Summary
I denne artikkelen presenterer vi metoder å isolere og skille benmarg stromal celler og blodkreft stamceller fra musen lange ben. To forskjellige protokoller presenteres gir ulike celle populasjoner egnet for ekspansjon og differensiering inn osteoblasts, adipocytter og osteoklast.
Abstract
Benmarg stromal celler (BMSCs) utgjør en celle befolkningen rutinemessig brukes som en representasjon av mesenchymal stamceller i vitro. De bor i benmargen hulrom sammen med blodkreft stamceller (HSCs), som kan gi opphav til røde blod celler og immun progenitors osteoklast. Dermed utdrag av celle populasjoner fra benmargen resultatene i en svært heterogen blanding av ulike celle populasjoner, som kan presentere utfordringer i eksperimentell design og forvirre data tolkning. Flere isolasjon og kultur teknikker er utviklet i laboratorier for å få mer eller mindre homogen bestander av BMSCs og HSCs invitro. Her presenterer vi to metoder for isolering av BMSCs og HSCs fra musen lange ben: en metode som gir en blandet befolkning av BMSCs og HSCs og en metode som forsøker å skille to celle populasjoner basert på overholdelse. Begge metodene gir cellene egnet for osteogenic og adipogenic differensiering eksperimenter så vel som funksjonell analyser.
Introduction
Primære murine BMSCs brukes ofte som en i vitro modell av mesenchymal stamceller siden sin oppdagelse i tidlig 1980-tallet1. Faktisk opprettholde kulturer av plast-tilhenger celler tømmes fra benmargen hulrommet av lange ben kapasitet til å differensieres til osteoblasts, osteoklast, chondrocytes eller adipocytter i mange studier2,3, 4 , 5. benmargen er imidlertid en unik vev består av mange ulike celle populasjoner inkludert, men ikke begrenset til, BMSCs, HSCs, endothelial, og immunsystemet cellene. Dermed kan isolasjon og kultur teknikker gi celle populasjoner med forskjellige homogenitet. Bruk av teknikker for å teste differensiering potensielle fra celler kan være utfordrende. For eksempel når du sammenligner cellene fra mus med ulike genotyper, starter med en mikset-celle befolkningen begrenser tolkningen av dataene. Derimot å oppnå homogene bestander av BMSCs og HSCs kan være teknisk vanskelig og ikke som representant for en ex vivo -modell.
I vårt laboratorium er vi primært interessert i bruken av BMSCs på grunn av deres potensial til differensieres i osteoblasts, osteoklast og adipocytter. Her presenterer vi teknikker for BMSCs og HSCs isolasjon og kultur brukes til å vurdere osteoblastogenesis eller adipogenesis i vitroog kulturer av HSCs til å skille ut osteoklast. En metode bruker en blandet befolkning beinmargen celleområde (BMCs) som inneholder BMSCs og HSCs egnet for adipogenesis, osteoblastogenesis og osteoclastogenesis (kalt Total BMCs). Denne metoden er en nærmere ex vivo representasjon av heterogenitet som er funnet blant cellene i benmargen microenvironment. En annen metoden skiller tilhenger fra ikke-tilhenger celler å kultur "renere" bestander av BMSCs og HSCs (kalt tilhenger BMSCs). Den senere tillater cellekultur eksperimenter for å starte med et mer nøyaktig antall BMSCs eller HSCs og reduserer muligheten av komplekse indirekte effekter av andre celle populasjoner som forblir i kulturen. Begge metodene har vært tidligere publisert og brukes til å håndtere forskjellige forskning spørsmål6,7,8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Maine Medical Center Research Institute.
1. samling rør forberedelse
- Gjøre BMSC kultur media ved å supplere Minimum viktig Medium î± (MEM α) med 10% fosterets Bovine Serum og 1% av Penicillin/Streptomycin.
- Plass 100 µL BMSC kultur medier i 1,5 mL microcentrifuge rør. 3 ben passer vanligvis i ett enkelt rør så forberede tilsvarende.
- Skjær endene av 200 µL pipette-spisser nok slik at de passer i sentrifuge rørene. Sett inn tips i rør og sikre at dekslene kan lukke før du plasserer rørene på isen.
Merk: Alternativt 0,75 mL microcentrifuge rør med kutt endene kan settes inn i 1,5 mL microcentrifuge røret.
2. innhøstingen av bein fra mus
- Avlive dyrene bruker CO2 etterfulgt av cervical forvridning og spray dem med 70% etanol.
Merk: Kontroller at dyr fra samme kjønn og helst samme alder brukes. Vi bruk rutinemessig dyr alderen 7 til 8 uker. Vi anbefaler pooling celler fra minst 3 dyr per eksperimentelle grupper å gi en bedre representant og reproduserbar celle befolkningen. -
Plass euthanized musen på ryggen på dissecting bordet. Bruk tang til å opprette et telt på huden på magen. Lag et lite innsnitt (rundt 1 cm) med sterilt dissecting saks. Peel tilbake huden mot beina og føtter på klipp for å utsette lavere magen og bena.
- Kuttet under ankelen felles fjerne foten. Skjær langs iliaca bølgetopp på hip å skille femur hodet fra ene. Musen er fortsatt på ryggen, gjør et snitt i den ene å skille de to iliaca beina.
- Bruker lofri kluter, forsiktig fjerne muskelen fra femurs, tibias og iliaca bein.
Merk: Kutte så mye av sener og muskler fra benet som mulig gjør rengjøringen raskere og enklere med lofri kluter (f.eks, kimwipes). Vær forsiktig når du manipulerer bein som de pleier å lett brekke og deres skjørhet kan økes med visse genotyper. - Når alle prøvene har blitt dissekert, plassere dem i PBS på is og flytte til en steril kultur hette for resten av trinnene i isolasjon.
Merk: Arbeider tas aseptisk som mulig vil redusere potensialet for forurensning i kulturer. - Foreta små kutt (ca 1 til 2 mm) på begge proksimale og distale endene av bein før du plasserer dem i delt tips i sentrifuge rørene.
Merk: Pass på å klippe tilstrekkelig slik at marg kan være sentrifugeres imidlertid må være forsiktig å unngå kutte mye som celle populasjoner pleier å variere basert på nærhet innen benmarg. - Sentrifuger 10.000 x g 15 s ved romtemperatur. Kontroller at alle margen er spyles og pelleted nederst på 1,5 mL tube mens bein er inne skivene (enten 200 µL Pipetter tips eller 0,75 mL microcentrifuge rør). Når alle margen samles, fjerne skivene med bein fra samling rør.
Merk: Hvis alle margen tømmes, bein vises hvite. Men hvis margtransplantasjon forblir i enkelte bein, prøv kutte ender på nytt og sentrifuge.
3. celle suspensjon
- Bruker en 25 G nål, trekke pellets cellen opp og ned sakte til bryter opp klumper og kombinere alle prøvene i en enkelt 15 mL konisk rør. Legge til 10 mL av BMSC kultur medier per 500 µL av prøver.
- Plasser et 70 µm filter på en 50 mL konisk rør og passerer cellen suspensjon gjennom dette filteret for å fjerne mulig beinfragmenter.
4. plating og kultur av blandet bestander av bein margtransplantasjon celler (totalt BMCs)
Merk: Celler er kultivert på 37 ° C i en inkubator med 5% CO2.
- Beregn antall celler og plate dem til 1,0 x 106 celler/cm2 i kultur medier. Tillate 72 h blandet kultur for cellene å feste.
Merk: Vi anbefaler fortynne celle suspensjon 20 x kultur medier og fortynne igjen i trypan blå før telling celler ved hjelp av en hemocytometer. 7-uke-gamle mannlige C57Bl6/J mus, vi gi rutinemessig en celle rekke rundt 50 x 106 celler men alder, kjønn og belastning kan påvirke celle nummer sterkt.
Merk: En blanding populasjon av celler skal knytte nederst på kultur godt. - Etter 72 h, Fjern media og erstatte den med ferske media. Fortsette å endre media annenhver dag og sjekk for confluency. Når cellene når 80-100% confluency, er de klar for differensiering.
Merk: Fordi denne kulturen er blandet med både BMSCs og HSCs, den kan direkte brukes for osteoblastogenesis, adipogenesis samt osteoclastogenesis.
5. plating og kultur av Split befolkningen i BMSCs (tilhenger BMSCs)
Merk: Celler er kultivert på 37 ° C i en inkubator med 5% CO2.
- Plate alle cellene samles inn fra femurs, tibias og iliaca bein en mus i en 10 cm kultur parabol (55 cm2 av kultur-området).
Merk: Når pooling 2-3 C57BL/6J mus, vi vanligvis plate 'totalt' benmarg befolkningen i en 150 cm2 kolbe. - Etter 48 timer av blandet kultur, fjerne kultur media (som inneholder ikke-tilhenger HSCs). Hvis osteoclastogenesis eksperimenter utføres, angi denne populasjonen av ikke-tilhenger celler til side (se avsnitt 7), hvis ikke, leveringstanken og forkaste disse cellene.
- Vask plate/flasken PBS nøye til ikke forstyrr de tilkoblede cellene.
- Fjern PBS og løft cellene ved å legge 0,25% trypsin og rugende ved 37 ° C i 1-3 min. Quench trypsin ved å legge til cellen media celle suspensjon. På dette punktet, BMSCs, som er nå løftet, kan telles (som tidligere gjort i trinn 4.1) og belagt for senere eksperimenter.
- Beregne antall celler nødvendig for plating. Sentrifuge nødvendig volumet av cellen suspensjon 1000 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
Merk: Cellene er vanligvis belagt basert på sluttpunktet eksperimenter. For eksempel hvis protein/RNA isoleres plate vi vanligvis på en høyere tetthet (~1.0-2.0 x 106 celler/godt i 6-vel plate). - Fjern media og resuspend celle pellet i volumet av kultur medier nødvendig for plating. Plate cellene i kultur medier etter eksperimenter og tillate dem å knytte for et par dager. Når BMSCs når confluency, fortsette å utføre differensiering.
6. differensiering av BMSCs
-
Osteoblasts
- Gjør osteoblast differensiering media ved å legge til 800 µL 1 M β-glyserol fosfat i PBS og 200 µL av 0,5 M askorbinsyre i PBS til 99 mL BMSC kultur medier (se trinn 1.1 for sammensetningen av BMSC kultur media).
- Når BMSCs kulturer enten (totalt BMCs fra trinn 4.3) eller tilhenger BMSCs fra trinn 5.6 er confluent, skille dem i osteoblasts av bytte kultur osteoblast differensiering Media.
- Erstatte differensiering media annenhver dag. Celler produseres hvit knuter av mineralisering. Visualisere dem med det blotte øye på bunnen av brønnen; Denne prosessen kan skje innen få dager til 3 uker.
- For å vurdere osteoblastogenesis, utføre alkalisk fosfatase flekker og/eller Von Kossa flekker på brønnene som beskrevet i del 8.
Merk: Endre media nøye ved å vippe platene i en liten vinkel for å unngå forstyrrelser i celle monolayer.
- For å vurdere osteoblastogenesis, utføre alkalisk fosfatase flekker og/eller Von Kossa flekker på brønnene som beskrevet i del 8.
- Gjør osteoblast differensiering media ved å legge til 800 µL 1 M β-glyserol fosfat i PBS og 200 µL av 0,5 M askorbinsyre i PBS til 99 mL BMSC kultur medier (se trinn 1.1 for sammensetningen av BMSC kultur media).
-
Adipocytter
- Gjøre adipocyte base media ved å blande sammen 90 mL Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM) høy glukose, 10 mL av Fetal Bovine Serum, 1 mL av Penicillin/Streptomycin, 100 µL 20 mM rosiglitazon og 100 µL av 2 mM Insulin. Eventuelt kan du lagre dette mediet på 4 ° C for uken under differensiering eksperimentet.
- Gjør adipocyte induksjon media ved å legge 200 µL av 62.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) og 25 µL av 1 mM deksametason til 25 mL Adipocyte Base medier.
- Når BMSCs kulturer enten (totalt BMCs fra trinn 4.3) eller tilhenger BMSCs fra trinn 5.6 er confluent, endre media adipocyte induksjon Media. Vurder denne dagen 0 av differensiering.
- Etter 48 timer, Fjern media og oppdatere kulturen med adipocyte induksjon media.
- På dag 4, bytte til adipocyte base media.
Merk: Lipid dråper kan starte vises så tidlig som i dag 2 eller dag 4. - På dag 7, observere at celler har samlet maksimal lipid dråper og vise en fenotypen ligner på en eldre adipocyte. Ikke kultur forbi dette punktet, fordi det kan føre til celle død/avdeling.
7. differensiering av HSCs i Osteoclasts
- Gjør Osteoclast differensiering Media ved å legge til 50 µL av 25 µg/mL av reseptor aktivator av NFKB Ligand (RANKL) og 15 µL av 25 µg/mL macrophage koloni stimulerende faktor (mCSF) 25 mL av BMSC kultur medier.
- Når de totale BMCs (fra trinn 4.3) eller ikke-tilhenger celler (fra trinn 5.2) er koblet til brønnen, kan kultur medier bli slått Osteoclast differensiering Media. Fylle differensiering media annenhver dag.
- Observere osteoclast kulturer hver dag under et mikroskop på 10 X forstørrelse. Observere at osteoklast sikring og danner multinucleated celler, vanligvis rundt dag 5-7 av differensiering.
8. farging
-
Osteoblasts
Merk: Alkalisk fosfatase (AP) farging, vi ofte bruke en AP flekker kit (se Tabell for materiale) i henhold til retningslinjene.- Utføre AP farging av følgende kit produsentens retningslinjer.
- Sug opp media, og skyll celler med PBS. Fastsette cellene med 4% Paraformaldehyde (PFA) i PBS i 12 min ved romtemperatur.
- I mellomtiden gjør AP løsningen bruker reagensene fra AP flekker kit ved å legge 500 µL natrium nitritt 500 µL FRV-alkalisk løsning og miksing forsiktig; La stå i 2 min. legge 22,5 mL dH2O og 500 µL Naphthol AS-BI alkaliske. Bland forsiktig.
Forsiktig: PFA er giftig og må håndteres med forsiktighet. - Når cellene er faste, skyll med PBS og legge til AP løsning i hver brønn (1-2 mL per brønn). Dekk med aluminiumsfolie og la flekken i 30 min ved romtemperatur beskyttet mot lyset. Sug opp løsningen, vask med destillert vann, og tillater plate tørke.
- Hente bilder farget kolonier bruker et kamera for å observere alkalisk fosfatase positiv celler.
- Du kan også utføre Von Kossa i stedet for alkalisk fosfatase flekker. For dette, vask brønner grundig med destillert vann som noen gjenværende PBS fremskynde med sølv nitrat.
- Fastsette cellene med 4% PFA i PBS i 12 min ved romtemperatur. Deretter Legg nok 5% Sølvnitrat løsning for å dekke brønnen og utsettes for sterkt lys 1t ved romtemperatur.
- Fjerne Sølvnitrat løsningen og skyll hver godt med destillert vann. Legg til 5% natrium tiosulfat løsning til cellene og la stå i 3 minutter.
- Sug opp natrium tiosulfat og vask med destillert vann. La platen tørr og observere mineral innskudd beiset i mørk brun/svart med blotte øye.
- Utføre AP farging av følgende kit produsentens retningslinjer.
-
Adipocytter
- For olje Red O (ORO) flekker, fikse cellene med 10% nøytrale fullbufrede Formalin 1t ved romtemperatur.
- I mellomtiden gjør ORO lager løsningen ved oppløsning 0,035 g i 10 mL isopropanol. Dette er tilstrekkelig for en 6-vel plate. Bland og gå løsningen ved å benytte en filter papir (pore størrelse 11 µm).
- Gjøre ORO arbeider løsningen ved å fortynne 9 mL ORO lagerløsning med 6 mL destillert vann. La løsningen på en rocker til du er klar for bruk.
- Forberede 60% isopropanol i destillert vann (gjøre nok til å dekke hver godt).
- Når cellene er faste, fjerne den etappe, den stabiliserende og vask gang med destillert vann. Erstatt vannet med 60% isopropanol løsningen for 1 min.
Merk: Legge til flytende sakte mens tipp plate; adipocytter løsne lett. - Fjern isopropanol og legge nok ORO arbeider løsning for å dekke alle cellene. Inkuber i 15 min på en lav hastighet rocker ved romtemperatur. Fjerne ORO og vask to ganger med destillert vann.
Merk: på dette punktet, ORO-farget lipid dråper kan visualiseres under mikroskopet. - For å kvantifisere ORO, destain ORO ved å legge 1 mL av 100% isopropanol hver brønn og rocking sakte for 10 min.
- I mellomtiden forbereder en fortynning serie å lage en standard kurve basert på følgende 8 standarder bruker ORO arbeider løsning (2100 µg/mL) og isopropanol som en fortynner: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 og 0 µg/mL.
- Last 200 µL av standarder og destained eksemplene i triplicates på en tallerken og lese absorbans ved 490 nm.
- Bestemme konsentrasjonen av ORO for hvert utvalg basert på standardkurven.
Merk: Vi anbefaler normalisere konsentrasjonen ORO til celle nummer. Celle nummer kan kvantifiseres crystal violet flekker eller DNA antallet.
- Bestemme konsentrasjonen av ORO for hvert utvalg basert på standardkurven.
-
Osteoklast
Merk: Når du er klar, foreslår vi flekker osteoklast for Tartrate motstandsdyktig mot syre fosfatase (TRAP) bruke den FELLEN flekker kit (se Tabell for materiale).- For TRAP flekker, fikse celler for 30 min ved romtemperatur med 2,5% glutaraldehyde i PBS. I mellomtiden gjør FELLE løsning ved å blande sammen 50 µL av rask granater Base løsning, 50 µL av natrium nitritt, 4.55 mL destillert vann, 50 µL Napthol AS-Biphosphate, 200 µL Acetate løsning og 100 µL Tartrate løsning.
- Sug opp av bindemiddel, og skyll cellene med PBS to ganger før du legger til FELLE løsning for 1t på 37 ° C.
- Vask med destillert vann før telling osteoklast under et mikroskop (10 X forstørrelse). TRAP+ cellene vises lilla med 3 eller flere kjerner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversikt av cellekulturer
To kultur teknikker kan vurdering av differensiering på en blandet befolkning av BMCs består av BMSCs og HSCs (Total BMCs, figur 1A) eller en befolkning på BMSCs delt fra HSCs (tilhenger BMSCs, figur 1B). 48 hr etter cellene fra margen er isolert og belagt (figur 1 c), de raskt knytte til bunnen av plast kultur plate og tendens til å danne en monolayer. Når cellene når samløpet (figur 1 d), kan de brukes for differensiering analyser.
BMSCs i Osteoblasts
Confluent kulturer av BMSCs kan differensieres til osteoblasts ved hjelp av et osteogenic media består av askorbinsyre og β-glyserol fosfat (figur 2A, B). Etter noen dager med differensiering starte osteoblasts uttrykke alkalisk fosfatase (figur 2C). Ytterligere differensiering vil utløse osteoid matrise produksjon og til slutt mineraliseringen av denne matrisen (figur 2D). Interessant, vil bare en del av cellene skille i osteoblasts i vitro. Faktisk flekker med crystal violet (figur 2E) avslører at noen celler uttrykke alkalisk fosfatase eller mineralize platen.
BMSCs i adipocytter
Adipogenesis kan testes kulturer av blandet BMCs og mer homogene celle befolkningen. Som observert med osteoblast differensiering, om blandede befolkningen (figur 3A) eller delt befolkningen (figur 3B) brukes, bare en andel av cellene er adipogenic. Adipocytter vises rundt med flere lipid vacuoles som kan være farget i rødt med ORO (Figur 3 c). I vår erfaring vises i vitro adipocytter alltid flere vacuolated i motsetning til i vivo hvit adipocytter. Forskjeller i genotype eller kultur kan øke adipogenesis til et punkt der adipocytter koble og flyte i kultur plate. Løser kan adipogenesis eksperimentet stoppes på et tidligere tidspunkt.
HSCs i Osteoclasts
Osteoclastogenesis kan bli indusert i kulturer av supplere media med mCSF og RANKL. HSCs begynner å fusjonere raskt for å danne multinucleated celler som flekker positiv for TRAP (figur 4A). Disse osteoklast kan resorbing mineral matrise i vitro og dermed kan brukes til å vurdere osteoclastic aktivitet (figur 4B).
Figur 1: Skjematisk tidslinje av protokollene for kulturen i BMSCs og HSCs. Annen kultur teknikker å gi totale BMCs består av en blandet befolkning celler (A) eller tilhenger BMSCs (B). Representativt bilde BMSCs kultur isolert fra C57B6/J mus 48 hr etter deres plating (C) og etter at de er splittet fra HSCs (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Bilder av BMSCs kulturer differensiert i osteoblasts. BMSCs før (A) og (B) blir plassert i osteogenic medier. Osteoblasts kan være farget alkalisk fosfatase uttrykk i rosa (C) og mineral innskudd i brun (D). Crystal violet kan brukes for å representere celle nummer etter differensiering (E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representant bilder av kulturer av BMSCs differensiert i adipocytter. ORO-farget adipocytter fra en blandet befolkning på BMSCs (A) og en delt kultur (B) etter 7 dager i adipogenic medier. Bilde av en adipocyte farget med ORO (C). Kvantifisering av ORO etter 7 dager i adipogenic media før (D) og etter (E) normalisering til crystal violet absorbance. Dataene presenteres som middel med feilfelt som representerer standard feil av gjsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: HSCs kulturer differensiert i osteoklast. OVERTRYKKE farging av osteoklast vises som store lilla-rosa multinucleated celler (A). Mineralholdig overflaten farget i svart av Von Kossa med benresorpsjon groper etter osteoklast differensiert fra HSCs etter 7 dager (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen presenteres to metoder av kulturen i BMSCs med sine fordeler og begrensninger. Isolere celler fra benmargen er en relativt enkel prosess. Imidlertid kan skaffe en celle befolkningen representant av mesenchymal stamceller eller osteoclastic progenitors være utfordrende på grunn av ulike mobilnettet miljø av benmarg hulrom.
Dyrking helheten av benmarg innholdet gir en forhåndsvisning av den i vivo microenvironment. Likevel, isolere celler fra ulike grupper av mus (genotyper, behandlinger, aldre, etc.) kan føre til svært forskjellige flere BMSCs eller HSCs i begynnelsen av eksperimentet i vitro . Derfor tillate skiller BMSCs og HSCs og re-kontaktflate dem en bedre kontroll over hvor cellen ved starten av differensiering eksperimentet. Redusere mangfold i cellekultur kan imidlertid påvirke resultatene av BMSCs eller HSCs som både skiller faktorene som påvirker mesenchymal og osteoclastic differensiering. Det er viktig å vurdere de begrensningene når du utformer isolasjon og kultur av BMSCs og HSCs.
Mangfoldet av celle populasjoner i benmargen kan presentere utfordringer i tolkningen av dataene. HSCs og BMSCs inneholder benmarg microenvironment også differensiert immunceller, røde blodlegemer, endotelcellerosv. Disse befolkninger kan forbli i fraksjonen tilhenger eller ikke-tilhenger, og dermed kan påvirke eksperimentelle resultatene. Sortere BMSCs kan være et alternativ for å oppnå en "renere" celle befolkningen. Faktisk er BMSCs tenkt å uttrykke CD34 mens HSCs gjør ikke10. Men det var også antydet at mangelen på CD34 på overflaten av BMSCs kan være resultatet av kultur og en studie har vist at en ikke-tilhenger undergruppe av CD34+ BMSCs kunne skille i osteoblast, adipocytter og chondrocytes11, 12. derfor når sortering for å isolere BMSCs, en rekke veldefinerte markører bør være utformet på forhånd. Andre hindringer til celle sortering er timing og kostnader. Faktisk legger litt sortering kan øke tiden for isolasjon protokollen betraktelig og en betydelig økning i kostnader. I sammendraget presentere sortering celler tekniske utfordringer som kan redusere den avkastning og kvaliteten på BMSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne avslører at de har ingen økonomiske interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70 μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
References
- Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
- Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
- Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
- Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
- Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
- DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
- Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
- Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
- Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
- Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
- Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).
