Summary
我们提出了一种研究 mrna 翻译调节的方案, 在天花病毒感染细胞使用体外转录 Rna 基荧光素酶报告法。该方法可用于研究 mRNA 的cis元素的翻译调控, 包括 5 '-未翻译区域 (utr) 和 3 '-utr。使用此方法还可以检查不同的翻译启动模式。
Abstract
病毒 DNA 复制后转录的每一个痘病毒 mRNA 都有一个进化保守的、非模板化的 5 '-聚 (A) 引线在 5 '-utr 中。为了剖析 5 '-聚 (A) 引线在天花病毒感染过程中 mRNA 翻译中的作用, 我们开发了一种体外转录 rna 基荧光素酶报告法。本报告分析包括四个核心步骤: (1) PCR 扩增 DNA 模板进行体外转录;(2) 利用 T7 RNA 聚合酶进行体外转录生成 mRNA;(3) 转染, 将体外转录的 mRNA 引入细胞;(4) 检测荧光素酶活性作为翻译指标。本文介绍的基于 rna 的荧光素酶报告法规避了弓形虫感染细胞中质粒复制和质粒中的神秘转录问题。该协议可用于确定 mRNA 中的 cis元素在 poxvirus-infected 感染细胞以外的系统中的翻译调控, 包括 5 '-utr 和 3 '-utr。此外, 还可以利用这种方法研究不同的翻译启动模式, 如与上限相关、与上限无关、重新启动和内部启动。
Introduction
根据中心教条, 遗传信息从 dna 流向 rna, 然后最后流向蛋白质1,2。遗传信息的这种流动在许多层面上受到高度调控, 包括 mrna 翻译3,4。研究用记者检测来衡量基因表达的调控, 将有助于了解这一过程中涉及的调控机制。在这里, 我们描述了一种研究 mrna 翻译的方案, 使用体外转录 rna 为基础的荧光素酶报告法在 pxvirs 感染细胞。
痘病毒包括许多高度危险的人类和动物病原体5。与所有其他病毒一样, 弓形病毒完全依靠宿主细胞机制进行蛋白质合成6,7,8。为了有效地合成病毒蛋白, 病毒进化出许多策略来劫持细胞翻译机制, 将其重定向, 用于病毒 rna 7,8的翻译。病毒常用的一种机制是在其转录中使用cis作用元素。值得注意的例子包括内部核糖体进入网站 (ires) 和与上限无关的翻译增强剂 (cite)9、10、11。这些cis元素通过通过不同的机制吸引翻译机械 12,13, 14,使病毒转录具有平移优势。超过 100个 poxvirus mrna 在 5 '-未翻译区域 (5 '-utr) 中具有进化保守的cis作用元素: 在这些 mrna15,16的 5 '-端的 5 '-多边形 (a) 引线。这些 5 ' poly (a) 引线的长度是异质性的, 是由 poxvirus-c金编码 rna 聚合酶在转录17,18 期间的滑移产生的。我们和其他人最近发现, 5 ' poly (a) 领导者赋予 mrna 在感染疫苗病毒 (vacv) 的细胞的翻译优势, 该病毒是天花病毒 19,20的典型成员。
体外转录 rna 基荧光素酶报告法初步开发, 以了解 5 '-聚 (a) 引线在猪病毒感染19,21期间 mrna 翻译中的作用。尽管基于粒细胞 dna 的荧光素酶记者检测已被广泛使用, 但有几个缺点会使感染 poxvirus-infected 细胞的结果解释复杂化。首先, 质粒能够在受 vac 感染的22细胞中复制。其次, 神秘转录往往发生在质粒dna 18,23,24。第三, VAC 启动子驱动转录产生聚 (A)-异质长度的引线, 因此在一些实验18中难以控制聚 (A) 引线长度。体外转录 rna 酶报告法规避这些问题, 数据解释很简单。
该方法有四个关键步骤: (1) 聚合酶链反应 (PCR) 生成体外转录的 DNA 模板;(2) 体外转录生成 mRNA;(3) 转染, 将 mRNA 输送到细胞中;(4) 检测荧光素酶活性作为翻译指标 (图 1)。生成的 PCR 放大器包含 5 ' 到 3 ' 方向中的以下元素: T7-tokor、poly (A) 引线或所需的 5 '-utr 序列、萤火虫荧光酶开放阅读框架 (ORF), 然后是聚 (A) 尾。以 PCR 放大器为模板, 利用 T7 聚合酶进行体外转录合成 mRNA。在体外转录过程中,mRNAg 帽或其他盖帽模拟被纳入新合成的 mrna 中。封顶的转录被转移到未经感染或没有感染的 vacv 细胞。细胞裂解液在转染后的所需时间被收集, 以测量表明转染 mRNA 产生蛋白质的荧光素酶活性。本报告法可用于研究 5 '-utr、3 '-utr 或其他区域 mRNA 中的cis元素的翻译调控。此外, 基于体外转录 rna 的检测方法可用于研究不同的翻译起始机制, 包括与上限相关的起始、与盖帽无关的起始、重新启动和像 RES 这样的内部起始。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCR 制备体外转录Dna 模板
- 要通过 PCR 制备 DNA 模板, 请设计引物。在设计引物时, 考虑引物长度、退火温度 (Tm)、gc 含量、3 ' 端 g 或 c 等关键特性。
请注意:在这些文献25、26、27 中详细讨论了这些文献。 - 设计引物, 以生成 PCR 放大器包含以下元素在 5 ' 到 3 ' 的方向: T7-启动子, 聚 (A) 引线, 火红素酶 ORF 和聚 (A) 尾巴以下称为 T7_12A-fluc。设计引物 (正向和反向), 以涵盖模板 DNA 中不存在的所有其他元素 (图 2a)。
请注意:所有元素的顺序都可以在表1中找到. - 在正向引物 (5 '-3 ')28中包括几个额外的核苷酸, 然后是 t7 启动子、聚 (a) 引线或所需的 5 '-utr 序列和大约20个核苷酸, 根据 tm进行调整, 对应于报告基因的 5 ' 末端ORF。确保引物中的相应区域与基因的感觉链 (+ 链) 相同。
请注意:对于长 5 '-utr, 合成两个 DNA 片段: 一个是 T7 启动子, 另一个是长 5 '-utr, 另一个是记者基因的 ORF。使用重叠扩展 PCR 29 连接这两个片段。 - 设计反向引物 (5 '-3 '), 包括聚 (A) 尾和大约20个核苷酸, 根据 Tm进行调整, 对应于报告基因的 ORF 的 3 ' 端。确保引物中的相应区域与基因的反义链 (-链) 相同, 在聚 (A) 尾之前存在一个框架内停止密码子。
请注意:在聚 (A) 引线或聚 (A) 尾的 A 的所需长度可以在引物中定制。例如, 要在聚 (A) 尾添加 50 a, 反向引物应包含 50 T。同样, 在聚 (A) 引线中加上 2 0 a, 前引物应该需要 2 0个 A。 - 对于内部控制, 设计另一组引物, 其中包含 5 ' 至 3 ' 方向中的以下元素: T7 启动子, 包含 Kozak 序列的随机 5 '-utr 编码序列, Renilla luciferase orf 和 Poly (a) 尾以下称为 T7 _科扎克-吕克
- 在 PCR 管中, 按以下顺序添加试剂: DNase 无水、2倍高保真 DNA 聚合酶、引物和序列确认的荧光素酶模板 DNA (表 2)。
请注意:混合物中的单个成分的数量应根据反应体积进行调整。 - 使用标准的3步 (变性、退火、扩展) PCR 周期生成 DNA 模板, 如表 3所示。
请注意:退火温度 X°c 取决于所使用的引物集, 延长时间 T min 取决于所使用的 PCR 放大器大小和 DNA 聚合酶。 - 在1% 琼脂糖醋酸-edta (tae) 凝胶电泳 (含0.1μml 溴化乙酯) 中运行5-10 的 PCR 反应, 以及市售的分子量标准, 检测 PCR 产物。在紫外线照明器下可视化凝胶, 以确定 PCR 产品的大小。
- 在确定 PCR 产品的正确尺寸后, T7_12A-fluc ~ 1.7 kb, T7_Kozak-rluc ~ 1.0 kb, 使用市售 PCR 纯化试剂盒进行纯化。使用100μl 无核酸酶水 (图 2B) 来保护 dna。
- 纯化后, 使用分光光度计检查 DNA 浓度, 并确定 a260a280 比 (~ 1.8-2.0 是可以接受的)。
- 在-20°c 下储存纯化的 DNA 或立即用于体外转录。
2. 体外转录生成 mRNA
-
利用体外转录试剂盒 ( 图 3a), 在体外合成 PCR 产物中的 rna。
注: T7_12A-fluc 和 T7_Kozak rluc dna 模板分别用于合成12a-fluc 和 Kozak-Rluc Mrna。- 为此, 取一个微离心管, 并按以下顺序添加试剂: DNase-RNase 无水、NTP 缓冲混合、CAP 模拟、模板 PCR 产品、T7-rna 聚合酶混合物 (表 4)。
请注意:其他封盖系统也可用于按照制造商的指示进行体外转录后对 RNA 进行顺序封盖。 - 在37°c 下彻底混合并孵育2小时。
- 使用 RNA 纯化试剂盒继续纯化合成的 RNA。
- 为此, 取一个微离心管, 并按以下顺序添加试剂: DNase-RNase 无水、NTP 缓冲混合、CAP 模拟、模板 PCR 产品、T7-rna 聚合酶混合物 (表 4)。
- 在1.5% 琼脂糖-硼酸-edta (TBE) 凝胶 (含有0.5μgml 溴化物) 中运行纯化 rna 来检查 RNA。在紫外线照明器下显示凝胶 (图 3b)。
- 用分光光度计检查 RNA 的浓度, 并确定 a260a280 的比例 (~ 1.8-2.0 是可以接受的)。
- 将纯化后的 RNA 倾斜, 存放在-80°c。
3. 将 mRNA 转接到细胞
- 种子 HeLa 细胞在一个24孔板 (约约约约80-90% 融合第二天) 和孵育在37°c 的孵化器与 5% co 2 过夜.
- 在5的感染倍数 (MOI) 中感染维拉细胞, 以进行疫苗病毒 (VACV) 的治疗, 或保持未感染的平拉细胞进行比较。
请注意:MOI 是每个细胞的传染性病毒颗粒的数量。 - X 的 MOI = {[(细胞数量 * X)/病毒标题] * 每个 1 mL 介质的病毒的1000μl。
-
在所需的 h 后感染 (hpi) (在这个实验在 10-12 hpi), 转染 mRNA (500 纳的总 mRNA 每井24孔板) 使用阳离子脂质转染试剂, 如图3C 所示。
- 对于24孔板的井, 将含有萤火虫荧光素酶 (12A-Fluc) 的12a 序列 mRNA 的 480 ng 和带有Renilla荧光素酶 (Kozak-Rluc) mrna 的20纳克混合在一个微离心管中。在另一个微离心管中加入1.1μl 的阳离子脂质转染试剂。
- 在两管中加入55μl 的减少血清培养基。在室温下混合孵育5分钟。
- 孵育5分钟后, 在含有 mRNA 的试管中加入含有降血血清的55μl 阳离子脂质转染试剂。
- 轻轻但彻底地混合, 在室温下孵育15分钟。
- 在培养过程中, 去除细胞培养基, 每道24孔板加入400Μl 的减少血清培养基。
- 孵育后, 将混合物的100Μl 滴下均匀地加入到24孔板的井中。
4. 测量荧光素酶活性
- 在12A-Fluc 和 Kozak-Rluc mRNA 的共同转染后五个小时, 使用能够进行两个报告检测的荧光素酶检测系统来测量荧光素酶活性 (例如, 双荧光素酶报告检测试剂盒)。
- 通过添加150μl1x 裂解缓冲液 (荧光素酶检测试剂盒的组成部分) 去除减少的血清培养基并裂解细胞。
- 在室温下孵育10分钟后, 通过清除细胞并转移到微离心管中收集裂解物。
- 在4°c 条件下, 以 12, 000 x 克离心裂解液 10分钟, 以颗粒细胞碎片。
- 在带固体底部的96孔白液测定板中加入30μl 上清液。
- 使用荧光素酶检测试剂盒和多模板式读取器流量计测量双发光。
- 使用动力学功能 (在每口井的基础上) 使用表5中描述的设置进行测量。
请注意:读数也可以使用手动计时器进行。在杯中为 Fluc 添加等量的裂解液和基板。等待 2秒, 使用计量器测量10秒。在 Fluc 测量之后, 快速从计量仪中取出立方, 并手动添加相同体积的基板。再次, 等待 2秒, 并使用测光仪测量10秒。 - 将发光读数数据导出为理想的文件格式。
- 通过内部控制 Rluc 值划分 Fluc 值, 确定未感染和 VACV 感染的平拉细胞中 12A-Fluc mRNA 的相对转化率。
请注意:补充图 1显示了对原始数据的分步分析, 以获得相对的 fluc 活动。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
体外转录 rna 基荧光素酶报告法的四个步骤: PCR 生成 DNA 模板体外转录, 体外转录生成 mRNA, mRNA 转染, 和荧光素酶测量, 可以在示意图中看到 (图 1)。图中说明了 DNA 模板 (Fluc 和 Rluc) 引物的设计和悬垂扩展 PCR 的一般方案 (图 2a)。PCR 后, TAE 琼脂糖凝胶电泳检测出正确大小的 PCR 产物 (图 2B)。随后, PCR 产物被用作体外合成 RNA 的模板 (图 3 a), 在 tbe 凝胶电泳中纯化并运行, 以验证其大小 (图 3A)。纯化和验证的 mRNA 使用阳离子脂质转染试剂转染细胞 (图 3C)。表 6列出了此协议中使用的引物。
开发了体外转录 rna 型荧光素酶报告法, 以了解 5 '-聚 (A) 引线在天花病毒感染过程中 mRNA 翻译中的作用。利用这种检测方法, 我们测试了在未感染和感染 vacv 的细胞中含有 5 '-聚 (a) 引线 (12 nt) 的 fluc mRNA 的翻译效率。在未感染和 vacv 感染的细胞中, 使用 Rluc 值对 Fluc 值进行了归一化, 以确定相对的 Fluc 活性 (即 Fluc Activity-rluk 活性) (图 4 a)。由 Rluc 对 Fluc 进行划分, 使特定井的转染效率和 RNA 稳定性正常化。使用这种分析方法, 我们确定含有 mRNA 的 5 ' poly (A) 引线在 VAC 感染期间具有平移优势 (图 4B)。受感染细胞的优势并不是由于不同的转染效率或 mRNA 稳定性, 因为未感染的细胞和 VACV 感染细胞的 RNA 水平相似, 在 mRNA 转染19后5小时。
图 1: 实验过程示意图.PCR 用于生成具有所需元素的 DNA 模板。mRNA 编码荧光素酶报告基因是在体外合成的 T7 RNA 聚合物为基础的系统。一种萤火虫荧光素酶 (Fluc) mRNA 与雷尼利亚荧光素酶 (Rluc) mRNA 共同转染到未经感染或感染 vac 的细胞中。利用具有双荧光素酶能力的计量仪测量荧光素酶活性。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 引物设计和基于 pcr 的 DNA 扩增.(A) 正向引物合成为包括8nt 随机序列、t7 启动子和所需的 5 '-utr 和荧光素酶记者基因的 5 ' 末端的一部分, 而反向引物包括生成聚 (a) 尾的 t 通道和 3 ' 端的荧光素酶报告基因。利用含有荧光素酶基因的质粒模板进行悬垂扩展 PCR, 生成 DNA 模板。(B) 采用1% 琼脂糖 tae 凝胶电泳检测 PCR 反应所需大小的 dna 带。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: mRNA 合成和转染.(A) 体外转录原理图。以 PCR 扩增的 luciferase 基因扩增为模板, 该基因由感兴趣的 5 '-utr 下游和 T7 启动子中提取。T7 RNA 聚合酶被吸收到启动子中, 并添加核糖核酸酶, 以白色显示, 方向从 5 ' 到 3 '。一旦 mRNA 是25-30 长, 米7g 帽添加使用反反向帽模拟, arca。(B) 利用1.5% 琼脂糖 tbe 凝胶电泳检测到体外转录产物的 rna 波段。(C) 示意图, 证明报告 mrna 转染细胞。在不同的管内含有报告 mRNA 或阳离子脂质转染试剂的培养基, 在室温下平衡5分钟。然后将溶液混合, 然后在室温下孵育 15分钟, 然后将 rna! 转染试剂混合物添加到培养板的细胞中。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 包含 5 ' poly (a) 引线的 mRNA 的平移效率提高.(A) 含有 5 '-Utr 和 Rluk mrna 中的聚 (a) 引线的 fluc mRNA 与 5 '-utr 中的 Kozak 共识序列被共同转染为细胞。(B) 在未感染和 vacv 感染的细胞中, 与 rluc mrna 一起转染了 5 '-聚 (a) 引线的 Fluc mRNA。5 hpi, 用测光仪测量了荧光素酶活性。Rluc 归一化的 Fluc 活性表现在未感染和 vacv 感染的细胞中。误差线表示至少三次重复的标准偏差 (SD)。学生的 t 检验被用来确定 p 值;P 值 < 0.001。请点击这里查看此图的较大版本.
| 元素 | 序列 |
| T7 启动子 | TAATACACACTAGG |
| 保利 (A) 领导 | 从3到 51 as |
| 科扎克序列 | GCCC |
| 保利 (A) 尾巴 | 。 |
表 1: 方法中使用的序列–表包含 T7 启动子、聚 (A) 引线、Kozak 序列、多边形 (A) 尾的序列。
| 组件 | 体积 |
| 无 DNase 水: | 38μl |
| 2X 高保真 DNA 聚合酶母版混合: | 50μl |
| 前向底漆 (10μm): | 4μl |
| 反向底漆 (10Μm): | 4μl |
| 荧光素酶 DNA 模板 (1-10 ng/μL): | 4μl |
| 总： | 100μl |
| Fluc DNA 模板的来源是 Pgl3-fluc 质粒 | |
| Rluc DNA 模板的来源是 Rrl-rluc 质粒 |
表 2: PCR 反应- -------------------------- ----------------------------
| 步 | 温度 | 时间 | 周期 |
| 初始变性 | 95°c | 2分钟 | (1x 周期) |
| 变性 | 95°c: | 15秒 | |
| 退火 | X°C: | 30秒 | (25x 周期) |
| 扩展 | 72°c: | T 分钟 | |
| 最后延期 | 72°c: | 7分钟 | (1x 周期) |
| 按住 | 4°c: | ∞ |
表 3: PCR 程序– PCR 程序的步骤以及温度、时间和周期。
| 组件 | 体积 | |
| 无 DNase-RNase 水: | 高达20μl | |
| NTP 缓冲区混合 (每个 rNTP 20 mm): | 2μl | |
| 盖帽模拟 (40 mM): | 4μl | |
| 模板 PCR 产品 (400 纳克) *: | X μl | (依赖 PCR 产品浓度) |
| T7-rna 聚合酶组合: | 2μl | |
| 总： | 20μl | |
| * T7_12A-fluc 和 T7_Kozak-rluc 模板分别用于合成12A-Fluc 和 Kozak-Rluc mRNA。 |
表 4: 体外转录反应--体外转录反应中添加的成分的顺序和体积。
| 步骤 | Volume· time |
| 注入荧光素酶检测基板 (Fluc): | 30μl |
| 等待/孵化时间: | 2秒 |
| 发光测量 (Fluc): | 10秒 |
| 停止 & Glo 基板 (Rluc): | 30μl |
| 等待/孵化时间: | 2秒 |
| 发光测量 (Rluc): | 10秒 |
表 5: 荧光素酶测量设置 –使用建议的体积或时间测量荧光素酶的步骤.
| 引 | 序列 |
| T7-12A-弗鲁克前进 | Atcagagatatacacacacataggggaaaaaaaaaa aa ATGAGACCACAACACATAAG |
| T7-12A-fluc 反转 | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGGATTTTCCC |
| T7-kozak-rluc 前进 | Atcagagatatacacacacatacagggatgggccacc ATACTICGAAGTTATTGATEC |
| T7-kozak-rluc 反转 | Tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt GAGACTCCCT |
表 6: 引物–此方法中使用的具有完整序列的引物。
补充图 1: 对原始数据的分析–分析原始数据以获得规范化数据的步骤.请点击此处下载此文件.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
所有四核步骤都是体外转录 rna 基荧光素酶报告法成功的关键。应特别注意引物设计, 特别是 T7 启动子序列。T7 RNA 聚合酶开始转录从在 5 '-utr 序列之前添加的 T7 启动子中的下划线第一 g (gGg-5 '-utr-aug-)。虽然转录起始位点 (TSS) 从 5 ' 端的第一个 G 开始, 但在 T7 启动子区域中, 减少 G 的小于3的数量会减少体外转录的 RNA 产量/输出。在实验中, 我们观察到凝胶纯化 DNA 产物不是最佳的体外转录, 因为 RNA 的产量和质量都较低。我们只运行了5-10 的 PCR 反应在1% 琼脂糖凝胶电泳, 以确定大小和纯化其余 90-95, 使用 PCR 纯化试剂盒, 用于体外转录。在 PCR 的非特异性扩增的情况下, 建议从凝胶中切割所需大小的带, 并使用凝胶纯化的 DNA 片段。由于收率可能较低, 我们建议增加体外转录反应的反应量。与其他基于转化的方法类似, dna/rna 可能会刺激 dna rna 传感途径, 这些途径可能会在全球范围内或选择性地抑制转化。因此, 对数据的解释应谨慎, 尽管我们在实验中没有遇到这个问题可能造成的问题。
该方法适用于不同的模型系统, 但有 mRNA 传递方法、内部控制、翻译合适的时间、样品制备和数据分析等方面的修改。该方法的主要局限性在于, 用不完全反映生理条件的cis元素快速检测翻译规律是一种报告式的分析。因此, 如果可能, 这种方法应得到其他补充实验的证实。
与 DNA 修饰相比, RNA 修饰的作用不太被人们所理解。然而, 随着能够书写、读取和擦除 rna 修饰 30、31、32、33、34、35 的酶的发现, 现在可以研究其影响基因表达中的 rna修饰 30、31、32、33、34、35。体外转录 rna 基荧光素酶报告法可以进行改进, 以纳入不同的 RNA 修饰, 并用于测试其对 RNA 翻译的影响。例如, 此方法可以合并具有各种修改 30、31的不同盖帽类似物.此外, 在体外转录过程中或之后补充内部 RNA 修饰酶可能会纳入内部 RNA 修饰。增加对盖帽0、盖帽1和内部 RNA 修饰的改进将为研究这些 RNA 修饰在翻译中的作用提供一个工具。
体外转录 rna 基荧光素酶报告法在了解 RNA 翻译的基本生物学方面具有广阔的应用前景和广泛的应用前景。可以使用这种方法研究不同的翻译启动机制, 包括依赖上限的启动、与盖帽无关的启动、重新启动和内部启动, 如 RES。在这些优点的基础上, 该方法可用于测试 mRNA 中 5 '-utr 和 3 '-utr 中的cis元素的翻译调控。所述协议使用 PCR 产品, 该产品具有避免长时间克隆和快速检查 RNA 元素对翻译的影响的优势。为了最大限度地减少 PCR 过程中的潜在误差, 应使用高保真聚合酶和低 PCR 循环数。或者, 如果经常使用模板, 所需的 5-UTR 和荧光素酶 ORF 可以克隆到质粒中, 作为体外转录模板。该协议结合在一个单一的反应中整合转录和 mRNA 封盖, 并利用常规转染和分析, 使转录 rna 基荧光素酶报告法的用户友好, 快速, 直接的方法研究 mRNA 翻译的机制。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
提交人希望声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
该项目由国家卫生研究院 (AI128406 www.nih.gov) 资助至 ZY, 部分由约翰逊癌症研究中心 (http://cancer.k-state.edu) 资助, 形式是研究生暑期津贴至 PD。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H.
- Crick, F.
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , Springer US. (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , Academic Press. (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , Humana Press. New York. 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
