Summary
Ahora se reconoce que el entorno tridimensional de las células puede desempeñar un papel importante en su comportamiento, maduración y/o diferenciación. Este protocolo describe un modelo de cultivo celular tridimensional diseñado para estudiar el impacto de la contención física y las restricciones mecánicas en los megacariocitos.
Abstract
El entorno 3D que conduce tanto al confinamiento como a las restricciones mecánicas se reconoce cada vez más como un determinante importante del comportamiento celular. Por lo tanto, el cultivo 3D se ha desarrollado para abordar mejor la situación in vivo. Los megacariocitos se diferencian de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en la médula ósea (BM). El BM es uno de los tejidos más blandos del cuerpo, confinado dentro del hueso. Al ser el hueso poco extensible a escala celular, los megacariocitos están sometidos concomitantemente a una rigidez débil y un alto confinamiento. Este protocolo presenta un método para la recuperación de HSPCs de linaje de ratón negativo (Lin-) mediante clasificación inmunomagnético y su diferenciación en megacariocitos maduros en un medio 3D compuesto de metilcelulosa. La metilcelulosa no es reactiva a los megacariocitos y su rigidez puede ajustarse a la de la médula ósea normal o aumentarse para imitar una médula fibrótica patológica. El proceso para recuperar los megacariocitos para análisis celulares adicionales también se detalla en el protocolo. Aunque la extensión del proplatelet se impide dentro del entorno 3D, se describe a continuación cómo resuspendir los megacariocitos en medio líquido y cuantificar su capacidad para extender los proplatlets. Los megacariocitos cultivados en hidrogel 3D tienen una mayor capacidad para formar proplatlets en comparación con los cultivados en un entorno líquido. Este cultivo 3D permite i) diferenciar progenitores hacia megacariocitos que alcanzan un mayor estado de maduración, ii) recapitular fenotipos que pueden observarse in vivo pero que pasan desapercibidos en cultivos líquidos clásicos, y iii) estudiar vías de transducción inducidas por las señales mecánicas proporcionadas por un entorno 3D.
Introduction
Las células en el cuerpo experimentan un microambiente 3D complejo y están sujetas a la interacción entre las señales químicas y mecanofísicas, incluida la rigidez del tejido y el confinamiento debido a las células vecinas y la matriz circundante 1,2,3. La importancia de la rigidez y el confinamiento para el comportamiento celular solo se ha reconocido en las últimas décadas. En 2006, el trabajo seminal de Engler et al. 4 destacó la importancia del entorno mecánico para la diferenciación celular. Los autores demostraron que la variación en la rigidez del sustrato celular resultó en la orientación de las células madre hacia varios linajes de diferenciación. Desde entonces, el impacto de las señales mecánicas en el destino y el comportamiento celular se ha vuelto cada vez más reconocido yestudiado. A pesar de ser uno de los tejidos más blandos del organismo, la médula ósea tiene una organización estructural 3D que está confinada dentro del hueso. La rigidez de la médula, aunque técnicamente difícil de medir con precisión, se estima que se encuentra entre 15 y 300 Pa 5,6. Dentro del estroma, las células están estrechamente confinadas entre sí. Además, la mayoría de ellos están migrando hacia los vasos sinusoides para entrar en la circulación sanguínea. Estas condiciones crean restricciones mecánicas adicionales en las células adyacentes, que tienen que adaptarse a estas fuerzas. Las señales mecánicas representan un parámetro importante cuyas consecuencias sobre la diferenciación de megacariocitos y la formación de proplatlets se han explorado recientemente. Aunque los megacariocitos pueden diferenciarse in vitro en el cultivo líquido tradicional, no alcanzan el grado de maduración observado in vivo,en parte debido a la ausencia de las señales mecánicas del entorno 3D 7. El crecimiento de progenitores incrustados en hidrogel trae señales mecánicas 3D que carecen del entorno líquido.
Los hidrogeles se han utilizado ampliamente durante varias décadas en el campo hematológico, especialmente para cultivar células en ensayos de formación de colonias para cuantificar los progenitores hematopoyéticos. Sin embargo, tales hidrogeles rara vez se han utilizado para explorar el impacto biológico del entorno mecánico 3D en la maduración y diferenciación de las células hematopoyéticas. En los últimos años nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo de cultivo 3D utilizando un hidrogel a base de metilcelulosa 8. Este gel físico no reactivo es una herramienta útil para imitar las limitaciones físicas del entorno nativo de megacariocitos. Se deriva de la celulosa mediante la sustitución de residuos de hidroxilo (-OH) por grupos metóxido (-OCH3). Tanto el grado de sustitución de metilo como la concentración de metilcelulosa determinan la rigidez del hidrogel una vez que se ha gelatinado. Durante la etapa de desarrollo de esta técnica, se demostró que un módulo de Young en el rango de 30 a 60 Pa es la rigidez óptima del gel para el crecimiento de megacariocitos 9.
El siguiente protocolo describe un método para cultivar progenitores megacariocíticos de ratón en un hidrogel de metilcelulosa 3D. Se ha demostrado previamente que en comparación con el cultivo líquido estándar, este cultivo de hidrogel aumenta el grado de poliploidización de megacariocitos, mejora la maduración y la organización intracelular, y aumenta la capacidad de los megacariocitos para extender los proplatitos una vez resuspendidos en un medio líquido 9. Este manuscrito describe en detalle el protocolo para el aislamiento de células Lin− de médula ósea de ratón y su incrustación en un hidrogel de metilcelulosa para cultivo 3D, así como la cuantificación de su capacidad para producir proplatelets y la recuperación de las células para análisis posteriores.
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Protocol
Todos los experimentos deben realizarse de conformidad con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los protocolos mostrados en el video se llevaron a cabo en estricta conformidad con la legislación europea y las recomendaciones de la Junta de Revisión del Etablissement Français du Sang (EFS). Una primera versión de este protocolo se publicó originalmente en 2018 en Methods in Molecular Biology 8.
NOTA: La Figura 1 presenta una vista esquemática de todo el proceso. Este proceso incluye 1) disección ósea, recuperación de médula y aislamiento mecánico de células de médula, 2) clasificación magnética de células de linaje negativo (Lin-), 3) siembra en hidrogel líquido o metilcelulosa, y 4) resuspensión de megacariocitos cultivados en gel 3D para el examen de la formación de proplalet en medio líquido.
1. Recolección de huesos de ratones adultos
NOTA: En esta sección, es importante minimizar la contaminación microbiana.
- Prepare un tubo de 15 ml para la recolección ósea con el Medio de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco que contenga el 1% del volumen total de la mezcla de antibióticos de penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG) (penicilina 10000 U/mL, estreptomicina 100000 μg/mL y L-glutamina 29,2 mg/ml).
NOTA: Si todos los ratones utilizados tienen el mismo genotipo, acerque todos los huesos en el mismo tubo que contiene 1 ml de DMEM - PSG 1% por número de ratones. Los antibióticos son importantes para prevenir la posible proliferación de bacterias durante el tiempo de muestreo óseo. - Llene un tubo de 50 ml con etanol al 70% para la desinfección ósea y otro para enjuagar los instrumentos durante el procedimiento. Use instrumentos de disección esterilizados.
- Anestesiar a los ratones mediante inhalación de isoflurano (4%) y proceder rápidamente a la luxación cervical para sacrificar a los ratones. Sumerja rápidamente el cuerpo en etanol al 70% para desinfectar y evitar la contaminación microbiana.
- Diseccionar rápidamente las tibias y los fémures.
- Con un bisturí, corte las epífisis del extremo del lado del tobillo para la tibia y del extremo del lado de la cadera para el fémur.
- Sumergir los huesos durante un segundo en etanol al 70% antes de sumergirlos en medio DMEM que contiene 1% de PSG.
2. Disociación de la médula y aislamiento de las células lin
NOTA: Esta parte del protocolo se realiza bajo una campana de flujo laminar. Para un cultivo, todos los pozos son parte del mismo experimento y no pueden considerarse como réplicas biológicas independientes. Las células de todos los ratones se agrupan para garantizar la homogeneidad de todos los pozos y poder compararlos entre sí al tiempo que se elimina la posible variabilidad inter-individual. Para réplicas biológicas independientes, el cultivo debe repetirse.
- Coloque los huesos en una placa de Petri y levántelos dos veces en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) estéril de Dulbecco para eliminar posibles contaminantes.
- Prepare DMEM - 1% PSG en un tubo de 50 ml.
NOTA: Proporcione 2 ml de DMEM - 1% de PSG por los ratones utilizados para el experimento. - Llene una jeringa de 5 ml equipada con una aguja de calibre 21 con DMEM - 1% PSG.
- Sosteniendo el hueso con fórceps, introduzca solo el bisel de la aguja en el extremo lateral de la rodilla.
NOTA: La epífisis del lado de la rodilla debe permanecer intacta desde la disección, dejando una pequeña cavidad en su centro a través de la cual insertar la aguja. La epífisis restante mantendrá el hueso unido a la aguja durante el enrojecimiento. Tenga cuidado de no introducir más que el bisel en el hueso, ya que podría aplastar y dañar la médula. - Presione rápidamente el émbolo de la jeringa para enjuagar la médula en un tubo de 50 ml.
NOTA: Para evitar salpicaduras y facilitar el lavado y liberación de la médula coloque el extremo libre del hueso en la pared del tubo, sumergido en DMEM - 1% PSG. En la práctica, un volumen entre 500 μL y 1 ml es generalmente suficiente para expulsar la médula del hueso. Cuando la médula ha sido totalmente expulsada, el hueso se ha vuelto blanco. En caso de que la médula no haya sido totalmente expulsada de la diáfisis a juzgar por algún color rojo restante, es posible repetir el enrojecimiento con medio fresco. - Repita los pasos 2.4. y 2.5. para todos los huesos, rellenando la jeringa de 5 ml con DMEM - 1% PSG si es necesario.
- Use la misma jeringa de 5 ml con la aguja de calibre 21 para transferir el volumen total del medio que contiene médula enjuagada a tubos de fondo redondo de 10 ml.
NOTA: No es absolutamente necesario cambiar a un tubo de fondo redondo de 10 ml, pero facilita el paso a los siguientes pasos de disociación. No dude en cambiar la jeringa y/o la aguja si se sospecha riesgo de contaminación. - Proceda a la disociación celular aspirando y expulsando las células del medio y de la médula sucesivamente dos veces a través de una aguja de calibre 21, tres veces a través de una aguja de calibre 23 y una vez a través de una aguja de calibre 25.
NOTA: Evite las burbujas de aire, ya que puede ser perjudicial para las células. - Transfiera la suspensión a tubos de 15 ml.
- Mida el número de celdas y verifique la viabilidad utilizando un contador de celdas automatizado o una cámara celular para el conteo manual en presencia de azul de tripano para excluir las células muertas.
- Centrifugar los tubos de 15 mL durante 7 min a 300 x g. Usando una pipeta de transferencia de 1 ml, pipetee cuidadosamente y deseche el sobrenadante.
- Aislar células madre y progenitoras mediante clasificación inmunomagnética negativa utilizando un kit de aislamiento de células hematopoyéticas de ratón.
NOTA: El objetivo de esta clasificación celular es recuperar las células que son negativas para todos los anticuerpos de selección (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) y por lo tanto eliminar las células que ya están involucradas en un linaje de diferenciación distinto al megacariocítico. - Siguiendo las instrucciones del kit, vuelva a enviar el pellet celular en medio M recién preparado (PBS con el 2% del volumen final de suero fetal bovino (FBS), EDTA 1 mM) a una concentración de 1 × 108 células/ml y distribuya la suspensión en tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml a un volumen máximo de 2 ml.
- Añadir a los tubos de poliestireno: suero normal de rata a una concentración de 50 μL/mL así como la mezcla de anticuerpos biotinilados (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) a una concentración de 50 μL de mezcla por ml y homogeneizar moviendo suavemente los tubos.
NOTA: Estos anticuerpos se unirán a las células que ya están comprometidas en una vía de diferenciación, excepto la vía megacariocítica. - Incubar los tubos en hielo durante 15 min.
- Agregue perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina a una concentración de 75 μL / ml y homogeneice moviendo suavemente los tubos.
- Incubar de nuevo en hielo durante 10 min.
- Si es necesario, ajuste a un volumen final de 2,5 ml por tubo con medio M.
- Homogeneiza la suspensión moviendo suavemente el tubo justo antes de colocarlos, sin sus tapas, dentro de un imán y espera tres minutos.
NOTA: Las células ya comprometidas en una vía de diferenciación y recubiertas con perlas magnéticas se retendrán en la pared del tubo dentro del imán. - Invierta el imán y el tubo para transferir el contenido del tubo a un nuevo tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml.
NOTA: No saque el tubo del imán para la transferencia; se hace invirtiendo el imán con el tubo todavía dentro. Use un movimiento constante y no agite el tubo. - Deseche el tubo inicial que contiene células magnéticas no deseadas y coloque el nuevo, sin su tapa, en el imán durante tres minutos más.
- Procediendo como en el paso 2.20, transfiera las células Lin− aisladas a un nuevo tubo de 15 ml.
NOTA: Si se han utilizado varios tubos de poliestireno de 5 ml para los pasos anteriores, acoja todas las celdas en el mismo tubo de 15 ml. Las células recuperadas después de la clasificación celular son células madre hematopoyéticas y progenitoras. La presencia de trombopoyetina (TPO), el principal regulador fisiológico de la megacariopoyesis 10,dirigirá la diferenciación celular hacia la línea celular megacariocítica. - Mida el número de celdas Lin− y la viabilidad como en el paso 2.10.
- Calcule el volumen requerido de suspensión celular a centrifugar para tener 1 x 10 6 células viables x Número de pozo,siendo el número de pozos a sembrar por condición.
- Preparar un tubo por condición con el volumen apropiado de suspensión celular y centrífuga a 300 x g durante 7 min.
- Para cultivos líquidos, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en medio de cultivo completo (DMEM, PSG 1% del volumen final, FBS 10% del volumen final, hirudina 100 U/mL, TPO 50 ng/mL) para alcanzar la concentración final de 2 × 106 células viables/mL (igual a 1 × 106 células por 500 μL de pozo). Incubar las células a 37 °C bajo un 5% de CO2. (= día 0 de cultivo)
NOTA: Véase el siguiente párrafo para cultivos de metilcelulosa Como ejemplo, para preparar un medio de cultivo completo para un pozo, use 435 μL de DMEM, 50 μL de 100% FBS para 10% final, 5 μL de 100% PSG para 1% final, 5 μL de 10 000 U/mL para 100 U/mL final y 5 μL de 5 μg/mL de TPO para 50 ng/mL final. Las placas de cultivo de 4 o 24 pozos se utilizan típicamente, ya que su diámetro de pozo es una buena opción para los 500 μL necesarios por pozo.
3. Incrustación celular en hidrogel de metilcelulosa
NOTA: Tenga en cuenta que el siguiente protocolo describe el método para obtener un solo pozo de cultivo celular de hidrogel, adaptado al número de pozos necesarios.
- Descongelar 1 ml de alícuotas de solución de stock de metilcelulosa al 3% a temperatura ambiente. Prepare una alícuota adicional separada de metilcelulosa para el recubrimiento de la jeringa.
NOTA: A una concentración del 3%, la metilcelulosa permanece líquida a temperatura ambiente (20-25 °C). - Cubra una jeringa de bloqueo Luer de 1 ml equipada con una aguja de calibre 18 con metilcelulosa extrayendo 1 ml de metilcelulosa de la alícuota adicional. Expulsar totalmente la metilcelulosa.
NOTA: Este paso de recubrimiento garantiza que el volumen de metilcelulosa recogido en el paso 3.3 sea exacto. - Con la misma jeringa y aguja, pero utilizando una nueva alícuota de metilcelulosa, extraiga el volumen apropiado de metilcelulosa (Figura 2A).
NOTA: Para lograr una concentración final de metilcelulosa al 2% en un volumen final de 500 μL por pozo, se requieren 333 μL de metilcelulosa al 3%. - Retire con precaución la aguja. Usando fórceps esterilizados, atornille un conector de bloqueo Luer en el extremo de la jeringa (Figura 2B-C).
- Conecte una segunda jeringa de bloqueo Luer de 1 ml sin recubrimiento al conector de bloqueo Luer para conectar las dos jeringas (Figura 2D).
NOTA: No es necesario recubrir esta segunda jeringa. - Distribuya por igual el volumen de metilcelulosa entre las dos jeringas(Figura 2E)y déchelas a un lado hasta el paso 3.11.
- Preparar el medio de cultivo DMEM concentrado para obtener en el volumen final de metilcelulosa (paso 3.11) una concentración idéntica a la del medio de cultivo líquido para cada compuesto (PSG 1% del volumen final, FBS 10% del volumen final, hirudina 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
- Preparar 167 μL de medio de cultivo concentrado por pozo final de 1 × 106 células. Este volumen de medio se calcula para obtener una concentración final de metilcelulosa del 2%. El volumen total en el pozo será de 500 μL (167 μL de suspensión celular en medio de cultivo concentrado + 333 μL de metilcelulosa) y todos los componentes tendrán una concentración idéntica a la de los pozos líquidos.
- Como ejemplo, para preparar un medio de cultivo completo para un pozo, use 102 μL de DMEM, 50 μL de 100% FBS para 10% final, 5 μL de 100% PSG para 1% final, 5 μL de 10 000 U/mL para 100 U/mL final y 5 μL de 5 μg/mL TPO para 50 ng/mL final. Da un volumen de 167 μL utilizado para resuspend las células y con la adición de 333 μL de metilcelulosa el volumen final será de 500 μL.
- Después de completar la etapa de centrifugación 2.26, deseche el sobrenadante y resuspante el pellet celular en el medio de cultivo concentrado en una proporción de 1 × 106 células por 167 μL.
- Retire las jeringas y desconecte una de ellas del conector.
- Pipeta 167 μL de la suspensión celular.
- Agregue la suspensión de la celda directamente en el conector de la jeringa (Figura 2F), asegurándose de no introducir burbujas de aire.
NOTA: Al agregar la suspensión celular, extraiga lentamente el émbolo de la jeringa simultáneamente para liberar algo de espacio para la suspensión celular. - Vuelva a conectar cuidadosamente las dos jeringas(Figura 2G)sin perder ninguna suspensión en la rosca del tornillo.
NOTA: Antes de la reconexión, extraiga el émbolo para dejar el conector medio vacío y deje suficiente espacio para que la segunda jeringa se conecte sin que la suspensión se desborde. - Homogeneizar lentamente el medio de metilcelulosa con la suspensión celular con diez movimientos de émbolo hacia adelante y hacia atrás entre las dos jeringas (Figura 2H).
- Extraiga el volumen total en una jeringa y desconecte las dos jeringas, dejando el conector en la vacía.
- Vacíe el contenido de la jeringa en un pozo de una placa de 4 pozos(Figura 2I).
- Incubar las células a 37 °C bajo 5% de CO2 (= día 0 de cultivo).
NOTA: Es posible preparar dos pozos de metilcelulosa con un par de jeringas. Aumentar en dos el volumen de metilcelulosa y el volumen de suspensión celular para tener 2 x106 células. Después de completar el paso 3.13. distribuir el volumen por igual entre las dos jeringas para tener 500 μL en cada una de ellas. Desconéctalos y vacía el que no tiene el conector en un pozo cultural. Vuelva a conectar las jeringas para transferir el volumen de la que mantenía el conector a la otra. Desconecte las jeringas, la que tiene los 500 μL no debe tener el conector conectado, y sepese bien las células en un segundo cultivo. La metilcelulosa al 3% se compra como una solución madre en el Medio Dulbecco Modificado (IMDM) de Iscove, mientras que las células concentradas se suspenden en DMEM. Inicialmente se han realizado pruebas comparativas para asegurarse de que este medio mixto no tuvo ningún impacto en el resultado del experimento, especialmente en comparación con el cultivo líquido en 100% DMEM.
4. Resuspensión celular para el análisis de proplatelets
NOTA: El análisis de la capacidad para formar proplatlets debe realizarse en condiciones comparables entre los megacariocitos líquidos y los cultivados con metilcelulosa. Las limitaciones físicas ejercidas por el hidrogel de metilcelulosa inhiben la extensión proplatelet. Por lo tanto, las células cultivadas con metilcelulosa se resuspenden en medio líquido fresco el día 3 de cultivo para permitirles extender los proplatlets. El hidrogel de metilcelulosa es un hidrogel físico que se diluye fácilmente tras la adición de medio líquido. Es importante destacar que, para evitar artefactos de resuspensión y centrifugación, las células en la condición de medio líquido de control deben tratarse simultáneamente de la misma manera que las células cultivadas con metilcelulosa. Consulte la representación esquemática del experimento (Figura 1).
- Preparar 10 mL de DMEM - 1% PSG precalentado a 37 °C en un tubo de 15 mL para cada pozo a resuspend.
- Resuspenda con precaución las células de cada pozo en los 10 ml de DMEM - 1% PSG.
NOTA: Haga suavemente varios movimientos hacia arriba y hacia abajo para diluir la metilcelulosa por completo. Para los pozos líquidos, asegúrese de recolectar todas las células depositadas en el fondo del pozo. - Centrifugar los tubos 5 min a 300 × g.
- Mientras tanto, prepare el medio de cultivo completo (DMEM, PSG 1% del volumen final, FBS 10% del volumen final, hirudina 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
NOTA: En este paso se recupera cada pozo para diluir a la mitad, por lo tanto, prepare 1 ml de medio de cultivo completo por pozo. - Deseche el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet celular en 1 ml de medio de cultivo para cada tubo.
- Resbasar 500 μL de suspensión celular por pozo en una placa de 4 o 24 pozos e incubar a 37 °C bajo 5% de CO2.
NOTA: A partir de un pozo inicial, obtenga 2 pozos para la visualización de proplatelets por duplicado. Tenga en cuenta que, como estos duplicados se originan en la misma muestra, no pueden considerarse réplicas independientes. - 24 horas después de la resedida, en el día 4 de cultivo, adquirir aleatoriamente 10 imágenes por pozo utilizando microscopía de campo brillante y el objetivo 20×.
NOTA: Las células tienden a agruparse en el centro del pozo, asegúrese de no tener demasiadas células en el campo, ya que puede dificultar la visualización y cuantificación de proplatelets. Asegúrese de capturar al menos 5 megacariocitos por campo. - Cuente el número total de megacariocitos y de megacariocitos que extienden proplatlets en cada imagen y calcule la proporción de megacariocitos que extienden proplalets.
NOTA: La cuantificación no está automatizada; realizar el conteo de celdas manualmente. El conteo se puede facilitar mediante el uso del complemento de contador de celdas de ImageJ para hacer clic en las celdas con el fin de marcarlas a medida que se cuentan. 10 campos adquiridos por pozo y pozos por duplicado representan aproximadamente 150-300 megacariocitos por condición.
5. Fijación y recuperación celular para futuros análisis
PRECAUCIÓN: Este protocolo utiliza fijadores que deben manipularse bajo una campana extractora, utilizando equipo de protección.
NOTA: El objetivo es mantener intactas las restricciones de gel aplicadas en las células hasta que estén completamente fijadas. Por lo tanto, e independientemente del fijador utilizado, debe agregarse en el pozo sobre la metilcelulosa, sin alterar el gel. El mismo protocolo se aplica a los cultivos líquidos.
- Agregue un volumen de solución fijadora igual al volumen sembrado (500 μL en este protocolo), sobre la metilcelulosa sin interrumpir el gel. Espere el tiempo adecuado de acuerdo con el fijador utilizado (al menos 10 min).
NOTA: La difusión del fijador en todo el gel debe ser muy rápida, como lo revela un cambio rápido en el color del gel (de rosa a un tono amarillo-naranja). El paraformaldehído (8% en DPBS, 500 μL por pozo) se usa generalmente para el inmunoetiquetado, mientras que el glutaraldhehído (5% en tampón de cacodilato, 500 μL por pozo) se usa para el análisis de microscopía electrónica. - Usando una pipeta P1000 suavemente haga varios pipeteos hacia arriba y hacia abajo con el fijador y el gel para diluir homogéneamente la metilcelulosa.
- Usando la misma pipeta y punta, transfiera todo el volumen del pozo a un tubo de 15 ml que contenga 10 ml de DPBS y homogeneice.
- Centrifugar la mezcla a 300 × g durante 7 min.
NOTA: Es posible que se necesite un segundo paso de lavado para eliminar toda la metilcelulosa - Desechar el sobrenadante y resuspend el pellet de megacariocitos en el medio adecuado según el análisis deseado (inmunoetiquetado, citometría de flujo9,microscopía electrónica...) (para la microscopía electrónica véase también el método en papel"Exploración in situ de los principales pasos de la megacaripoyesis utilizando microscopía electrónica de transmisión" en este número de JoVE).
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Representative Results
Los datos obtenidos utilizando este protocolo fueron publicados originalmente en Blood en 20169.
De acuerdo con el protocolo, las células se sembraron en medio de hidrogel líquido o metilcelulosa. Las células en medio líquido se han sedimentado en el fondo del pozo, en contacto con la superficie plástica rígida y, en algún momento, con otras células. Por el contrario, las células incrustadas en el hidrogel de metilcelulosa se distribuyen homogéneamente en el gel y se aíslan de las células vecinas(Figura 3A). El gel de metilcelulosa a una concentración final del 2% aumenta muy ligeramente el diámetro medio de los megacariocitos en comparación con el cultivo líquido(Figura 3B),de acuerdo con la mayor ploidía reportada9. Por el contrario, el aumento de la concentración de metilcelulosa en un 0,5% perjudica la diferenciación de megacariocitos, como lo demuestra un diámetro medio más pequeño(Figura 3B).
Se observa una diferencia notable en la ultraestructura de los megacariocitos entre los megacariocitos diferenciados en cultivo líquido y los diferenciados in vivo dentro de la médula ósea. Un rasgo característico de los megacariocitos maduros es una compleja red de membrana intracitoplasmática, el DMS (Sistema de Membrana de Demarcación) que sirve como reservorio para la membrana de las futuras plaquetas. En los megacariocitos maduros, el DMS se organiza para formar láminas de membrana entrelazadas que ocupan la mayor parte del citoplasma. Por microscopía electrónica de transmisión (TEM), parecen estar estrechamente aposidos y delinean territorios citoplasmáticos (Panel superior de laFigura 3C) (para el procedimiento TEM, consulte el método de papel"Exploración in situ de los principales pasos de la megacariopoyesis utilizando microscopía electrónica de transmisión" en este mismo número de JOVE). En cultivo líquido, las membranas DMS tienen principalmente la apariencia de pequeñas vesículas redondas, ovaladas o alargadas sin delimitación de territorios citoplasmáticos (Panel mediode la Figura 3C). Por el contrario, el cultivo de metilcelulosa al 2% promueve la organización del DMS en la mayoría de los megacariocitos, con membranas estrechamente apuestas y delimitando territorios citoplasmáticos, similares al in situ (Panel inferior de la Figura3C). Este resultado indica que el cultivo de hidrogel de metilcelulosa al 2% permite una mejor diferenciación de megacariocitos debido a las restricciones mecánicas del medio ambiental.
Después de la transferencia celular al medio líquido en el día 3, los megacariocitos comienzan a extender los proplatados después de 4 h 9. La Figura 4 muestra la cuantificación de la proporción de megacariocitos que tienen proplatados extendidos 24 h después de la resuspensión en medio líquido. Diez imágenes fueron adquiridas aleatoriamente por pozo, utilizando microscopía de campo brillante y el objetivo 20×(Figura 4A). La cuantificación se realizó a ciegas y manualmente utilizando el plugin de contador de celdas en Fiji (ImageJ)(Figura 4B). Debido a que se trata de cultivos celulares primarios, existe una variabilidad entre experimentos, pero el protocolo sigue siendo robusto y ofrece una buena reproducibilidad. En la condición de precultor líquido, la proporción de proplatelet debe estar entre el 10% y el 20%, mientras que esta proporción se duplica para el precultor de hidrogel.
Figura 1. Representación esquemática de todo el proceso. Los huesos se diseccionan, la médula se enjuaga y las células se disocian mecánicamente. Las células madre y progenitoras de interés (lin-células) se aíslan mediante un procedimiento de clasificación inmunomagnética negativa y se siembran en medio líquido o hidrogel (día 0). En el día 3 de cultivo (que en total representa una duración de 4 días), ambas condiciones se resuspenden en un entorno de cultivo líquido fresco separado. Este segundo paso de cultivo se lleva a cabo desde el día 3 hasta el día 4 de cultivo. La proporción de diputados que extienden proplatelets se mide en el día 4 del cultivo. Para mayor claridad visual, se esquematiza una celda por pozo. El círculo azul representa una sola célula con su núcleo en púrpura. En el paso final, ambos diputados se representan con proplatelet. La proporción de MKs que forman proplatlets varía según el precultivo de líquido o metilcelulosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Incrustación celular en hidrogel de metilcelulosa. Después de pre-recubrimiento de la pared de las jeringas, (A) extraiga el volumen apropiado de metilcelulosa; (B, C) desconecte la aguja y atornille un conector a la jeringa; (D) empuje la metilcelulosa hasta la mitad del conector y conecte una segunda jeringa; (E) distribuir equitativamente la metilcelulosa entre las dos jeringas y desconectarlas; (F) añadir la suspensión de la celda a la jeringa que lleva el conector; (G) volver a conectar las dos jeringas; (H) homogeneizar empujando todo el volumen de una jeringa a la otra varias veces; (I) sembrar las células expulsando todo el volumen en una placa de cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Características de los megacariocitos según la condición del cultivo. (A) Imágenes representativas de megacariocitos en el día 3 de cultivo en líquido (panel izquierdo) o medio hidrogel de metilcelulosa al 2% (panel derecho). Barra de escala = 50 μm (B) Diámetro medio de los megacariocitos cultivados en medio líquido, o en hidrogel de metilcelulosa al 2% o 2,5%. Los resultados se expresan como la media ± SD en 3 cultivos independientes, con un total de al menos 100 megacariocitos examinados. *, P<0.05, ***P < 0.0001, utilizando el análisis de varianza de 1 vía (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. (gráfico adaptado de Aguilar et al. 2016) (C) Vista esquemática (izquierda) e imágenes representativas de microscopía electrónica (centro) de megacariocitos murinos; paneles derechos, vistas de cerca desde los cuadrados blancos (barra de escala = 5 μm para las imágenes de microscopía electrónica media y 2 μm para las vistas de cerca). Los paneles superiores son megacariocitos in situ, el medio representa los megacariocitos cultivados in vitro en cultivo líquido y los paneles inferiores son megacariocitos cultivados en hidrogel de metilcelulosa 3D. Estos datos fueron publicados originalmente en Blood Journal, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_95. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Resultados representativos de la cuantificación de proplatelets. (A) imágenes representativas de megacariocitos en el día 4 de cultivo. Las células se incubaron tres días en líquido(izquierda)o medio de hidrogel de metilcelulosa al 2%(derecha)seguido de un día de resuspensión en medio líquido. Las flechas negras indican megacariocitos que extienden los proplalets. (Barra de escala = 50 μm). (B) Datos representativos de cuantificación de la formación de proplatlets. Formación de proplatlet cuantificada en el día 4 para megacariocitos previamente precultorizados desde el día 0 hasta el día 3 en medio de hidrogel líquido o metilcelulosa al 2%. Los resultados se expresan como el % de megacariocitos que extienden proplatlets (media ± SD) y son de 3 experimentos independientes, con un número total de megacariocitos examinados por condición >750 (prueba t, p = 0,0023). La proporción media de megacariocitos que extienden proplatlets es del 16% en estado líquido y del 39% para el precultor de hidrogel de metilcelulosa. Este resultado corresponde al efecto previamente demostrado y publicado del precultor de hidrogel que aumenta la formación de proplatelet en comparación con la condición líquida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En la década anterior, la mecanobiología ha despertado cada vez más interés en muchas áreas de la biología. Ahora se reconoce comúnmente que el entorno mecánico que rodea a las células juega un papel en su comportamiento, enfatizando la importancia de estudiar cómo los megacariocitos detectan y responden a las señales mecánicas extracelulares. Es difícil medir con precisión la rigidez del tejido de la médula ósea in situ11,especialmente si consideramos la médula roja hematopoyética, ya que se encuentra dentro de los huesos trabeculares en grandes mamíferos, mientras que la médula más fácilmente accesible de la diáfisis está compuesta esencialmente de adipocitos (médula amarilla)12. En el caso de una médula aislada de ratones, donde la diáfisis contiene esencialmente médula roja, otro problema es que, una vez extraída del hueso, el tejido no permanece cohesionado. Sin embargo, Shin y colaboradores lograron medir la rigidez de la médula de la diáfisis del ratón mediante microscopía de fuerza atómica y encontraron un valor demédula E = 0,3 ± 0,1 kPa, lo que sitúa a la médula entre los tejidos más blandos6.
El interés del procedimiento descrito aquí es comparar el comportamiento de los megacariocitos en medio líquido con el del hidrogel. En el medio líquido, todas las células se han sedimentado en el fondo del pozo, en contacto con la superficie plástica rígida y, en algún momento, con otras células. Por el contrario, las células incrustadas en el hidrogel de metilcelulosa se distribuyen homogéneamente en el gel y están completamente aisladas de las otras células(Figura 3A). Por lo tanto, se someten esencialmente a señales mecánicas proporcionadas por el confinamiento, excluyendo la comunicación de yuxtacrina. La estimulación paracrina no puede excluirse totalmente. Sin embargo, las células incrustadas en el hidrogel de metilcelulosa están distantes entre sí, contrariamente a la situación en la médula ósea y, por lo tanto, podemos suponer que si las sustancias secretadas llegan a las células vecinas, podrían estar muy diluidas.
El método es fácil de configurar y no requiere habilidades específicas. La metilcelulosa es un gel físico cuyas cadenas poliméricas forman enlaces cruzados no covalentes. Al ser líquido a baja temperatura, se gelifique al aumentar la temperatura (consulte el artículo de Aguilar et al. 20169 para obtener más información sobre la caracterización de las propiedades mecánicas del gel). Este estado de gel se puede revertir fácilmente después de la dilución en solución acuosa, lo que permite una fácil recuperación de las células, ya sea fijadas en gel o como células vivas.
Un factor crítico aquí es la rigidez del hidrogel. El volumen apropiado de metilcelulosa debe dispensarse con mucha precisión, ya que incluso un pequeño cambio en la concentración de hidrogel puede tener un impacto importante en la rigidez del medio y, por lo tanto, en la maduración de los megacariocitos. Por ejemplo, se demostró previamente que el aumento de la concentración de metilcelulosa del 2 al 2,5% aumentó la rigidez del gel (módulo de Young) en 10 veces. Una posible trampa es que no existe un control de calidad fácil para verificar las propiedades reológicas precisas de la metilcelulosa en cada pozo experimental una vez que se ha sembrado con células. Sin embargo, un criterio esencial que tranquilizará una concentración correcta de gel es la maduración adecuada de los megacariocitos dentro del hidrogel, como se refleja en su gran tamaño aproximadamente similar al del medio líquido. Una disminución en su diámetro medio podría reflejar una diferenciación defectuosa similar a la que ocurre al aumentar la rigidez con metilcelulosa al 2,5%(Figura 3B).
Otra limitación del método es que la recuperación celular del hidrogel lleva más tiempo que en el cultivo clásico, ya que es necesario diluir primero el gel antes de la centrifugación. Si la metilcelulosa necesita ser eliminada totalmente, por ejemplo, para obtener lisato celular para un procedimiento adicional de aislamiento de western blot o ARN, puede ser necesario un paso de lavado adicional, durante el cual pueden ocurrir modificaciones en las proteínas o el ARN (desfosforilación de proteínas, degradación de ARN ...).
Un punto crítico a considerar en el procedimiento es el recuento de células que tiene que ser igual en cada condición. Esto no es tan trivial ya que en el cultivo líquido, las células tienden a sedimentar en el fondo del pozo y algunas de ellas se adhieren a la superficie plástica, lo que no es el caso de las células en suspensión en hidrogel. Una trampa es una acumulación incompleta de las células en la condición líquida, lo que resulta en un contenido celular diferente entre la condición de "líquido" e "hidrogel" después de la suspensión en medio líquido en el día 3. Tal diferencia puede dar lugar a discrepancias en los datos finales. Como punto de control, se puede hacer una numeración de celdas en esta etapa antes de volver a seser las células. Es preferible hacerlo manualmente utilizando un hemocitómetro Nageotte ya que es especialmente apropiado para células más grandes como los megacariocitos.
Como para cualquier cultivo celular primario, existe un posible riesgo de contaminación. La contaminación es la explicación más probable a una proporción inusualmente baja de proplatlet en condiciones de precultor de metilcelulosa, ya que una pequeña contaminación parece más difícil de detectar que en el medio líquido. Por lo tanto, puede pasar desapercibido hasta la cuantificación del proplatelet, lo que lleva a resultados engañosos. Las buenas prácticas de laboratorio deben observarse estrictamente, especialmente durante la encapsulación de células de metilcelulosa que requiere manipulaciones numerosas y precisas de jeringas y conectores. La viabilidad de los megacariocitos también debe verificarse con azul de tripano utilizando una cámara de células nageotte para el conteo manual antes de volver a separ en el día 3.
En general, el protocolo proporcionado aquí describe un modelo in vitro para la comparación entre el cultivo líquido clásico y un cultivo 3D utilizando hidrogel de metilcelulosa. Cabe destacar que este protocolo de cultivo se describe paracélulas Lin primarias de ratón y aún no se ha adaptado a las células humanas. Este modelo 3D es una herramienta útil para investigar el impacto del entorno mecánico en el comportamiento y maduración de los megacariocitos9. También es posible agregar compuestos en el cultivo (incluso en el gel) para estudiar la influencia de los medicamentos en el comportamiento / maduración de los megacariocitos y la formación de proplatatos. Finalmente, al reproducir las restricciones mecánicas que las células pueden encontrar en la médula ósea, este sistema de cultivo permite la investigación de fenotipos anormales que no pudieron ser observados en cultivos líquidos clásicos como se mostró anteriormente para los megacariocitos knockout Myh9 9,13,14.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Fabien Pertuy y Alicia Aguilar que inicialmente desarrollaron esta técnica en el laboratorio, así como a Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Estrasburgo) que caracterizó las propiedades viscoelásticas del hidrogel de metilcelulosa. Este trabajo fue apoyado por ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) y por una beca ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher es beneficiaria de la Fondation pour la Recherche Médicale (número de subvención FRM FDT202012010422).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
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- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
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- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
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- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
