Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Brugervenlig, høj-throughput, og fuldautomatisk dataindsamling software til single-partikel Cryo-elektron Mikroskopi

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62832
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

Summary

Enkelt-partikel cryo-elektronmikroskopi kræver en passende softwarepakke og brugervenlig rørledning til automatisk dataindsamling med høj kapacitet. Her præsenterer vi anvendelsen af en fuldautomatisk softwarepakke til billedopkøb, Latitude-S, og en praktisk pipeline til dataindsamling af vitrified biomolekyler under lavdosisforhold.

Abstract

I de sidste mange år har teknologiske og metodiske fremskridt inden for enkeltpartikel kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) banet en ny vej for høj opløsning struktur bestemmelse af biologiske makromolekyler. På trods af de bemærkelsesværdige fremskridt inden for kryo-EM er der stadig plads til forbedringer i forskellige aspekter af enkeltpartikelanalysearbejdsgangen. Enkeltpartikelanalyse kræver en passende softwarepakke til automatisk dataindsamling med høj kapacitet. Flere automatiske dataindsamling softwarepakker blev udviklet til automatisk billedbehandling for single-partikel cryo-EM i de sidste otte år. Dette papir præsenterer en anvendelse af en fuldautomatisk billedopsamlingspipeline til vitrified biomolekyler under lavdosisforhold.

Det viser en softwarepakke, som kan indsamle cryo-EM-data fuldt, automatisk og præcist. Derudover styres forskellige mikroskopiske parametre let af denne softwarepakke. Denne protokol demonstrerer potentialet i denne softwarepakke i automatiseret billeddannelse af det alvorlige akutte luftvejssyndrom-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spikeprotein med et 200 keV kryo-elektronmikroskop udstyret med en direkte elektrondetektor (DED). Omkring 3.000 cryo-EM film billeder blev erhvervet i en enkelt session (48 timer) af dataindsamling, hvilket giver en atomare opløsning struktur af spike protein sars-CoV-2. Desuden indikerer denne strukturelle undersøgelse, at spikeproteinet vedtager to større konformationer, 1-RBD (receptorbindende domæne) åben og alle RBD ned lukkede konformationer.

Introduction

Single-partikel cryo-EM er blevet en mainstream strukturel biologi teknik til høj opløsning struktur bestemmelse af biologiske makromolekyler1. Enkeltpartikelrekonstruktion afhænger af erhvervelse af et stort antal mikrografer af vitrified prøver til at udtrække todimensionelle (2D) partikelbilleder, som derefter bruges til at rekonstruere en tredimensionel (3D) struktur af en biologisk makromolekyle2,3. Før udviklingen af DED'er varierede opløsningen opnået fra enkeltpartikelrekonstruktion mellem 4 og 30 Å4,5. For nylig har den opnåelige opløsning fra enkelt-partikel cryo-EM nået ud over 1,8 Å6. DED og automatiseret dataindsamling software har været store bidragydere til denne opløsning revolution7, hvor menneskelig intervention for dataindsamling er minimal. Generelt udføres cryo-EM-billeddannelse ved lave elektrondosishastigheder (20-100 e/Å2) for at minimere elektronstråleinduceret strålingsskader af biologiske prøver, hvilket bidrager til det lave signal-til-støj-forhold (SNR) i billedet. Denne lave SNR hindrer karakteriseringen af de høje opløsningsstrukturer af biologiske makromolekyler ved hjælp af enkeltpartikelanalyse.

Den nye generation elektrondetektorer er CMOS (komplementære metal-oxid-halvleder)-baserede detektorer, som kan overvinde disse lave SNR-relaterede forhindringer. Disse CMOS-kameraer til direkte detektion giver mulighed for hurtig udlæsning af signalet, som kameraet bidrager med bedre punktspredningsfunktion, passende SNR og fremragende detektivkvanteeffektivitet (DQE) til biologiske makromolekyler. Direkte detektionskameraer tilbyder høj SNR8 og lav støj i de optagede billeder, hvilket resulterer i en kvantitativ stigning i detektiv kvanteeffektiviteten (DQE) - et mål for, hvor meget støj en detektor tilføjer til et billede. Disse kameraer optager også film med hundredvis af billeder i sekundet, hvilket muliggør hurtig dataindsamling9,10. Alle disse egenskaber gør hurtige direkte detektionskameraer velegnede til lavdosisapplikationer.

Bevægelseskorrigerede stakbilleder bruges til databehandling til at beregne 2D-klassificering og rekonstruere et 3D-tæthedskort over makromolekyler ved hjælp af forskellige softwarepakker som RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 og EMAN215. Men for enkelt-partikel analyse, et enormt datasæt er nødvendig for at opnå en høj opløsning struktur. Derfor er automatiske dataindsamlingsafgifter meget afgørende for dataindsamlingen. For at registrere store cryo-EM-datasæt er flere softwarepakker blevet brugt i løbet af det seneste årti. Dedikerede softwarepakker, såsom AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS og EPU, er udviklet til automatiseret dataindsamling.

Disse softwarepakker bruger rutinemæssige opgaver til at finde hulpositioner automatisk ved at korrelere de lave forstørrelsesbilleder til billeder med høj forstørrelse, hvilket hjælper med at identificere huller med glasagtig is af passende istykkelse til billedopsamling under lavdosisforhold. Disse softwarepakker har reduceret antallet af gentagne opgaver og øget gennemløbet af cryo-EM dataindsamling ved at erhverve en stor mængde af god kvalitet data i flere dage kontinuerligt, uden afbrydelse og den fysiske tilstedeværelse af operatøren. Latitude-S er en lignende softwarepakke, som bruges til automatisk dataindsamling til enkeltpartikelanalyse. Denne softwarepakke er dog kun egnet til K2/K3 DED'er og leveres med disse detektorer.

Denne protokol demonstrerer Latitude-S's potentiale i den automatiserede billedopsamling af SARS-CoV-2 spikeprotein med en direkte elektrondetektor udstyret med en 200 keV cryo-EM (se materialetabellen). Ved hjælp af dette dataindsamlingsværktøj erhverves der automatisk 3.000 filmfiler med SARS-CoV-2 spikeprotein, og yderligere databehandling udføres for at opnå en 3.9-4.4 Å-opløsning spikeproteinstruktur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Der kræves tre vigtige trin til indsamling af cryo-EM-dataindsamling: 1. kryo-EM-gitterforberedelse, 2. kalibrering og justering af mikroskopet, 3. automatisk dataindsamling (figur 1). Desuden er automatiseret dataindsamling opdelt i a. passende områdevalg, b. optimering af Latitude-S, c. start automatisk hulvalg og d. start automatisk dataindsamling (figur 1).

1. Kryo-EM-gitterforberedelse og prøveindlæsning til automatisk dataindsamling

  1. Rengør gitrene ved hjælp af en glødeafladningsleder, og forskellige parametrene for udladning af glød baseret på forsøgskrav (her 60 s ved 20 mA).
  2. Der tilsættes en frisklavet proteinprøve (3 μL) til det glødeudledte gitter, og inkuber i 10 s.
  3. Blot gitrene til 3-5 s ved 100% fugtighed og hurtigt kaste dem i flydende ethan ved hjælp af en cryo-stemplet.
  4. Fastgør gitrene manuelt i en klippering for at danne patronen ved hjælp af en fleksibel C-klipring.
  5. Læg de frosne patronmonterede gitre i autoloaderkassetten, og overfør kassetten med nanohætten til mikroskopets forkølede autoloader til dataindsamling.

2. Microscope tuning og grundlæggende justering før automatisk dataindsamling

  1. Beam skift
    1. Klik på Beam skift fra fanen Direkte justering .
    2. Reducer forstørrelsen, og centrer strålen til den optiske akse ved hjælp af multifunktionsknappen X og Y .
  2. Justering af pivotpunkt
    1. Klik på indstillingen Beam tilt i Direkte justering pp X fra fanen Direkte justering .
    2. Kondenser strålen til et sted og minimer bevægelsen ved hjælp af Multifunction X og Y-knappen .
  3. C2 blænde centrering
    1. Vælg kondensatoråbningen under fanen Justering .
    2. Kondenser strålen til et sted, centrer strålen til den optiske akse, og udvid derefter strålen for at dække cirklen jævnt.
    3. Gentag disse trin, indtil blænden Kondensator 2 er justeret.
  4. Komafri justering
    1. Klik på Koma-fri Justering X fra fanen Direkte justering for at justere strålen til den optiske akse.
    2. Brug multifunktionsknappen til at minimere formen og bevægelsen af FFT (sørg for, at den er stabil).
    3. Gentag den samme procedure for Koma - fri tilpasning Y.
  5. Indstil parallel belysning før dataindsamling i cryo-EM på grund af C twin linse.
    1. Indsæt den objektive blænde (70 μm) i diffraktionstilstand.
    2. Fokus den objektive blænde på den forreste brændpunkt plan diffraktion linse ved at kontrollere defokus-intensitet drejeknap (objektiv linse og C2 linse strøm).
    3. Sørg for, at den skarpe kant af den objektive blænde ses efter korrekt defokusering.
    4. Indsæt stråleproppen og spred intensiteten, indtil guldpulver diffraktion ringene er minimeret.
      BEMÆRK: Hvis strålen spredes korrekt, er en klar diffraktionsring af guldpulveret synlig på skærmen, hvilket indikerer, at strålen er parallel.
    5. Træk stråleproppen tilbage, når du har indstillet den parallelle belysning, og skift mikroskoptilstanden til Nano-sonden.
      BEMÆRK: Kontroller mikroskopjusteringen, før dataindsamlingen startes, for at sikre mikroskopets optimale ydeevne. Alle disse indstillinger vil blive udført i mikroskopet Direkte justering GUI Tab. Al mikroskopjustering udføres ved hjælp af et testgitter før dataindsamling.

3. Dataindsamling med Latitude-S

  1. Start automatiseret software til erhvervelse af data på Latitude-S.
    BEMÆRK: Latitude-S-installationen kræver også mikroskopkalibrering, som udføres før dataindsamling, og indstillingerne gemmes permanent. Fem forskellige tilstande til dataindsamling er kalibreret med fire forskellige forstørrelser (figur 1 og figur 2). Atlas tilstand og gitter tilstand er i to forskellige forstørrelser i LM-tilstand (lav-forstørrelse intervaller). Hultilstanden er i SA-tilstand (områder med høj forstørrelse), men med en moderat forstørrelse. Fokus- og datatilstand bruger sa-tilstand med høj forstørrelse.
    1. Klik på DigitalMicrograph fra menuen Start , eller dobbeltklik på ikonet DigitalMicrograph på skrivebordet.
    2. Vælg ikonet Teknikstyring fra DigitalMicrograph.
      BEMÆRK: Dette system viser ikonerne TEM og Latitude-S (figur 2 og supplerende figur S1).
    3. Vælg Latitude-S-ikonet til automatiseret dataindsamling med enkeltpartikel.
      BEMÆRK: K2-kameraet fungerer i tre tilstande: lineær/integreret, tælles og superopløsning. Brugeren kan vælge en hvilket som helst tilstand i grænsefladen til DigitalMicrograph. Databilleder kan gemmes som enten dosisfraktionerede billedstakke eller som opsummerede billeder i MRC-, TIF- eller .dm4-filer med forskellige bitdybder. Desuden kunne data gemmes som bevægelseskorrigerede billeder til K3-kameraet. På et K2-kamera kan en uforarbejdet billedstak gemmes som 4-bit MRC-, 8-bit TIF- eller 8-bit .dm4-filer.
  2. Opret en ny session baseret på indstillingerne fra en tidligere session.
    1. Markér afkrydsningsfeltet Baseret på tidligere session i paletten.
    2. Vælg knappen Ny .
    3. Vælg den mappe, der indeholder den session, som den nye sessions indstillinger er baseret på. Gå til den forrige sessionsmappe for at oprette den nye session. Vælg den mappe, der skal gemmes den nye session og de tilknyttede data.
    4. Vælg og vælg den mappe, hvor den nye session og de tilknyttede data skal gemmes.
      BEMÆRK: Hver tilstand og dens underliggende indstillinger (forstørrelse, belysningsforhold, billede eller projektor) og stråleskift- og kameraparametre (total eksponering, enkeltrammeeksponering og binning) eksporteres fra den eksisterende session til den nye session. Stien til mappen vises som en tekststreng nederst på paletten. Hver af de stater og konfiguration paletter har en stjerne (*) føjet til titlen for at vise, at det allerede er blevet oprettet og er klar til brug.
  3. Fortsæt en eksisterende session.
    1. Tryk på knappen Fortsæt på paletten for at fortsætte en eksisterende session.
      BEMÆRK: Atlasmontagen kan ikke ændres.
    2. Vælg og naviger til den mappe, der indeholder den session, der skal fortsættes.
  4. Start en helt ny session.
    1. Klik på fanen Ny i paletten. Vælg den mappe, der indeholder den session, der skal fortsættes. Vælg en mappe, hvor dataene skal gemmes.
      BEMÆRK: Standardmappenavnet oprettes ved hjælp af dato og klokkeslæt.
    2. Klik på ikonet Indstilling . Tilføj tilstand i feltet Administrer tilstands udforske , der vises, angiv TEM-betingelsen, kameraets tilstand og billede/stak, og giv derefter navnet navnet navnet.
      BEMÆRK: Den automatiserede arbejdsgang for dataindsamling bruger 5 forskellige tilstande til automatiseret dataindsamling. Disse tilstande er konfigureret og gemt i deres respektive tilstand paletter. Tilstandsoversigten findes i tabel 1.
  5. Konfigurer atlastilstanden.
    1. Klik på Atlas tilstand palet.
    2. Konfigurer atlastilstanden med følgende parametre: forstørrelse 115x LM-tilstand i nanosonde, belysningsforhold-spotstørrelse 8 og lysstyrke 934400, binning: 1 og kameraeksponeringstid: 1,0 s til billedbehandling ved lav forstørrelse. Se tilstandsoversigten i tabel 1.
    3. Klik på Næste for at flytte til den næste tilstand.
      BEMÆRK: Atlastilstand er den laveste forstørrelsestilstand, som giver undersøgelsen af hele nettet (supplerende figur S2). Generelt hjælper denne tilstand os med at visualisere hele gitre ved lav forstørrelse og bedømme istykkelsen, fladheden og den ødelagte firkant af gitrene. Det anbefales at generere atlasset på forskellige områder af gitteret for at observere den optimale istykkelse og suboptimal istykkelse af gitrene (supplerende figur S3). De nævnte parametre kan varieres efter brugerens behov.
  6. Konfigurer gittertilstanden.
    1. Klik på gridtilstandspaletten.
    2. Konfigurer gridtilstanden med følgende mikroskopbilledoptik (forstørrelse 380x LM-tilstand i Nano-sonde), belysningsforhold (spotstørrelse: 8 og lysstyrke 626.200), binning: 1 og kameraeksponeringstid: 1,0 s.
    3. Se oversigten over Latitude-S-tilstand i tabel 1.
    4. Klik på Næste for at flytte til den næste tilstand.
      BEMÆRK: Gittertilstanden er indstillet til en forstørrelse, der er højere end atlastilstanden, således at synsfeltet er én gitterkvart (figur 2). I denne særlige forstørrelse observeres en gitterplads. Derfor observeres huller korrekt i denne forstørrelse, som hjælper med at kontrollere hullernes istykkelse (supplerende figur S4). Et simpelt båndfilter bruges i gittertilstanden til at finde hullerne i patentgitteret. De nævnte parametre kan varieres efter brugerens behov.
  7. Konfigurer hultilstanden.
    1. Klik på hulpaletten.
    2. Konfigurer hultilstanden med følgende mikroskopindstillinger: billedoptik (forstørrelse 4500x SM-tilstand i Nanosonde), belysningsforhold (spotstørrelse: 7 og Beam diameter 8,81 μm), binning: 1 og kameraeksponeringstid: 1,0 s.
    3. Rediger parametrene, hvis det er nødvendigt baseret på gittertypen. Se tilstandsoversigten i tabel 1.
    4. Klik på Næste for at flytte til den næste tilstand.
      BEMÆRK: SA-tilstanden angiver et område med høj forstørrelse i elektronmikroskopet. Hultilstanden er i SA-forstørrelsesområdet med et synsfelt på nogle få mikrometer (10-20 μm) (figur 2 og supplerende figur S4). Dette forstørrelsesområde er højere end Atlas- eller gittertilstanden, men meget mindre end Focus/Data-tilstanden. I denne forstørrelse vil individuelle huller være synlige. Hulstørrelsen er passende til at observere høje grader af forureninger, tomme huller og hullernes korrekte istykkelse. Hullerne til billeddannelse vælges ud fra disse antagelser. To filtre bruges i hultilstanden: en til krydskorrelere et hul referencebillede med et nyt hul billede og en anden til justering af scenehøjden til den eucentriske højde.
  8. Konfigurer fokustilstanden.
    1. Klik på Fokus palet.
    2. Konfigurer fokustilstanden med følgende mikroskopindstillinger: billedoptik (forstørrelse 45.000x SA-tilstand i nanosonde), belysningsforhold (spotstørrelse: 8 og lysstyrke 934400), binning: 1 og kameraeksponeringstid: 1,0 s.
    3. Fokuser på det amorfe kulstofområde nær hullet. Se den latitude-s-tilstandsoversigt, der findes i tabel 1.
    4. Klik på Næste for at flytte til den næste tilstand.
      BEMÆRK: SA-tilstanden angiver et område med høj forstørrelse i elektronmikroskopet. Fokustilstanden er den højere sa-områdeforstørrelse. I fokustilstand flyttes strålen til et nærliggende kulstofområde i målhullet og udfører fokus automatisk for at indsamle dataene i datatilstanden. Et båndfilter kombineret med et hanning- eller blødt rektangulært filter bruges i fokustilstand til at måle forskydningen mellem to fokustilstandsbilleder af samme område (figur 2). De nævnte parametre kan varieres efter brugerens behov.
  9. Konfigurer datatilstanden.
    1. Klik på Data palet.
    2. Konfigurer datatilstanden med følgende mikroskopindstillinger: billedoptik (f.eks. forstørrelse 28.000x, 45.000x, 54.000x i SA-tilstand i nanosonde), belysningsforhold (spotstørrelse: 8 og lysstyrke 934400), binning: 1 og kameraeksponeringstid: 1,0 s.
    3. Se den latitude-s-tilstandsoversigt, der er angivet i tabel 1.
    4. Klik på Næste for at flytte til den næste tilstand.
      BEMÆRK: Datatilstand er den højeste forstørrelse, der er valgt baseret på krav til pixelstørrelse og målopløsning (figur 2). Generelt, efter at have fokuseret, flyttes strålen automatisk til målområdet for at indsamle dataene. Ovennævnte parametre kan ændres baseret på brugerens krav.

4. Fokus konfiguration

  1. Klik på Fokus konfigurationspalet. Angiv defokuseringsværdier og trinstørrelsen under den angivne fane.
  2. Tryk på knappen Næste for at gå videre til næste trin.
    BEMÆRK: Lavere defokuseringsværdier kan bruges til dataindsamling i høj opløsning. Generelt bruges -0,5 til -3,0 μm defokuseringsværdier med 0,25 eller 0,5 defokuseringstrinstørrelser til billedopsamling. Brugerne kan springe fokusopsætningstrinnet over, hvis de kun vil screene eksemplet. Du skal blot trykke på knappen Næste på paletten for at springe fokuskonfigurationstrinnet over.

5. Finjustering

  1. Fokus på nogle funktioner på nettet (f.eks. isforurening sekskantet is); se figur 3.
    BEMÆRK: Funktionerne bør ikke være for store eller for små. De skal være synlige ved både Atlas tilstandsforstørrelse 115x (LA-tilstand) og dataforstørrelse.
  2. Klik på knappen Hent . Placer det røde kryds på den samme funktion på hvert billede af forskellige tilstande.
  3. Start med fokus, data og hultilstande, fordi deres synsfelt er meget større end atlas- og gittertilstandene. Zoom på atlas- og gittertilstande for at placere røde kryds-mærket på den samme funktion i atlas- og gittertilstandene.
  4. Klik på knappen Beregn for at beregne placeringen af fem forskellige tilstande, som beregner forskydningerne mellem hver af staterne og afspejler disse til outputvinduet.
    BEMÆRK: Forskydningsværdierne er integreret i de stater, der skal anvendes nærmere (figur 3). Finjustering udføres for at give høj nøjagtighed af hver stats position (figur 3). Denne fine justering hjælper med at lokalisere den nøjagtige position i alle de fem stater. Finjustering er afgørende for erhvervelse af enkeltpartikler. Derfor anbefales det stærkt at udføre finjustering før billeddannelse.

6. Dataindsamlingsprocedure ved hjælp af Latitude-S

  1. Klik på Capture paletten.
    BEMÆRK: Generelt indsamles atlasdata ved lav forstørrelse (115x) for at visualisere de fleste gitterkvartaler.
  2. Vælg atlasets størrelse for at dække hele gitteret eller en del af gitteret baseret på kravet (f.eks. 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 eller 8 x 12).
    BEMÆRK: 16 af 16 atlasstørrelse dækker hele nettet.
  3. Klik på capture-knappen for at fange atlasset.
    BEMÆRK: Det primære Latitude-S-navigationsvindue åbnes og udfylder den tilgængelige plads i DigitalMicrograph (supplerende figur S5). Tre billedruder i hovednavigationsvinduet viser billeder af systemtilstandene ved tre forskellige forstørrelser. Det overordnede atlas vises i øjeblikket i den aktuelle anskaffelsestilstand i ruden længst til venstre. Fliser i atlas vil fylde op som hver fangst sker.
  4. Vælg gittertorget baseret på istykkelsen ved at navigere på atlasset (supplerende figur S5). Når de ønskede gitter firkanter er valgt, skal du klikke på knappen Tidsplan og observere fliserne i gitteret pladsen fyldes op som hver gitter firkant er fanget.
  5. Klik på knappen Planlæg , når gitterkvarterne er markeret.
  6. Vælg et repræsentativt hul i gitterkluden ved at tilføje dets placering. Når et hulbillede er anskaffet, skal du definere data og fokusere positioner og gemme layoutet som en skabelon (supplerende figur S6).
  7. Klik på Auto find, give hullet størrelse (f.eks R1.2/1.3), og klik på knappen Søg i programmet, hvilket vil medføre, at Find programmet til automatisk at finde hullerne baseret på hullet diameter. Klik derefter på knappen Marker for at tilføje skabelonen (figur 4) og tilføje røde cirkelmærker i alle hullerne i et gitter eller en delvis gitterklud.
  8. Konfigurer intensiteten for at fjerne hullerne fra gitterpladsen og isforureningen (figur 4).
    BEMÆRK: Endelig markeres de valgte huller med gult til planlægning af dataindsamlingen.
  9. Klik på knappen Planlæg i Latitude-opgaver , når du har tilføjet hullerne via Automatisk søgning.
    BEMÆRK: Før du planlægger den automatiserede dataindsamling, skal du sikre dig, at det flydende nitrogentankniveau er tilstrækkeligt, turbopumpen til autoloaderen er slukket, og RAID-diskpladsen er ledig. Latitude-S-jobliste viser antallet af atlas-, gitterklud-, hul- og datatilstande, der er planlagt til dataindsamling (figur 5). I Latitude-S GUI vil forskellige farveskemaer være synlige, og betydningen af de forskellige farveskemaer vises: 1. Gul angiver uplanlagt; 2. Grøn angiver planlagt; 3. Blå angiver erhvervet; 4. Rød angiver mislykkedes.

7. Cryo-EM databehandling

BEMÆRK: Cryo-EM billedbehandling af spike protein er beskrevet i detaljer i nyere litteratur25.

  1. Udfør billedbehandling af spikeprotein af SARS-CoV2 ved hjælp af RELION 3.011.
  2. Screen de filmbilleder, der indsamles manuelt ved hjælp af Latitude-S, og udfør stråleinduceret bevægelseskorrektion af de enkelte film ved hjælp af MotionCor2-software9. Udfør den første screening af de bevægelseskorrigerede mikrografer manuelt ved hjælp af cisTEM-softwarepakke14.
    BEMÆRK: Næsten 85% af de automatisk erhvervede mikrografer var af god kvalitet, og data havde signal inden for 3,7-5,2 Å, som beregnes ved hjælp af cisTEM-software14 (supplerende figur S7A, B).
  3. Behandl dataene ved hjælp af RELION 3.0-softwarepakken11.
    1. Vælg spidspartikler manuelt og underkaste dem 2D-klasseklassifikation (supplerende figur S7C). Brug den bedste 2D-klasse som reference til autopick 3.99.842 single-spike partikler fra mikrografer ved hjælp af RELION autopick tool11.
      BEMÆRK: Der blev udført tre runder af 2D-klassificeringen, før partiklerne blev underkastet 3D-klassificering (supplerende figur S8). Ca. 2.55.982 enkeltpartikler blev udvalgt til 3D-klassificering, og datasættet blev klassificeret i seks klasser. Den endelige 3D auto-raffinement blev udført med den bedste klasse; 85.227 spike partikler blev opnået fra 3D-klassificeringen.
    2. Efter auto raffinement, udføre pr partikel defokusere raffinement med korrekt stråle tilt parametre for opløsning forbedring. Derefter skal partiklerne underkastes bayesisk polering ved hjælp af RELION 3.0-softwarepakken11. Endelig skal du bruge den polerede partikel sæt til en anden runde af 3D auto-raffinement ved hjælp af RELION 3,011.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I den nuværende pandemisituation spiller cryo-EM en central rolle i karakteriseringen af strukturerne af forskellige proteiner fra SARS-CoV-226,27,28,29, som kan hjælpe med at udvikle vacciner og lægemidler mod virussen. Der er et presserende behov for en hurtig forskningsindsats med begrænsede menneskelige ressourcer til at bekæmpe coronasmitten i 2019. Dataindsamling i enkelt-partikel cryo-EM er et tidskrævende, men afgørende skridt i strukturen bestemmelse af makromolekyler. Den seneste udvikling inden for automatisk indsamling af cryo-EM har muliggjort begrænset menneskelig indblanding i dataindsamlingen. Latitude-S-softwaren er en vigtig automatisk softwarepakke til dataindsamling, der bruges her til automatiseret dataindsamling af renset SARS-CoV2 spikeprotein.

Cryo-EM dataindsamling af SARS-CoV-2 spike protein blev udført med en 200 keV cryo-EM udstyret med en K2 Summit DED. Stederne for dataindsamling på nettet med ønskelig istykkelse og partikelfordeling blev markeret manuelt. Stillingerne blev markeret parallelt under dataindsamlingen, der fandt sted i baggrunden. På de markerede positioner udførte Latitude-S-software automatiseret dataindsamling med en nominel forstørrelse på 42.200x i pixelstørrelsen på 1,17 Å på prøveniveau. Konfigurationen til dataindsamling ved 42.200x forstørrelse blev allerede forudindstillet og testet. I alt 40 billeder blev registreret for 8 s med elektrondosis på 2 e−/Å2 pr. ramme. der blev således anvendt en samlet dosis på 80 e−/Å2 til dataindsamling (supplerende figur S9). Dataene blev indsamlet i et defokuseringsområde på −0,75 μm og −2,25 μm, med 3.000 filmfiler indsamlet på to dage. Hver 4 timer, periodiske kontrol og justeringer blev udført af softwaren for at sikre, at alle de filmfiler indsamlet over 48 timer var af god kvalitet, og der var ingen stråle skift eller justering skift. Dataene blev indsamlet uafhængigt uden menneskelig indgriben. Derudover stopper Latitude-S automatisk billeddannelse på tidspunktet for flydende nitrogenfyldning, hvilket reducerer unødvendige vibrationer eller mekanisk drift i billederne.

Som nævnt i protokolafsnittet blev den første screening af bevægelseskorrigerede mikrografer udført manuelt ved hjælp af cisTEM-software14. Baseret på screeningen viste det sig, at de fleste data lå inden for signalområdet 3,7-5,2 Å (supplerende figur S7A). Dette tyder på, at den automatiske dataindsamling ved hjælp af Latitude-S er god, og de fleste af dataene er velegnede til 3D-rekonstruktion i høj opløsning. Derudover blev billeder indsamlet på defocus range (-0,75 til -2,25 μm), og forskellige defokuserede intervaller blev manuelt kontrolleret af cisTEM14. De erhvervede data var meget tæt på opsætningen defokuseringsområde i Latitude-S (supplerende figur S7A, B).

Databehandlingen blev udført ved hjælp af RELION 3.0-softwarepakken11. Spike partikler blev manuelt plukket til at beregne 2D-klassen gennemsnit. Forskellige strukturelle detaljer (helix og β-ark) er synlige i 2D-klasse gennemsnit (supplerende figur S7C), hvilket kraftigt tyder på, at høj opløsning strukturel karakterisering er mulig ved hjælp af dette datasæt. Men, 3D klassificering indikerer også, at spike protein har 1-receptor-bindende domæne (RBD) op åben og alle RBD ned lukke kropsbygning (supplerende figur S8). 3D-klassificeringen angiver, at klasse-1 har det maksimale antal partikler, der vises som en 1-RBD op åben kropsbygning. Desuden har klasse-3 og klasse-4 et lignende antal partikler, og begge modeller syntes at have alle RBD ned tæt kropsbygning. Klasse-5 viser dog en mellemliggende kropsbygning, hvor 1-RBD er i en mellemposition. 1-RBD op åbne konformationer af spike protein blev rekonstrueret ved hjælp af C1 symmetri, og den samlede opløsning er 4,4 Å (figur 6 og supplerende figur S10). Tilsvarende blev alle RBD ned tæt kropsbygning (klasse-3 og klasse-4) raffineret sammen med C3 symmetri, og den samlede opløsning på 0,143 FSC er ~ 3,9 Å (Figur 7).

Den samlede billedbehandling indikerer, at spikeproteinet vedtager alle RBD'er tæt på og 1-RBD op åben kropsbygning. Derudover identificere en mellemliggende kropsbygning af spike protein blev identificeret. Kryo-EM-strukturen i S2-underdomænets S2-underdomæne i høj opløsning angiver sidekæderne af individuelle aminosyrerester (figur 6B og figur 7C). Alle 3D-rekonstruktioner og cryo-EM-resultater ligner meget resultaterne i nyligt offentliggjort litteratur25. Men den høj opløsning cryo-EM struktur af spike protein var karakteriseret inden for 15 dage, hvilket kun er muligt på grund af automatisk cryo-EM dataindsamling protokoller og automatisk partikel-picking software. Derfor kan automatiske dataindsamlingssoftwarepakker, herunder Latitude-S, bidrage væsentligt til karakteriseringen af flere højopløselige cryo-EM-strukturer af biologiske makromolekyler.

Figure 1
Figur 1: Arbejdsgang for automatiseret dataindsamling ved hjælp af Latitude-S: Generelle trin, der skal følges før dataindsamling (gitterforberedelse, prøveindlæsning og mikroskopjustering). Dataindsamling er hoveddelen af dette manuskript, og den pipeline, der skal følges under dataindsamlingen, fremhæves. Forkortelser: cryo-EM = kryo-elektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Opsætning af forskellige tilstande til dataindsamling med enkeltpartikel ved hjælp af Latitude-S GUI. (A) Latitude-S-softwarepakke til dataindsamling i DM3-softwaredragt. (B) Arbejdsgang for dataindsamlingsproceduren. (C) Udvidelse af hvert panel. Forkortelse: GUI = grafisk brugergrænseflade. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Finjustering for at konfigurere høj nøjagtighed til fokusering og billedopkøb. Finjustering udføres på fem stater a. Atlas, b. Hole, c. Data, d. Grid, e. Focus. Fokuser hver tilstand ved at placere det røde mærke på den samme position. Det anbefales stærkt at udføre finjustering, før du starter en ny session, hvilket vil hjælpe med at udføre billedbehandling i en bestemt position. Billedopkøb i en bestemt position (uden større skift) afhænger helt af nøjagtigheden af den fine justering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Automatisk hulvalg ved hjælp af Latitude-S. Automatisk fund af huller til dataindsamling udføres automatisk baseret på hulstørrelse. (A) Viser placeringen af hulsøgningsvektoren til automatisk at finde hullerne. Skalastang = 20 μm. (B) Viser markering af huller ved hjælp af hulsøgningsvektoren og justering af intensiteten for at fjerne markøren fra grænseområdet og isforurening. Skalastænger = 20 μm (venstre) og 10 μm (i midten). (C) Viser automatisk tilsætning af hullerne til billeddannelse (gul). Skalalinje = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Live view af dataindsamling. (A) Positionerne er markeret med gul, grøn, blå og rød baseret på status for dataindsamling på hver position. (B) Farvekode til overvågning af status for dataindsamling. Grøn: Planlagt, Gul: Uplanlagt, Blå: Hent, Rød: Mislykkedes. Det venstre panel viser flere huller farvet grøn (planlagt) og et par huller markeret blå (erhvervet); skalalinje = 10 μm. Det midterste panel viser 4.300x forstørrelse af et individuelt hul. I dette billede af et hul (midterste panel) viser den blå firkantede boks fokusområdet, og den grønne firkantede boks viser billedområdet. skalalinje = 1000 nm. Det højre panel viser det erhvervede billede. Panelet yderst til højre viser de planlagte billednumre, den samlede tid, der kræves til billedbehandling, og hvor mange billeder der er planlagt til billedbehandling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Spike 3D-tilstand med 1RBD åben. (A) Auto-raffineret og skærpet spike protein kort over 1-RBD op åben er repræsenteret i side, top og bund synspunkter. (B) EM-kortet er udstyret med krystalstruktur for bedre visualisering af sidekæderne. De fremhævede regioner på kortet har tætheder for sidekæder. Forkortelser: 3D = tredimensionelle; RBD = receptorbindende domæne; EM = elektronmikroskopi; NTD = N- terminaldomæne; S1 = underenhed 1; S2 = underenhed 2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Alle RBD ned tæt kropsbygning af spike protein. (A) Auto-raffineret og skærpet spike protein kort over alle RBD ned tæt kropsbygning repræsenteret i side og top visning. (B) EM-kortet er udstyret med krystalstruktur for bedre visualisering af sidekæderne. Pilene viser, at regionerne på kortet har tætheder for sidekæder (C). Forkortelser: RBD = receptorbindende domæne; EM = elektronmikroskopi; NTD = N- terminaldomæne; S1 = underenhed 1; S2 = underenhed 2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur S1: Gui for erhvervelse af Latitude-S-billeder: Forskellige mikroskopregulatorer (f.eks. søjleventil åben/luk, skærmindsats/tilbagetrækning styres af Latitude-S GUI. Søjleventil, kamera, skærmstatus og flydende nitrogenfyldning kan styres i venstre panel. Nederst i dette panel vises forskellige kalibreringsparametre grønne (f.eks. Forstørrelse, stråleflis, objektiv fokus). Hvis en parameter ser sort ud, angiver det, at parameteren ikke er optimeret korrekt. Derfor skal alle parametre optimeres, før du starter en ny session. Forkortelse: GUI = grafisk brugergrænseflade. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Repræsentation af Atlas stat. Forskellige Atlas stater, der viser gitter firkanter og den type is dannet. (A-F) Forskellige Atlas størrelser er også fremhævet. (A, B, D, F) Et tykt ismønster er fremhævet. (C, D) Ødelagte firkanter er fremhævet. Tyk is og ødelagte områder (markeret i figuren) er ikke egnede til billeddannelse. (E, F) Gode gitter firkanter til billedbehandling; A, B, C, D og F viser de gitter firkanter egnet til høj opløsning billeddannelse. Tykke isgitter og brudte gitter firkanter skal dog udelukkes. Skalastænger = 100 μm (A-C), 50 μm (D, E) og 25 μm (F). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Repræsentation af Grid tilstand og Hole tilstand. Gittertilstand og tilsvarende hultilstand vises på billedet. (A, E) Tomt hul, (F, G) tyk is, (E) isforurening, og (A, B, C, D, E og G) passende istykkelse er markeret i billedet. Der vælges passende huller i istykkelse til billedopsamlingen (A, B, C, D, E og G). Skalastænger = 10 μm (A, E, F, G), 2 μm (B), 50 μm (C), 5 μm (D). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: Hulreference til automatisk billeddannelse. Hulbillede (QUANTIFOIL-Holey Carbon grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3) er fanget og gemt til fremtidig reference. Størrelsen af hulreferencen kunne varieres baseret på de forskellige typer gitre. Det anbefales altid at fange hulreferencen, før du starter en ny session. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S5: Billedfangerpanel ved forskellige forstørrelser og hulvalg. (A) Capture-panelet viser indstillingerne for dataindsamling. (B) Latitude-S's hovednavigationsvindue viser tre forstørrelser i træk. I Atlas-tilstand (150x) vælges gitterkvalerne til dataindsamling (venstre panel, skalalinje = 50 μm). Ved højere forstørrelse (380x) er en enkelt firkant fokuseret (mellempanel, skalalinje = 20 μm). Yderligere højere forstørrelse (4.300x), huller inde i hver firkant er fokuseret (højre panel, skala bar = 5 μm). Disse forstørrelser vil dog ændre sig i henhold til gitterenes størrelse og form. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S6: Oprettelse af en skabelon til valg af huller og billeddannelse. Skabelongenerering udføres ved at tilføje en position på hullet til data, og fokus er placeret ved siden af hullet på kulstofoverfladen. Fokus bør placeres på kulstofområdet, så strålediameteren ikke må berøre noget tilstødende hul. Skalastænger = 20 μm (venstre panel), 10 μm (midterpanel), 1000 nm (højre panel). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S7: Cryo-EM-billeddannelse af SARS-CoV2 ved hjælp af Latitude-S og billedscreening. (A) Screening af erhvervede mikrografer: 1D CTF-pasform, 2D CTF-pasform og CTF-parametre vurdering af SARS-CoV2-spikeproteindata ved hjælp af cisTEM. 1D CTF fit og Thon ring viser, at det samlede signal er 4,8 Å. (B) Mikrografer ved to forskellige defokuseringsværdi af spikeproteinet erhverves ved hjælp af Latitude-S. Skalastænger = 50 nm. (C) Endelig 2D-klasse gennemsnit. 2D-klasse gennemsnit viser top, bund og side visninger af spike protein. Alle detaljer med høj opløsning er synlige i 2D-klassegennemsnit. Forkortelser: cryo-EM = kryo-elektronmikroskopi; 1D = endimensionel; 2D = todimensionel; CTF = kontrastoverførselsfunktion; SARS-CoV2 = alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S8: Databehandling af SARS-CoV2 spike protein data erhvervet ved hjælp af Latitude-S software. Billedet viser arbejdsgangen fulgt til behandling af cryo-EM data af spike protein. 3D-klassificering af spikeprotein udføres ved hjælp af Relion 3.0. Klasse-1 viser 1-RBD op åben kropsbygning. Klasse-3 og klasse-4 viser alle RBD ned tæt kropsbygning af spike-protein. Klasse-5 viser den mellemliggende kropsbygning af spikeproteinet. Forkortelser: cryo-EM = kryo-elektronmikroskopi; 3D = tredimensionel; RBD = receptorbindende domæne; SARS-CoV2 = alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S9: Dosisfraktioneret billede taget som reference til endelig billedopsamling. Dosisfraktioneringsbilleder optages med en eksponering på 8,0 og 0,2 s/frame eksponering. Klik på knappen Gem automatisk i nærheden af kameraet for at gemme filmfilerne automatisk. Efter billedopsamling skal du klikke på billedet og gemme de dosisfraktionerede billedparametre ved hjælp af den billedopdateret knap i dataindsamlingstilstanden. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S10: Kantet fordeling og Fourier shell korrelation af den genererede SARS-CoV-2 1 RBD op åben kropsbygning spike protein kort. (A) Kantet fordeling af den endelige 3D-model af 1-RBD op åben kropsbygning af spike protein. Blå repræsenterer lavere værdier, og rød repræsenterer højere værdier af den normaliserede partikelfordeling. (B) Fourier shell korrelation kurve viser 4,4 Å opløsning af 1-RBD op åben kropsbygning af spike protein, anslået ved cut-off. Forkortelser: 3D = tredimensionelle; RBD = receptorbindende domæne; SARS-CoV2 = alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2; FSC = Fourier shell korrelation. Klik her for at downloade denne fil.

Tilstand af Atlas-billede Atlas 115
Forstørrelse 115, Pixelstørrelse 34,7 nm
Angivet defokusering 4,38 mm
Spotstørrelse 8
Lysstyrke 934400
Tilstand IMAGINGILM
Binning 1
Eksponeringstid 1,0 s
Gitterundersøgelsestilstand Gitter 380
Forstørrelse 380, Pixelstørrelse 11,2 nm
Angivet defokusering 2,37 mm
Spotstørrelse 8
Lysstyrke 626200
Tilstand IMAGINGILM
Binning 1
Eksponeringstid 1,0 s
Hul undersøgelse tilstand Hul 3400
Forstørrelse 3.400, Pixelstørrelse 1,20 nm
Angivet defokusering -0,75 μm
Spotstørrelse 7
Strålediameter 8,81 μm
Tilstand IMAGINGILM, SA, Mh
Binning 1
Eksponeringstid 1,0 s
Fokustilstand Fokus 45k
Forstørrelse 45.000, Pixelstørrelse 0,0924 nm
Angivet defokusering 4,51 μm
Spotstørrelse 6
Strålediameter 0,716 μm
Tilstand IMAGINGILM, SA, Mh
Binning 1
Eksponeringstid 1,0 s
Acqisition Stat Data 45k
Forstørrelse 45.000, Pixelstørrelse 0,0924 nm
Defokuseringsopsætning Min: -4.500 nm, Max: -1.500 nm, Trin: 250 nm
Spotstørrelse 6
Strålediameter 0,752 μm
Tilstand IMAGINGILM,SA,Mh
Binning 1
Eksponeringstid I alt 8 s eksponering for 20 billeder
Opsætning af kamera Tælles, Gain normaliseret, defekt korrigeret
Opsætning af lagring af data MRC

Tabel 1: Oversigt over opsætning af Latitude-S-tilstand.

Specifikation K2-base K2-topmødet
TEM-driftsspænding 200-400 kV
Sensor aktivt område 19,2 mm × 18,6 mm
Sensorstørrelse i pixel 3838 × 3710 7676 × 7420 Super-
Opløsning
Fysisk størrelse på al pixel 5 μm
Binning 1-8x
Sensorudlæsning Ethvert vilkårligt område
Forstørrelse i forhold til film 1.3–1,5x
Sensoraflæsningshastighed 50 fuld fps 400 fuld fps
Overfør hastighed til computer 8 fuld fps 40 fuld fps
Billedvisning 8 fuld fps 10 fuld fps
DQE-ydeevne (300 kV) >0,30 (peak) >0,25 på 0,5 af fysiske Nyquist >0,7 (peak) >0,50 på 0,5 af fysiske Nyquist >0,06 på 1,25 af fysiske Nyquist
Programmel Gatan Mikroskopi Suite herunder DigitalMicrograph

Tabel 2: Kameraspecifikationer.

Indstilling for konfiguration Værdi
Mikroskoptype Talos Arctica G2
Høj spænding 200 kV
Kilde XFEG
Linse Cryo Twin
Vakuumsystem Talos TMP IGP
Eksempelindlæser Autoloader

Tabel 3: Mikroskopkonfiguration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Latitude-S er en intuitiv brugergrænseflade, som giver et miljø til automatisk at konfigurere og indsamle tusindvis af mikrografer eller filmfiler i høj opløsning på to dage. Det giver nem navigation på tværs af gitrene og bevarer placeringen af mikroskopstadiet, mens det bevæger sig fra lav forstørrelse til høj forstørrelse. Hvert trin i dataindsamlingen med Latitude-S er tidseffektivt med funktioner som en enkel brugergrænseflade, hurtig streaming af data med op til 4,5 GB /s hastighed og samtidig visning af data under erhvervelsen. Derudover blev parametrene for prækalibreret dosisfraktionering, dosishastighed, fokus og forstørrelse let genindlæst for at starte en ny session med automatisk dataindsamling og spare tid.

At erhverve data automatisk i mangel af konstant overvågning og uden at gå på kompromis med kvaliteten af datasættet er en udfordrende og tidskrævende opgave. Automatiseret dataindsamling ved hjælp af Latitude-S-software er praktisk, når tid og ressourcer er store begrænsninger, især under denne pandemi. Men flere cryo-EM strukturer af forskellige proteiner af SARS-CoV-2 er blevet løst i de sidste par måneder, hvilket vil hjælpe farmaceutiske virksomheder med at udvikle vacciner. Forskellige laboratorier bruger forskellige typer automatiske dataindsamlingssoftwarepakker til at indsamle data. Vi brugte Latitude-S med en K2 Summit DED til cryo-EM automatisk dataindsamling på holey carbon grids eller hjemmelavede GO-belagte gitre30.

Denne undersøgelse blev udført ved hjælp af ovennævnte parametre i protokolafsnittet, hvilket giver stærke beviser for, at Latitude-S er en passende og ideel softwarepakke til automatisk dataindsamling til enkeltpartikel cryo-EM. Det anbefales dog stærkt at følge visse protokoller, før du starter billeddannelsen ved hjælp af et K2-kamera. K2 direkte detektionskamera kræver grundlæggende vedligeholdelsesrutiner for at opnå den højeste ydeevne. Regelmæssig udglødning af kameraet til 50° i 24 timer hjælper sensoren med at udføre optimalt ved at reducere baggrundsstøj og forurening på overfladeniveau. Men efter kamera udglødning, opdatering af gain og mørke referencer af kameraet er et obligatorisk skridt (tager ~ 45 min), før du udfører et billede erhvervelse.

Selvom Latitude-S er en stabil og brugervenlig softwarepakke til kryo-EM automatisk dataindsamling, er det vigtigt at optimere forskellige parametre (forstørrelser, spotstørrelse, lysstyrke og dosishastighed) i 5 forskellige tilstande af Latitude-S i begyndelsen. Forstørrelsen af huller eller gittertilstande afhænger af hulstørrelserne for de hulgitter eller hulgittertyper (f.eks. R2/2 eller R1.2/1.3 eller R 0.6/1). F.eks. er R0.6/1-typen gitterhulsstørrelse 0,6 μm, og hulstørrelsen på R2/2-gitteret er 2 μm. Således kræves der to forskellige typer forstørrelse for at visualisere hullerne korrekt til gittertyperne R0.6/1 og R2/2 i gitter- og hultilstandene i Latitude-S.

Derfor vil forstørrelsesindstillingerne for forskellige typer gitre i 5 forskellige tilstande være variable. Spotstørrelsen og lysstyrken afhænger i høj grad af forstørrelsen. Derfor kan disse værdier ændre sig ved forskellige forstørrelsesværdier. Derfor anbefales det at optimere de forskellige parametre i de 5 forskellige tilstande af Latitude-S ved hjælp af forskellige typer kryo-EM-net, før du starter automatisk dataindsamling. Men når alle parametre er optimeret og gemt, er det nemt at genindlæse alle parametre baseret på brugerens krav og bruge Latitude-S ved forskellige forstørrelser eller gittertyper.

En vigtig fordel ved at bruge K2 med Latitude-S er, at brugerne nemt kan regulere den åbne/lukke stråleventilen, indsætte/trække kameraet tilbage, indsætte/trække mikroskopets fosforskærm tilbage og regulere flydende nitrogenfyldning ved hjælp af Latitude-S's GUI. Andre muligheder (f.eks. kanonskift, kanonskift, stråleskift, pivotpunkter, C2-blændecenterering, rotationscenter, komafri justering) er dog ikke tilgængelige via fanen K2 Latitude-S GUI (supplerende figur S1 og figur 2). I løbet af de lange timer med dataindsamling kan strålens position skifte.

Latitude-S kan udføre automatiske periodiske kontroller og rettelser for at holde styr på systemets stabilitet i hele dataindsamlingsperioden. Systemets stabilitet opretholdes ved at centrere strålen og opdatere de mørke referencer. Den konstante kontrol sikrer den høje kvalitet af de erhvervede data. I Latitude-S korrigeres eucentrisk højde (Z-højde) kun én gang før dataindsamling, og den eucentriske højde beregnes automatisk af Latitude-S, når den ændrer gitterkvartalet. Fokus måles og justeres automatisk baseret på det brugerdefinerede fokusområde. Fase Z-positionen nulstilles, hvis den overskrider den angivne tærskelværdi. Denne stabilitet styres gennem paletten Systemstabilitet. Men ligesom andre automatiske dataindsamlingspakker har Latitude-S også nogle begrænsninger.

Latitude-S kan ikke beregne den eucentriske højde (Z-højde), hvis gitteret er ujævnt. I dette scenario kan den ikke indsamle data, eller defokuseringsværdierne vil være helt uden for området. Derfor bør brugerne være yderst forsigtige med at forberede deres gitre uden nogen bøjning og billede kun flad overflade gitre ved hjælp af Latitude-S. I modsætning til Leginon, SerialEM og UCSF-Image er Latitude-S desuden ikke en frit tilgængelig softwarepakke. Latitude-S er kompatibel med gatankameraer, herunder filtrerede eller enkeltstående T2-, K3- og K3-basiskameraer til direkte detektion samt Rio- og OneView-kameraer. En anden vigtig ulempe for brugerne er, at det ikke er kompatibelt med andre populære DED'er som Falcon DED. Dette gælder dog også for EPU, en anden automatisk dataindsamlingssoftwarepakke, som er tilgængelig med kryomikroskoper og kun kompatibel med Falcon-kameraet. EPU er dog også funktionel med K2/K3 med et energifilter (BioQuantum K3 Imaging Filter), men ikke med et selvstændigt K2/K3-kamera.

Latitude-S ligner meget EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation og Leginon, som er softwarepakker, der bruges til automatisk dataindsamling til enkeltpartikel kryo-EM. Latitude-S er dog kun kompatibel med K2 DED, K3 DED eller BioQuantum K3 Imaging Filter. Derudover ydes virksomheden løbende teknisk support til Latitude-S-brugere. Denne tekniske support er til gavn for små brugergrupper, der har brug for at bruge K2 DED-, K3 DED- eller BioQuantum K3 Imaging Filter-enhederne til dataindsamling og ikke har nogen forudgående viden om, hvordan du konfigurerer eller bruger gratis softwarepakker som SerialEM og Leginon.

Der er mange andre funktioner, såsom mikrokrystal elektron diffraktion (microED), tomografi, og energi-dispersive X-ray spektrometri (EDS), som er tilgængelige i forskellige andre versioner af Latitude. Derfor kan brugerne bruge den samme softwarepakke til dataindsamling i andre tilstande. Så vidt vi ved, er dataindsamling til microED, tomografi og EDS ikke tilgængelig i EPU eller andre softwarepakker. Derfor kan denne Latitude-softwarepakke være nyttig til forskellige formål ud over automatisk dataindsamling i enkeltpartikel cryoEM. SerialEM og Leginon, begge gratis softwarepakker, er dog velegnede til Falcon- eller K2/K3-kameraer og er yderst nyttige for nye brugere. Latitude-S er dog ikke frit tilgængeligt, hvilket kan være en ulempe ved denne softwarepakke.

Sammenfattende er Latitude-S automatiske dataindsamlingsværktøj lige så godt som andre automatiske dataindsamlingssoftwarepakker (f.eks. EPU, Leginon, SerialEM, UCSF-Image). Latitude-S er en ekstremt stabil og brugervenlig softwarepakke til dataindsamling, som fås med filtrerede eller enkeltstående K2-, K3- og K3-base-direkte detektionskameraer samt Rio- og OneView-kameraer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende eller finansielle interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Vi anerkender Department of Biotechnology, Department of Science and Technology (DST) og Science, og Ministry of Human Resource Development (MHRD), Indien, for finansiering og cryo-EM facilitet på IISc-Bangalore. Vi anerkender DBT-BUILDER Program (BT/INF/22/SP22844/2017) og DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) for National Cryo-EM facilitet på IISc, Bangalore. Vi anerkender finansiel støtte fra Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 og SERB-IPA/2020/000094), DBT (bevilling nr. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Vi takker Ms Ishika Pramanick for at forberede cryo-EM gitre, cryo-EM dataindsamling, og forberede tabellen over materialer. Vi takker også Mr. Suman Mishra for cryo-EM billedbehandling og for at hjælpe os med at forberede tallene. Vi takker Prof. Raghavan Varadarajan for at hjælpe os med at få den rensede spike proteinprøve til denne undersøgelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blotting paper Ted Pella, INC. 47000-100 EM specimen preparation item
Capsule Thermo Fisher Scientific 9432 909 97591 EM specimen preparation unit
Cassette Thermo Fisher Scientific 1020863 EM specimen preparation unit
C-Clip Thermo Fisher Scientific 1036171 EM specimen preparation item
C-Clip Insertion Tool Thermo Fisher Scientific 9432 909 97571 EM specimen preparation tool
C-Clip Ring Thermo Fisher Scientific 1036173 EM specimen preparation item
EM grid (Quantifoil) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow discharge Machine Quorum N/A Quorum GlowQube glow discharge machine
K2 DED Gatan Inc. N/A Cryo-EM data collection device (Camera)
Latitude S Software Gatan Inc. Imaging software
Loading station Thermo Fisher Scientific 1130698 EM specimen preparation unit
Talos 200 kV Arctica Thermo Scientific™ N/A Cryo-Electron Microscope
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A EM specimen preparation unit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  3. Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
  4. Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
  5. Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
  9. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  10. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  11. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  12. Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  15. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  16. Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
  17. Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
  18. Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  20. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  21. Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
  22. Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
  23. Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
  24. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
  25. Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
  26. Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
  27. Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
  28. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  29. Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
  30. Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).

Tags

Immunologi og infektion Udgave 173 cryo-EM Latitude-S Enkelt partikelanalyse SARS-CoV-2 Spike-Protein Talos Arctica
Brugervenlig, høj-throughput, og fuldautomatisk dataindsamling software til single-partikel Cryo-elektron Mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, A., P., S., Gulati, S.,… More

Kumar, A., P., S., Gulati, S., Dutta, S. User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62832, doi:10.3791/62832 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter