाई या गैर अनुयाई अंश में रह सकते है और इस तरह प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । छंटाई BMSCs एक विकल्प के लिए एक "purer" सेल की आबादी को प्राप्त करने के लिए हो सकता है । दरअसल, BMSCs CD34 व्यक्त करने के लिए लगा रहे हैं, जबकि HSCs10मत करो । हालांकि, यह भी सुझाव दिया गया था कि BMSCs की सतह पर CD34 की कमी संस्कृति का परिणाम हो सकता है और एक अध्ययन से पता चला है कि CD34 के एक गैर अनुयाई सबसेट+ BMSCs osteoblast, adipocytes और chondrocytes11में अंतर कर सकता है, 12. इसलिए, जब BMSCs को अलग करने के लिए छंटाई पर विचार, अच्छी तरह से परिभाषित मार्करों की एक सरणी पहले से डिजाइन किया जाना चाहिए । सेल छँटाई करने के लिए अन्य बाधाओं समय और लागत रहे हैं. दरअसल, एक छंटाई कदम जोड़ने अलगाव प्रोटोकॉल के समय काफी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लागत में एक महत्वपूर्ण वृद्धि बढ़ सकता है । संक्षेप में, कोशिकाओं छंटाई वर्तमान तकनीकी चुनौतियों कि उपज और BMSCs की गुणवत्ता को कम कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों ने खुलासा किया कि उनके पास हितों का कोई वित्तीय संघर्ष नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01 AR061164-01A1) ने समर्थन दिया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200μL pipet tips  Rainin 17014401
1.5 mL centrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
15 mL conical tube  VWR 89039-668
50 mL conical tube VWR 89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Sigma-Aldrich 21-040-CM
Ethanol Fisher Science 04-355-451
Dissection tools
70 μm filters BD Falcon 352350
0.25% trypsin Gibco 25200
Kimwipe VWR 82003-820
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Alkaline Phosphatase kit Sigma-Aldrich 86R
Silver Nitrate Sigma-Aldrich S6506
Sodium Thiosulfate Sigma-Aldrich S7026
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764
10% Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
Whatman filter Grade 1 Sigma-Aldrich Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit Sigma-Aldrich 387A
Glutaraldehyde Electron 16220
MEMα Gibco 12571
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
β-glycerol phosphate Sigma-Aldrich G9891
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
DMEM High Glucose  Sigma-Aldrich D5796
Rosiglitazone Cayman Chemical 717410
Insulin Sigma-Aldrich I6634
IBMX Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
RANKL Peprotech 310-01
mCSF Peprotech 315-02
Axio Observer inverter microscope Zeiss

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References

  1. Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
  2. Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
  3. Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
  4. Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
  5. Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
  6. DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
  7. Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  10. Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
  11. Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
  12. Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक १३१ Mesenchymal अलगाव विभेद osteoblast adipocytes osteoclasts
अलगाव, संस्कृति, और चूहों से अस्थि मज्जा Stromal कोशिकाओं और अस्थिशोषक Progenitors के भेदभाव
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Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E.,… More

Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. J. Vis. Exp. (131), e56750, doi:10.3791/56750 (2018).

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