Summary
두개골 창은 형질전환 마우스에서 생체 내 이미징을 허용하기 위해 유비쿼터스로 구현된 수술 기술이 되었습니다. 이 프로토콜은 두개골 창의 반자동 뼈 드릴링을 수행하고 외과 의사 간 변동성을 줄이고 열 혈액-뇌 장벽 손상을 부분적으로 완화하는 데 도움이 될 수 있는 수술 로봇의 사용을 설명합니다.
Abstract
두개골 창 수술은 다광자 또는 기타 생체 내 이미징 기술을 사용하여 살아있는 마우스의 뇌 조직을 이미징할 수 있습니다. 그러나 손으로 개두술을 시행할 때 뇌 조직에 열 손상이 있는 경우가 많으며, 이는 본질적으로 수술 간에 가변적이며 개별 외과 의사의 기술에 따라 달라질 수 있습니다. 수술 로봇을 구현하면 수술을 표준화하고 수술과 관련된 열 손상을 줄일 수 있습니다. 이 연구에서는 열 손상을 평가하기 위해 수평, 점별 및 펄스 점별로 세 가지 로봇 드릴링 방법을 테스트했습니다. 수평 드릴링은 연속 드릴링 회로도를 사용하는 반면, 포인트별 드릴링은 두개골 창을 둘러싸고 있는 여러 구멍을 뚫습니다. 펄스 포인트별 드릴링 방식은 "2초 켜짐, 2초 꺼짐" 드릴링 방식을 추가하여 드릴링 사이에 냉각을 허용합니다. 정맥 주사된 Evans Blue(EB) 염료의 형광 이미징은 뇌 조직의 손상을 측정하는 반면, 시추 현장 아래에 배치된 열전대는 열 손상을 측정합니다. 열전대 결과는 수평(16.66°C ± 2.08°C) 및 점별(18.69°C ± 1.75°C) 그룹에 비해 펄스 점별(6.90°C ± 1.35°C) 그룹에서 온도 변화가 크게 감소했음을 나타냅니다. 유사하게, 펄스 점별 그룹은 수평 방법에 비해 두개골 창 드릴링 후 EB 존재가 현저히 적어 뇌의 혈관 손상이 적음을 나타냅니다. 따라서, 펄스 점별 드릴링 방법은 열 손상을 감소시키기위한 최적의 방식 인 것으로 보인다. 로봇 드릴은 훈련, 변동성을 최소화하고 열 손상을 줄이는 데 도움이 되는 유용한 도구입니다. 연구실 전반에 걸쳐 다광자 이미징의 사용이 확대됨에 따라 결과의 엄격함과 재현성을 개선하는 것이 중요합니다. 여기에서 다루는 방법은 이러한 수술 로봇을 더 잘 사용하여 현장을 더욱 발전시키는 방법을 다른 사람들에게 알리는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
두개골 창은 신경 과학, 신경 공학 및 생물학 분야 전반에 걸쳐 유비쿼터스로 사용되어 살아있는 동물의 피질을 직접 시각화하고 이미징 할 수 있습니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . 형질전환 마우스와 다광자 이미징의 강력한 조합은 생체 내 뇌 12,13,14,15,16,17,18에서 회로 활동 및 기타 생물학적 통찰력에 대한 매우 귀중한 통찰력을 제공했습니다. 두개골에 장착된 소형 현미경은 이러한 기능을 더욱 확장하여 깨어 있고 자유롭게 움직이는 동물을 기록할 수 있게 해주었다19. 두개골 창을 만드는 과정은 피질20 위에 투명한 유리 조각을 고정하기에 충분히 큰 개두술을 생성하기 위해 두개골 뼈를 얇게 또는 완전히 제거하기 위한 파워 드릴링이 필요합니다. 폴리디메틸실록산(PDMS) 및 기타 폴리머도 두개골 창 재료 9,21로 테스트되었습니다. 궁극적으로, 이상적인 두개골 창은 그 아래의 정상적인 내인성 활동을 변경하거나 방해하지 않는 창입니다. 그러나 두개골 창 드릴링은 기저 조직을 악화시켜 뇌 손상, 환경 파괴 및 다광자 이미징 깊이22를 폐색하는 지점까지 수막에 영향을 미친다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있습니다. 결과적인 신경염증은 혈액-뇌 장벽(BBB)의 투과성에서 임플란트 부위 주변의 신경교 세포의 활성화 및 모집에 이르기까지 광범위한 효과를 갖는다(23). 따라서 보다 안전하고 재현 가능한 두개골 창 드릴링 방법을 특성화하는 것은 일관된 이미징 품질과 교란 요인을 줄이는 데 매우 중요합니다.
밑에 있는 조직에 대한 외상을 최소화하기 위해 주의를 기울이는 동안, 뼈를 뚫는 행위는 뇌에 열적 및 기계적 섭동을 일으킬 가능성이 있습니다24,25. 경막으로의 우발적인 드릴 침투로 인한 기계적 외상은 다양한 정도의 피질 손상을 추가로 유발할 수 있습니다24. Shoffstall et al.25의 연구에서, 뼈 드릴링으로 인한 열은 뇌 실질에 Evans Blue(EB) 염료가 존재하는 것으로 나타난 바와 같이 BBB 투과성을 증가시켰습니다 25. 정맥 주사되는 EB 염료는 혈류에서 순환하는 알부민에 결합하므로 일반적으로 상당한 농도로 건강한 BBB를 통과하지 않습니다. 그 결과, EB 염료는 BBB 투과성26,27의 민감한 마커로 일반적으로 사용됩니다. 그들의 연구는 연구 중인 후속 생물학적 후유증에 대한 BBB 투과성의 영향을 직접 측정하지는 않았지만, 이전 연구에서는 BBB 투과성을 만성적으로 이식된 미세전극에 대한 증가된 신경염증 반응 및 운동 기능의 변화와 연관시켰습니다28.
연구의 목적에 따라 열적 및 기계적 손상의 정도가 실험 오류의 원인이 되어 연구의 엄격함과 재현성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 두개골 창을 생산하기 위해 인용 된 수십 가지 방법이 있으며, 각각 다른 드릴링 장비, 속도, 기술 및 사용자 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11을 사용합니다. Shoffstall et al.25는 관찰된 가열 결과의 변화가 드릴의 가해지는 힘, 이송 속도 및 적용 각도의 변동성에 기인한다고 보고했으며, 이는 손으로 드릴링할 때 제어할 수 없는 다른 측면 중에서도25. 자동화된 드릴링 시스템 및 기타 정체 장비가 재현성과 결과 일관성을 향상시킬 수 있다는 믿음이 있지만 발표된 방법 연구에서는 결과 중 하나로 온도 또는 BBB 투과성을 엄격하게 평가하지 않았습니다. 따라서 두개골 창을 생성하기 위해 보다 재현 가능하고 일관되게 적용되는 방법과 기본 신경 조직에 대한 두개골 창 드릴링의 영향을 평가하기 위해 엄격하게 적용되는 방법이 필요합니다.
이 연구의 초점은 두개골 창에 대한 일관되고 안전한 드릴링 방법을 결정하고 개발하는 것입니다. 두개골 창 설치를 위한 개두술의 크기는 뇌 이식 미세전극을 위한 표준 개두술보다 훨씬 큽니다. 이러한 개두술은 표준 장비를 사용할 때 단일 버 구멍으로 완료할 수 없으며, 따라서 손으로 수행할 때 외과 의사 간 기술 가변성을 더 많이 도입한다(20). 외과 용 드릴링 로봇이 현장에 도입되었지만 널리 채택되지는 않았습니다 1,6,29. 드릴링 자동화는 관찰된 시행 간 변동에 기여하는 변수에 대한 제어를 제공하며, 이는 장비 사용이 외과 간 및 외과 내 효과를 줄일 수 있음을 시사합니다. 이것은 두개골 창 배치에 필요한 더 큰 개두술의 추가 어려움을 감안할 때 특히 중요합니다. 시추 자동화를 통해 제공되는 제어에 분명한 이점이 있다고 가정할 수 있지만 이러한 장비의 구현에 대한 평가는 거의 없습니다. 눈에 보이는 병변은 관찰되지 않았지만5, EB를 이용한 더 높은 민감도 검사가 요구된다.
여기에서 BBB 투과성은 시중에서 판매되는 수술용 드릴링 로봇과 해당 소프트웨어를 사용하여 측정되며, 이를 통해 정위 좌표, 개두술 계획/매핑 및 드릴 비트의 라우팅 경로를 참조하는 드릴링 스타일 선택("포인트별" 대 "수평")을 프로그래밍할 수 있습니다. 처음에는 8 개의 "시드"지점이 뚫려 (그림 1A) 두개골 창을 설명합니다. 여기에서 씨앗 사이의 공간은 "점별" 또는 "수평" 드릴 방법을 사용하여 잘라냅니다. "Point-by-point"는 수직 파일럿 구멍 절단(CNC 드릴 프레스와 유사)을 수행하는 반면 "수평"은 구멍의 윤곽을 그리는 두개골 창 둘레를 따라 수평 절단을 수행합니다(CNC 라우터와 유사). 두 방법 모두 두개골 창을 드러내기 위해 제거할 수 있는 두개골 조각입니다. 드릴링으로 인한 손상을 분리하기 위해 두개골 창은 추가 손상을 방지하기 위해 물리적으로 제거되지 않습니다. 생쥐에서 개두술을 시행한 후 BBB 투과성을 측정하기 위해 형광 이미징과 결합된 EB 염료의 조합을 사용하고, 삽입된 열전대를 사용하여 드릴링 중 뇌 표면의 온도를 직접 측정합니다(그림 1B,C). 이전의 관찰은 2초 간격으로 펄스 드릴링 온/오프가 드릴 가열을 완화시키기에 충분하다는 것을 나타내었다(25), 따라서 수술 로봇에 대한 실험적 접근법에 통합되었다.
제시된 작업의 목적은 개두술 드릴링으로 인한 열 손상을 평가하는 방법을 시연하는 것입니다. 방법은 자동 드릴링의 맥락에서 제시되지만 이러한 방법은 수동 드릴링 방식에도 적용될 수 있습니다. 이러한 방법은 표준 절차로 채택하기 전에 장비 및/또는 드릴링 계획의 사용을 검증하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1: 실험적 파이프라인 회로도. EB 정량화 후 두개골 창 절차를 위해 동물이 겪은 과정을 보여주는 개략도. (A) 정위 프레임과 수술 로봇 드릴을 사용한 마우스의 개략도 설정. 두개골 창의 예는 시드 포인트(녹색)와 가장자리 포인트(파란색)가 있는 운동 피질 위에 표시됩니다. (B) 관류 설정에는 동물 전체에 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 주입하여 혈액을 제거한 다음 뇌를 추출하는 것이 포함됩니다. (C) 그런 다음 뇌를 EB 형광 이미징 시스템 챔버에 넣어 Evans Blue 염료에 대한 형광 이미징을 수행합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
모든 절차와 동물 관리 관행은 Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee에 따라 검토, 승인 및 수행되었습니다.
1. 수술 로봇 하드웨어 설정
- 수술 전에 수술 로봇( 재료 표 참조) 설명서와 가이드에 따라 하드웨어와 소프트웨어를 설정하십시오. 설명서에 설명된 대로 프레임 보정을 수행합니다. 드릴이나 프레임이 움직이는 경우 정확도를 보장하기 위해 드릴을 재보정하는 것이 좋습니다.
2. 소프트웨어 준비
- 수술 소프트웨어( 재료 표 참조)로 이동하고 깨끗한 프로젝트로 시작을 선택하여 새 프로젝트를 만듭니다. 피사체를 위쪽의 마우스(Mouse )로 설정하여 사용할 드릴링 좌표를 지정합니다.
- 새 프로젝트 시작을 선택합니다.
- 여기에서 왼쪽 하단 모서리에 있는 계획(Planning)을 클릭하여 드릴링 좌표 계획 화면으로 이동합니다. 수행할 두개골 창 기술에 대한 드릴링 계획을 만듭니다.
- 이렇게 하려면 스테레오택시 아틀라스의 아무 곳이나 클릭합니다. Bregma를 참조로 사용하고 운동 피질에 대해 AP = 1.50, ML = 1.25, DV = 0.00 좌표를 입력합니다. 키보드에서 Enter 키를 눌러 선택한 좌표를 업데이트합니다.
참고: DV(Dorsal-Ventral) 좌표는 드릴링 깊이를 나타내므로 여기에 입력할 필요가 없습니다. - Store Target(대상 저장)을 클릭하여 이러한 좌표를 저장하고 적절한 이름을 입력합니다. 여기에서 왼쪽 하단의 이동 버튼을 클릭하여 기본 드릴링 화면으로 다시 이동합니다.
- 이렇게 하려면 스테레오택시 아틀라스의 아무 곳이나 클릭합니다. Bregma를 참조로 사용하고 운동 피질에 대해 AP = 1.50, ML = 1.25, DV = 0.00 좌표를 입력합니다. 키보드에서 Enter 키를 눌러 선택한 좌표를 업데이트합니다.
- 도구 > 프로젝트 > 다른 이름으로 저장을 클릭하여 이후 프로젝트에 이 템플릿 프로젝트를 다시 사용할 수 있습니다. 이렇게 하면 나중에 사용할 수 있도록 드릴링 좌표가 자동으로 유지됩니다.
3. 수술 준비
- PrismPlus 마우스30,31(재료 표 참조)을 이소플루란 챔버(1.5L/minO2에서 3.5%)를 마취합니다. 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 윤활제를 바르고, 가위로 머리를 면도하고, 쥐가 봉합사를 긁지 않도록 손톱을 다듬습니다.
참고: PrismPlus 마우스는 다광자 이미징에 사용되는 형질전환 형광 종의 일종입니다. 이형접합체 PrismPlus 마우스는 형광 유전자가 부족하여 진행 중인 다른 연구에서 동물 배설물을 줄이기 위해 여기에서 사용되었으며 이 연구에는 다광자 이미징이 없기 때문입니다. 야생형 마우스도 비슷한 결과를 보일 것으로 예상됩니다. - 마취된 마우스에 항생제 세파졸린(24mg/kg), 진통제 카르프로펜(5mg/kg) 및 부프레노르핀(0.05-0.10mg/kg)을 피하 주사합니다. 절개 전에 절개 부위 아래(눈 뒤에서 시작하여 두개골 정중선을 따라 1인치) 아래에 마르카인(0.25%, 100μL)을 1회 피하 주사합니다.
참고: 여기에 사용된 약물은 이전에 확립된 IACUC 프로토콜을 따릅니다. 그러나 EMLA 크림을 수술 전 다중 모드 효과를 위한 국소 마취제로 고려하고 꼬리 정맥 주사 및 Carprofen 대신 Meloxicam SR을 고려하는 것이 좋습니다. EMLA 및 Meloxicam SR은 이소플루란 마취 전에 제공될 수 있습니다. - 제공된 이어바를 사용하여 수술 로봇 정위 프레임에 동물을 장착하고 코 콘을 통한 흡입 을 통해 0.5%-2% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
- 마우스의 반응성, 호흡(~55-65 호흡/분), 심박수(300-450bpm) 및 색상(분홍색)을 기반으로 숙련된 수의사 또는 직원이 마취 깊이를 면밀히 모니터링하도록 합니다. 수염과 규칙적인 발가락 꼬집음도 마취 깊이를 결정하는 척도로 사용할 수 있습니다. 바이탈의 가치는 기관 IACUC 규정에 의해 결정됩니다.
- 순환하는 물 패드에서 동물의 체온을 유지하고 혈중 산소 및 심박수 측정 시스템을 사용하여 바이탈을 모니터링합니다.
- 멸균을 위해 클로르헥시딘 글루코네이트(CHG)와 70% 이소프로판올로 수술 부위를 문지릅니다. 수술 중 무균 상태를 유지하려면 마우스와 정위 프레임 위에 멸균 플라스틱 랩을 씌우십시오.
참고: 이러한 프로토콜은 생존 수술을 위해 개발되었지만 제시된 데이터는 적절한 드릴링 프로토콜 방법을 테스트하고 결정하는 데 중점을 두었기 때문에 비생존 동물의 사용을 반영합니다.
4. 두개골 준비
- 메스 칼날을 사용하여 눈 뒤쪽에서 시작하여 두개골의 정중선을 1인치 절개합니다.
- 피부를 뒤로 당겨 두개골을 노출시키고 (선택 사항) 견인기를 사용하여 수술 창을 유지합니다. 멸균된 면봉 어플리케이터를 사용하여 잔여 조직과 멤브레인을 제거합니다.
- 끝이 솜이 달린 어플리케이터와 함께 3% 과산화수소를 사용하여 두개골을 건조시키고 청소합니다.
알림: 이렇게 하면 두개골의 봉합사가 보입니다. 브레그마와 람다는 쉽게 볼 수 있어야 합니다. 그렇지 않은 경우 과산화수소를 더 많이 바르거나 절개 부위의 크기를 늘리십시오. - 제조업체의 권장 사항에 따라 수술 로봇 드릴링 설정의 악어 클립 케이블을 마우스에 연결하여 "자동 중지" 기능을 허용합니다. "자동 정지"는 임피던스의 변화를 감지하여 작동하므로 드릴 비트가 뼈 대신 뇌척수액(CSF)에 접촉하면 드릴이 드릴링을 중지하여 뇌 손상을 방지합니다.
5. 에반스 블루 꼬리 정맥 주사
주의: EB는 발암 가능성이 있는 물질입니다. 취급 시 장갑을 사용하십시오.
- 쉽게 주사 할 수 있도록 꼬리를 준비하려면 알코올 물티슈로 닦으십시오. 임의로, 윈터그린 오일은 정맥을 확장시키기 위해 국소적으로 적용될 수 있다(35).
- 한 손으로는 꼬리를 잡고 다른 한 손에는 EB가 들어 있는 주사기를 만집니다. 엄지와 집게 손가락을 사용하여 꼬리를 구부려 꼬리의 구부러진 부분 위에 꼬리 정맥을 노출시킵니다. 주사기(1 또는 2mL, 인슐린 주사기, 30G)를 정맥과 평행하게 삽입하고 EB 부피를 천천히 주입합니다. EB(4% w/v)는 꼬리 정맥 주사를 통해 2mL/kg 체중의 농도로 투여됩니다.
알림: 바늘이 올바르게 삽입되면 주사기에서 꼬리로 흐르는 저항이 최소화되거나 전혀 느껴지지 않습니다. 꼬리에 저항이 있거나 EB 염료가 나타나면 꼬리를 아래로 내리고 다시 시도하십시오. - 주입이 완료되면 드릴링이 시작되기 전에 EB가 마우스 전체를 순환할 수 있도록 5분 동안 기다립니다. 성공적인 주사는 마우스의 사지와 수술 창이 파란색으로 바뀌면 즉시 확인됩니다.
6. 외과 로봇 드릴링 절차
- 두개골을 드릴링할 준비가 되면 수술 소프트웨어로 다시 이동합니다. 드릴링 좌표가 지정된 2.4단계에서 정의한 템플릿 프로젝트를 엽니다.
- 도구 > 프로젝트 > 새 > 템플릿 프로젝트 선택 에 따라 2단계(소프트웨어 준비)에서 지정한 템플릿 프로젝트를 선택합니다.
- 계획(목표 지점) > 드릴 매개변수 > 동일한 프로토콜 요소를 선택하여 이 새 프로젝트로 이월합니다.
- 새 프로젝트 시작을 클릭합니다.
- 다음으로, 현재 동물의 마우스 두개골의 기울기와 스케일링을 고려하여 드릴과 프레임을 수정합니다. 도구(Tools )를 클릭하고 기울기 및 배율 조정에 대한 수정(Correct for Tilt and Scaling... )을 선택하여 수정 화면을 엽니다. 화면 상단에서 연한 빨간색 드릴 버튼을 클릭하여 드릴 이 활성 상태인지 확인합니다(주사기가 아님).
알림: 활성화되면 드릴 버튼이 어둡거나 밝은 빨간색으로 바뀝니다. 주사기 버튼은 이 프로토콜에서 사용되지 않으므로 무시할 수 있습니다.- 먼저 현재 동물에서 Bregma와 Lambda가 있는 위치를 설정하여 Scale, Pitch 및 Yaw를 수정합니다. 키보드 컨트롤 또는 화면 컨트롤을 사용하여 드릴 비트를 이동합니다. 드릴 비트가 Bregma 위에 위치하면 두개골에 닿을 때까지 낮추고 Set Bregma를 클릭합니다. Lambda에 대해 이 작업을 반복합니다.
- 다음으로 두개골의 특정 롤에 맞게 조정합니다. 중간점으로 이동(Go to Midpoint ) 버튼을 클릭하여 드릴 비트를 두개골 중앙에 맞게 자동으로 조정합니다. 왼쪽으로 2mm 를 클릭한 다음 두개골에 닿을 때까지 드릴 비트를 천천히 내립니다. 왼쪽 점 설정을 클릭합니다.
- 뇌의 오른쪽에 대해 6.2.2 단계를 반복하십시오. 이제 이 특정 두개골에 대한 시스템이 설정되었습니다.
알림: 여기서 수정은 적절한 드릴링 좌표와 깊이를 보장하는 데 중요합니다. 마우스는 가능한 한 직선에 가깝게 장착하여 수정의 필요성을 최대한 줄여야 합니다. 큰 수정이 필요한 경우 드릴링의 정확도가 떨어질 수 있습니다.
- 수정이 수행된 후 을 클릭하여 수정 창을 종료합니다. 닫다 화면 하단 중앙에 있습니다. 를 클릭하여 드릴링 화면으로 이동합니다. 도구 그런 다음 훈련... 드릴링 절차를 시작합니다.
- 화면 상단의 드릴 드롭다운에서 Craniotomy-Shape가 선택되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 드릴 중심 및 형상 선택을 클릭하고 2.3.1단계에서 명명된 사전 정의된 대상을 선택합니다. 이 화면에서 대상 모양으로 원을 선택하고 원의 지름2.60로 2mm를 입력합니다. 표시를 클릭합니다.
알림: 두개골 창의 지름은 드릴 비트의 중심을 시드 포인트의 중심으로 사용하여 생성됩니다. 작은 드릴 비트(직경 = 0.6mm 또는 공급업체에서 제공하는 권장 비트 크기)는 더 큰 드릴 비트를 사용하여 추가되는 추가 직경을 최소화하는 데 사용됩니다. 특수 드릴 비트는 수술 로봇을 위해 특별히 사용됩니다. 이제 8개의 시드 포인트와 엣지 포인트가 두개골에 각각 녹색과 파란색 점으로 표시됩니다. - 메인 창을 클릭하고 키보드 단축키 Control + Shift + D 를 사용하여 화면 오른쪽에 드릴 포인트 메뉴를 불러옵니다. 이를 통해 특정 드릴 점 깊이와 상태를 볼 수 있습니다.
- 드릴링을 시작하기 전에 필요한 경우 자동 중지(Auto-Stop) 확인란 옆에 있는 버튼을 클릭하여 자동 정지 기능을 사용자 정의합니다. 이 버튼의 기본값은 자동 정지 기능의 감도에 해당하는 중간입니다.
참고: 동물에게 적합한 감도를 찾기 위해 미리 테스트할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 뇌를 통한 드릴링을 최소화하기 위해 가장 높은 감도가 사용되었습니다. - 자동 정지 기능이 활성화되고 사용자 지정되면 시드 포인트의 드릴링을 시작합니다. 자동 스캔(Auto Scan )을 클릭하여 드릴이 시드 1에서 자동으로 시작되도록 합니다. 드릴 비트가 CSF에 닿으면 자동 정지 기능이 임피던스의 변화를 감지하여 드릴링이 중단되고 두개골에서 비트가 후퇴합니다.
- 자동 정지가 변경 사항을 감지하지 못하는 경우 드릴링을 면밀히 주시하십시오. Esc 키를 눌러 드릴링을 수동으로 취소할 수 있습니다. 드릴(Drill) 메뉴의 아래쪽과 임피던스 값 오른쪽에 있는 분홍색 원을 클릭하여 드릴링을 시작하거나 중지할 수도 있습니다.
알림: 드릴 비트는 예상 두개골 두께와 동일한 깊이까지 자동으로 드릴링됩니다(또는 자동 정지 기능이 활성화될 때까지). - 예상 깊이에 도달하기 전에 자동 정지가 활성화되지 않으면 사용자에게 1) 드릴링 및 하강 # mm 계속, 2) 현재 깊이를 표시하고 계속, 3) 현재 지점을 건너뛰고 계속, 또는 4) 프로세스 중지(나중에 계속할 수 있음)를 묻는 화면이 나타납니다. 아래 설명된 대로 옵션 중 하나를 선택합니다.
- 드릴링 및 하강 # mm 계속에 드릴이 전진할 거리를 입력합니다. 기본적으로 0.1mm가 사용됩니다. 우발적인 뇌 침투를 방지하기 위해 더 작은 거리가 제안될 수 있습니다.
- 이 화면에서 경막에 도달했다고 생각되면 시스템이 해당 수심에서 경막을 표시하고 다음 시드로 이동하도록 현재 수심에서 표시 및 계속 옵션을 선택합니다.
- 현재 포인트 건너뛰기 및 계속 및 프로세스 중지(나중에 계속할 수 있음)를 사용하여 드릴 비트의 문제를 해결하거나 정리하고 자동 중지가 다시 작동하면 돌아옵니다.
- 모든 시드 포인트가 드릴링된 후 자동 정지 기능을 사용하여 완료되지 않은 시드 포인트가 있는 경우 경질 픽을 사용하여 구멍의 깊이를 수동으로 확인합니다. 이렇게 하면 뚫린 깊이가 두개골을 관통하게 됩니다.
- 모서리 점 드릴링을 시작하기 전에 드릴(Drill) 메뉴의 모서리 컷(Edge-Cut) 텍스트 옆에 있는 드롭다운을 선택하여 원하는 ' 모서리 컷(edge-cut) ' 유형을 결정합니다. 두 가지 옵션은 Point-by-Point 및 Horizontally입니다.
- 점별(Point-by-Point)을 선택하여 각 모서리 점을 개별적으로 드릴하고 인접한 근원점 깊이에 따라 결정되는 깊이로 드릴합니다. 필요한 경우 아래의 Edge Scaling...(Edge Scaling...) 버튼을 통해 배율(scaling)을 조정하지만 일반적으로 기본값인 배율 없음(No Scaling)이면 충분합니다.
- 수평(Horizontally)을 선택하여 모서리 점 1에서 드릴링을 시작하고 연속 드릴링 동작을 사용하여 드릴링 원의 전체 둘레를 이동합니다. 기본적으로 수평 절단은 100μm 간격으로 절단되어 창 둘레를 완전히 돌고 100μm 더 깊이 전진합니다. 필요한 경우 아래의 절단 옵션... 버튼에서 간격 깊이와 드릴 속도를 변경합니다.
- 자동 컷 오프셋(모서리 컷 상자 아래)을 사용하여 인접한 시드 점에서 미리 결정된 오프셋 을 가져와 자동 컷 깊이를 조정합니다. 이 프로토콜에서는 20μm의 자동 절단 오프셋이 사용되었습니다. 동물별로 최적의 오프셋을 결정하기 위해 추가 테스트를 수행할 수 있습니다.
- 모서리 컷 설정이 결정되면 드릴(Drill) 메뉴 중간에 있는 자동 절단(Auto Cut ) 버튼을 클릭하여 모서리 점 드릴링을 시작합니다. 점별 드릴링의 경우 마지막 모서리를 드릴링하면 드릴링 절차가 완료됩니다. 수평 드릴링의 경우 두개골 창을 해제하기에 충분한 두개골이 뚫릴 때까지 계속하십시오.
참고: 창을 풀 수 있을 때까지 드릴링을 수행하지만 내부 조직의 손상을 방지하기 위해 창을 물리적으로 해제하지 않습니다. 다양한 드릴링 회로도를 평가하기 위해 드릴링의 결과로 인한 손상을 분리하는 것이 중요합니다.- 수평 드릴링이 한 근원 점의 깊이에 도달하면 드릴 점(Drill Points) 메뉴에서 해당 근원을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하거나 먼저 여러 점을 선택하고 깊이 잠금(Lock Depth)을 클릭합니다. 이렇게 하면 해당 영역을 더 깊게 절단하지 않고도 수평 절단을 계속할 수 있습니다(따라서 뇌를 관통하는 것을 방지).
알림: 경질 깊이가 다른 시드 포인트가 있는 경우 수평 드릴링 절차에 필요한 깊이에 차이가 발생할 수 있습니다.
- 수평 드릴링이 한 근원 점의 깊이에 도달하면 드릴 점(Drill Points) 메뉴에서 해당 근원을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하거나 먼저 여러 점을 선택하고 깊이 잠금(Lock Depth)을 클릭합니다. 이렇게 하면 해당 영역을 더 깊게 절단하지 않고도 수평 절단을 계속할 수 있습니다(따라서 뇌를 관통하는 것을 방지).
- 자동 정지 기능이 제대로 작동하지 않으면 비트의 베이스 임피던스에 영향을 줄 수 있는 파편이나 잠재적인 혈액, 식염수 등이 드릴 비트에 완전히 없는지 확인하십시오. 또한 자동 정지가 일관되게 작동하지 않는 경우 아래에 설명된 여러 수동 드릴링 옵션 중 하나를 선택하십시오.
- 드릴(Drill) 메뉴에서 시드 또는 에지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 항목으로 이동(Go to Entry)을 선택하여 각 시드로 수동으로 이동합니다. 표시된 깊이를 지우고, 구멍을 재설정하고, 드릴링 절차를 지원할 수 있는 기타 옵션도 있습니다.
- 드릴(Drill) 메뉴 상단의 전진( Advance): 텍스트 옆에 있는 드롭다운에서 깊이를 선택하여 드릴 깊이 전진을 수동으로 제어합니다. 바로 아래에 있는 전진 버튼을 클릭하여 드릴을 설정된 거리만큼 전진 시킵니다.
알림: 이 기능은 Advance 버튼 아래의 Set Dura 및 Set Surface 버튼과 함께 사용하여 두개골 표면과 경막의 위치를 시스템에 수동으로 알릴 수 있습니다. 가능하면 자동 정지 기능을 사용하되 필요한 경우 이러한 수동 옵션으로도 충분합니다. - 수동으로 드릴링하는 경우 드릴이 경막을 초과하지 않도록 각 드릴링 깊이 간격 사이에 더 많은 주의를 기울이십시오. 깊이 간격 사이에 경막 픽을 사용하여 천공된 구멍을 확인하여 경막에 도달했는지 확인합니다. 모든 수동 시드 드릴링이 완료되면 위에서 설명한 대로 가장자리 절단 절차를 정상적으로 계속합니다.
- 펄스 방식
- 수동 펄스 드릴링을 수행하려면 드릴(Drill) 메뉴에서 자동 정지( Auto-Stop) 옵션 옆의 확인란을 선택 취소하여 자동 정지 기능을 끕니다. 펄싱을 위해 드릴이 꺼져 있을 때를 제어할 수 있도록 이 기능을 꺼야 합니다.
알림: 펄스 드릴링은 두개골이 식을 수 있도록 2초의 드릴링 패턴과 2초의 드릴링 없음 패턴을 따릅니다. - 드릴 메뉴에서 드릴 깊이 진행으로 100μm를 선택하면 ~2초의 하향 드릴링과 같습니다.
- 준비가 되면 전진 을 클릭하여 드릴링을 시작합니다.
알림: 드릴이 100μm 전진하면 드릴이 탈출구를 누를 때까지 깊이에서 계속 회전하므로 드릴 을 빠르게 멈출 준비를 하십시오(불필요한 열 발생). - 드릴이 100μm 전진하면 Escape 를 두 번 눌러 드릴을 중지합니다. 2초 후 두개골의 깊이에 대해 이 주기를 반복합니다.
참고: point-by-point 방법만 소프트웨어 및 기계적 제약으로 인해 펄스 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다. 연속 수평 드릴링은 이러한 방식으로 수행할 수 없습니다. - 위에서 설명한 이 방법을 사용하여 모든 시드 및 에지 포인트를 드릴링합니다. 경막에 도달하면 Drill 메뉴의 버튼을 사용하여 Dura를 설정해야 합니다.
- 수동 펄스 드릴링을 수행하려면 드릴(Drill) 메뉴에서 자동 정지( Auto-Stop) 옵션 옆의 확인란을 선택 취소하여 자동 정지 기능을 끕니다. 펄싱을 위해 드릴이 꺼져 있을 때를 제어할 수 있도록 이 기능을 꺼야 합니다.
- 화면 상단의 드릴 드롭다운에서 Craniotomy-Shape가 선택되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 드릴 중심 및 형상 선택을 클릭하고 2.3.1단계에서 명명된 사전 정의된 대상을 선택합니다. 이 화면에서 대상 모양으로 원을 선택하고 원의 지름2.60로 2mm를 입력합니다. 표시를 클릭합니다.
7. 관류 및 뇌 추출
- 종자와 가장자리 지점의 드릴링이 완료되면 EB 염료가 손상된 BBB를 통해 순환하고 유출될 수 있도록 동물을 추가로 1시간 동안 이소플루란 마취 하에 두십시오. 심장 관류를 수행하여 혈관에서 혈액이나 체액을 제거한 다음 아래에 설명된 대로 이미징 및 분석을 위해 뇌를 제거합니다.
- 두개골 창 생성 후 1시간 EB 순환 기간 후 케타민(160mg/kg)과 자일라진(20mg/kg) 칵테일을 동물에게 복강 주사합니다. 반응이 없으면 심장 관류를 수행하십시오.
- 가위를 사용하여 마우스의 복부를 절단하고 흉곽을 수직으로 절단하고 횡격막을 가로질러 수평으로 절단하여 심장을 노출시킵니다. 흉곽을 수축시켜 심장을 선명하게 봅니다. 나비 바늘을 심장의 좌심실에 삽입하고 몸 전체에 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 주입하기 시작합니다. 심장 우심방의 작은 부분을 잘라내어 축적된 압력을 해제합니다.
- 25mL의 1x PBS가 몸 전체에 관류된 후 관류를 중단하고 안락사의 2차 수단으로 마우스를 참수합니다.
참고: 동물이 뇌를 분리할 수 있도록 제도적으로 승인된 안락사 및/또는 종점 관류 방법을 수행해야 합니다. - 여기에서 rongeurs로 뼈와 조직을 제거하여 두개골에서 뇌를 추출합니다.
- 추출된 뇌를 형광 이미징 시스템으로 영상화하여 시추 부위 주변의 뇌에 위치한 EB의 양을 관찰합니다.
참고: EB는 순환하는 알부민에 결합합니다. 뇌에서 혈관 손상이 발생하면 EB가 누출되어 뇌 조직에 결합하여 손상의 명확한 시각적 지표로 이어집니다.
8. Evans Blue 이미징 및 분석
- 하드웨어 초기화
- EB 형광 이미징 시스템에 연결된 컴퓨터를 켜고 다른 품목이 준비되는 동안 이미징 소프트웨어( 재료 표 참조)를 시작합니다. 광원, 플랫폼, 카메라를 순서대로 켭니다.
- 이미징 소프트웨어로 이동하고 Acquisition Control Panel(수집 제어판)에서 Initialize(초기화)를 클릭합니다. 시스템과 챔버는 초기화가 완료되는 즉시 빨간색에서 녹색으로 신호를 보냅니다.
알림: 이미징 30분 전에 EB 형광 이미징 시스템을 초기화하여 광원의 온도가 최적 수준에 도달할 수 있도록 합니다.
- 뇌의 영상
- 이미징을 위해 무대 중앙의 투명한 접시에 이식 된 뇌를 놓습니다.
- 획득 제어판에서 이미지 설정을 조정합니다. 노출 시간 선택: 1초; 비닝: 중간; F/스톱: F1; 여기: 535 내지 675 nm; 방출: Cy 5.5; 램프 레벨: 높음; 및 FOV: 5cm. 필터를 잠그고 사진과 형광의 오버레이를 확인한 상태로 두십시오. 이러한 설정은 이전 실험실 경험 및 EB36 이미징의 다른 공개된 방법을 기반으로 합니다.
- EB 형광 이미징 시스템 이미지를 오픈 액세스 이미지 처리 소프트웨어( 재료 표 참조)에 로드하고 배경, 전체 뇌 및 두개골 창에 대한 평균 광도를 측정하여 EB의 형광 강도를 찾기 위해 3개의 자유 관심 영역(ROI)을 생성합니다.
- 해당 배경 ROI에 대해 두개골 창과 전체 뇌 측정을 정규화합니다.
- 각 뇌를 상이한 여기 필터(535-675 nm) 하에서 영상화하여 식염수 대조군에 대한 실험군 간의 신호 대 잡음비(605 nm)가 가장 높은 파장을 선택하였다.
- 적절한 파장 및 평균에서 평균 광도를 분리하여 전체 뇌 및 두개골 창 ROI에 대한 평균 평균 광도 또는 형광 강도를 구합니다.
- 식염수 대조군에 대한 각 그룹의 두개골 창 영역에 대한 평균 평균 광도를 찾아 정규화합니다.
9. 열전대 평가
- 두개골과 뇌의 온도 변화를 열전대( 재료 표 참조)와 세 가지 다른 드릴링 방식과 함께 측정합니다. 열전대는 데이터 수집 시스템(DAQ)에 연결되어 측정값을 MATLAB으로 읽을 수 있습니다.
- 시체 마우스를 스테티탁식 프레임과 로봇 드릴 설정에 장착합니다. 두개골 창이 두개골2의 측면으로 만들어질 위치에서 ~25mm 떨어진 곳에 작은 구멍(시드 포인트와 동일한 크기)을 수동으로 뚫습니다. 이 구멍을 통해 열전대가 두개골 창 드릴링이 발생하는 위치로 미끄러질 수 있습니다(그림 2D).
참고: 두개골 창 드릴링 영역 위로 열전대를 밀어 넣으려면 두개골 측면을 드릴링해야 하기 때문에 사체 마우스가 사용됩니다. 이 사체 마우스는 이전에 에반스 블루 분석에 사용된 것과는 다른 동물입니다. - 앞에서 수행한 대로 세 가지 계획 각각에 대한 드릴링 프로세스를 시작합니다(6단계). 드릴이 두개골을 통과함에 따라 온도 변화가 급증하여 뇌 근처에서 열이 발생함을 나타냅니다.
- MATLAB에서 결과를 기록하고 플로팅하여 최대 온도 차이를 계산합니다. 이것은 펄스 수동 드릴링 방법과 함께 수평 대 점별 드릴링을 평가하기 위해 시드 드릴링과 에지 드릴링을 위해 별도로 수행해야 합니다.
10. 통계
- Benjamini-Hochberg 보정과 함께 Kruskal-Wallis 순위 합계 테스트를 사용하여 R에서 열전대 및 EB 형광 이미징에 대한 통계 분석을 수행한 후 Wilcoxon 순위 합계 정확 테스트25를 사용하여 쌍별 비교를 수행합니다.
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Representative Results
열 평가
열 손상 가능성은 수평(그림 2A), 점별(그림 2B) 및 펄스 점별(그림 2C) 방법을 사용하여 드릴링으로 인한 기준선으로부터의 온도 변화를 측정하여 평가되었습니다. 그림 2D는 열 데이터를 얻기 위한 실험 설정을 보여줍니다. 열 평가를 위해 N = 4개의 두개골 창의 샘플 크기가 사용되었습니다. 수평 및 점별 시드 드릴링 회로도는 동일한 시드 드릴링 회로도를 사용하지만 모서리 점을 절단하는 방법에 따라 다릅니다. Pulsed point-by-point는 시드 및 에지 드릴링 부분 모두에 대해 펄스 방법을 사용합니다. 수평 방법의 경우, 시드 드릴링은 16.66 °C ± 2.08 °C의 최대 온도 변화를 보인 반면, 에지 드릴링은 9.08 °C ± 0.37 °C를 보였다. point-by-point 방법의 경우, 종자 시추는 18.69°C ± 1.75°C의 최대 온도 변화를 보인 반면, 에지 시추는 8.53°C ± 0.36°C를 보였다. 펄스 점별 방법의 경우 시드 드릴링은 6.90°C ± 1.35°C의 최대 온도 변화를 보인 반면 에지 드릴링은 4.10°C ± 0.51°C를 보였습니다. 수평 드릴링 방식과 점별 드릴링 방식 모두 열 변화에 대해 유의하지 않은 차이를 보여줍니다. 그러나 펄스 점별 방법으로 변경하면 수평 및 점별 드릴링보다 뇌의 가열(p < 0.05)이 훨씬 적습니다(그림 2E, F). 수술 기간도 기록되었는데, 이는 생체 수술에 대한 동물 생존 가능성에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 두 가지 자동화 방법 모두 종자 시추에 평균 360초가 걸렸습니다. 수평 모서리 드릴링에는 300초가 걸렸고 점별 모서리 드릴링에는 200초가 걸렸습니다. 펄스 방법은 가장 오래 걸렸으며 시드 및 에지 드릴링은 각각 약 500초가 걸렸습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 차이는 수술이 일반적으로 2-3시간 이상 지속될 수 있기 때문에 고려할 만큼 충분히 크지 않습니다.
그림 2: 열 평가. 열 손상 가능성은 드릴링 방법의 결과로 뇌의 최대 온도 변화를 기반으로 평가되었습니다. (A) 수평 드릴링과 (B) 점별 드릴링은 비슷한 양의 열을 발생시키는 반면, (C) 펄스 2초 켜기, 지점 별 2초 끄기 방법은 최소한의 가열을 나타냈습니다. (E) 시드 드릴링 및 (F) 에지 드릴링은 펄스 점별 드릴링 방법에서 열 변화가 현저히 적었습니다(조건당 p < 0.05, N = 4). (D) 열전대는 드릴링이 수행되는 마우스 시체의 두개골 아래에 배치됩니다. 데이터는 DAQ를 통해 수집되고 분석을 위해 컴퓨터에 공급됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
혈관 손상
도 3 은 천공 방식과 혈관 손상 사이의 관계를 나타낸다. 표 1 은 단계 10에 표시된 바와 같이 통계 분석 후 각 타공 방식에 대한 p-값을 나타냅니다. 그룹당 N=4의 샘플 크기를 EB 염료 평가에 사용했습니다. 더 많은 양의 EB의 존재는 BBB 손상의 직접적인 지표이며, 그 중 점별, 수평 및 펄스 드릴링 방법은 대조군보다 훨씬 큽니다(모두 p = 0.043; 표 1). point-by point 방법은 수평 타공과 비교하여 EB 존재 측면에서 유의한 차이를 나타내지 않습니다(p=0.411). 이 두 가지 계획 모두 뇌에 구멍을 뚫는 것을 방지하기 위해 자동 정지 기능을 사용했습니다. 그러나 이 자동 정지 기능은 종종 손상을 방지하지 못했습니다. 공유 시드 시추 부분의 자동 정지 실패로 인해 알 수 없는 과도한 손상이 발생하여 기술 간의 차별화가 복잡해질 수 있습니다. 따라서 자동 정지를 통합하지 않고 다른 두 가지 방법을 평가하기 위해 자동 정지가 없는 펄스 점별 방법에 대한 쌍별 비교가 수행되었습니다. 펄스 점별(p=0.486)과 비교했을 때 유의한 차이가 없었지만, 펄스 점별법은 수평 방법(p=0.043)보다 EB 존재가 유의하게 적었습니다. 펄스 점별 방법과 점점 별 방법 간의 유의성이 없는 것은 점별 드릴링의 큰 변동에 기인할 수 있습니다(그림 4).
그림 3은 적절한 자동 정지 기능이 있는 수평(그림 3C) 및 점별(그림 3D) 드릴링의 대표 이미지를 보여줍니다. 육안으로, 그리고 EB 형광 이미징을 통해 점별 및 수평 절단을 통한 드릴링은 대조군에 비해 뇌의 맥관 구조를 손상시키는 것으로 나타났습니다(그림 3A, B). 펄스 점별 방법(그림 3E)은 종자 및 가장자리 지점에서 국부적 손상이 적었지만 여전히 두개골 창 내에서 눈에 띄는 EB 존재가 있었습니다.
그림 3: 혈관 손상. 이식된 뇌의 EB 형광 이미지(1) 및 해당 ROI(2)는 두개골 창 개두술의 영향을 받는 영역의 평균 방사도를 결정하는 데 사용됩니다. (A) 뇌 혈관계에서 기준선 배경 EB 존재를 획득하기 위해 두개골 창 수술 없이 EB를 마우스에 주사했습니다. (B) 마우스에 식염수만 주입하고 두개골 창 개두술을 시행하였다. 이것은 측정되는 평균 광도가 두개골 창 부위 근처의 혈관 누출 및 혈관 외상으로 인한 EB 축적에 기인한다는 것을 입증했습니다. (C) 마우스에 EB를 주입하고 자동 드릴링의 수평 방법으로 두개골 창을 만들었습니다. (D) 마우스에 EB를 주입하고 자동 드릴링의 점별 방법으로 두개골 창을 만들었습니다. (E) 마우스(n=2)에 EB를 주입한 후 드릴링의 점별 펄스 방법으로 생성된 두개골 창의 두 가지 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
손상의 육안 검사
뇌를 육안으로 검사하면 뇌 표면에 물리적 손상이 있음을 알 수 있습니다(그림 4). 패널 A-D는 수평 드릴링의 EB 존재를 보여주고, 패널 E-H는 점별 방법을, 패널 I-L은 펄스 점별 방법을 보여줍니다. "Point-by-point"는 수직 파일럿 구멍 절단을 수행하고 "수평"은 구멍의 윤곽을 그리는 두개골 창 둘레를 따라 수평 절단을 수행합니다. "펄스 포인트별"은 자동 정지 기능을 사용하지 않고 포인트별과 동일한 방법을 사용하며, 사용자가 설정된 깊이 증분에서 드릴링을 중지하는 것에 따라 다릅니다. 뇌에 대한 열 손상의 양을 최소화하는 방법이 발견되었지만 드릴로 인한 기계적 손상 문제는 여전히 남아 있습니다. 이상적으로는 뇌척수액을 감지하고 뇌 조직을 손상시키기 전에 드릴링을 중지하는 자동 정지 기능이 여기에서 작동하지만 일관되게 작동하지 않는 것 같습니다. 펄스 수동 드릴링에 극도의 주의를 기울였음에도 불구하고 뇌에는 여전히 시각적 손상이 있었습니다. 이것은 두 가지 요인의 결과 일 수 있습니다 : 1) 손으로 드릴링하는 것과 같은 통제력과 느낌의 부족과 2) 마우스와 같은 작은 동물의 두개골과 뇌 사이의 분리 깊이. 핸드 드릴링은 충분한 연습과 전문 지식을 통해 뇌를 손상시키지 않고 두개골을 통과할 수 있는 보다 통제된 방법을 제공할 수 있습니다. 그러나 플러그 앤 플레이 로봇에 비해 훨씬 더 높은 기술과 훈련이 필요하므로 여러 "외과의"가 동일한 연구에 기여할 수 있습니다. 생쥐의 경우 뇌와 두개골 사이의 거리가 매우 얇기 때문에 10μm의 약간의 과도한 드릴조차도 뇌에 기계적 손상을 줄 수 있습니다.
그림 4: 손상의 육안 검사. 세 가지 드릴링 방법 각각에 대한 육안 검사 및 표현을 위해 획득한 모든 뇌의 디지털 이미지. (A-D) 수평은 기계적 또는 열적 손상으로 인해 두개골 창 주변의 손상을 일관되게 보여주었습니다. (E-H) 포인트별 결과에서 상당한 차이를 보였으며, 이는 드릴링에 대한 신뢰성이 떨어지는 방법을 나타냅니다. (I-L) 펄스 포인트-바이-포인트는 다른 방법보다 더 일관되고 시각적 손상이 적었으며 EB 형광 분석 및 열전대 결과의 차이와 일치했습니다. 스케일 바 = 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 가로 | 점 | 펄스 | 제어 | |
| 가로 | - | 0.411 | 0.043* | 0.043* |
| 점 | 0.411 | - | 0.486 | 0.043* |
| 펄스 | 0.043* | 0.486 | - | 0.043* |
표 1: EB 형광 이미징 결과의 통계 분석. 다양한 드릴링 기술에 대한 EB 형광 이미징 시스템의 결과는 Benjamin-Hochberg 보정과 함께 Kruskal-Wallis 순위 합계 테스트를 사용하여 분석한 후 Wilcoxon 순위 합계 정확 테스트(그룹당 N = 4)를 사용하여 쌍별 비교를 수행했습니다. 그룹 간의 중요한 차이는 별표 *로 표시됩니다.
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Discussion
EB 염료 및 이미징의 사용은 새로운 방법과 기술을 위해 뇌의 혈관 손상을 평가하는 데 간단하고 빠르며 유용합니다. 수술 로봇을 사용하든 현재 실험실에서 수행되는 방법을 확인하든, 실험적 치료의 효과와 수술 효과를 분리하고 동물 복지를 개선하기 위해 수술 방법을 검증하는 것이 중요합니다. 열전대 설정은 가열이 발생하지 않도록 드릴링 방법을 평가하는 데에도 유용합니다. 뼈 천공으로 인한 온도의 상승은 조직 손상을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 5°C의 증가만으로도 뇌에 큰 혈관 손상을 일으킬 수 있다(32,33,34,35,36). 실험실 및 수술 기술을 개선하기 위해 여기에 설명된 방법을 활용하는 것이 좋습니다.
평가에는 유용하지만 열전대 평가에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 열전대 데이터는 열전대를 뇌에 맞추기 위해 두개골 측면에 구멍을 뚫어야 하고 결과적으로 뇌가 손상될 수 있기 때문에 사체 마우스를 사용하여 수집됩니다. 그 결과, 동물의 생리적 온도 대신 드릴링 전반에 걸쳐 온도 차이가 측정됩니다. 또한 분석에 포함되지 않은 생리적 온도 조절 기능이 있을 수 있습니다.
프로토콜 중 몇 가지 단계는 적절한 드릴링을 보장하는 데 중요합니다. 첫째, 두개골 정렬이 잘못 수행되면 뇌 손상과 함께 드릴링 정확도가 떨어집니다(자동 정지가 작동하지 않는 경우). 이 문제를 방지하기 위해 기울기 보정 전에 동물의 장착이 가능한 한 직선인지 확인하십시오. 기울기 보정 프로세스를 천천히 그리고 확실하게 수행하여 기울기 오프셋을 수정하십시오. 이 연구 중 몇 가지 경우에 기울기가 꺼져 드릴 비트가 두개골에 닿지 않았음에도 불구하고 드릴 시스템이 두개골에 구멍을 뚫고 있다고 믿게 되었습니다. 대체로 이것은 두개골 두께를 정확하게 기록하는 데 문제가 되며, 충분히 심각할 경우 드릴링 좌표가 부정확할 수 있습니다. 또한 자동 정지 기능이 일관되지 않아 주의해서 사용해야 합니다. 뇌 손상을 방지하기 위해 자동 정지 기능에만 의존하지 마십시오. 과도한 드릴링이 발생하지 않도록 항상 드릴링 구멍을 확인하십시오.
자동 정지에 관계없이 점별 및 수평 드릴링 방법에 대해 수행할 수 있는 몇 가지 최적화가 있습니다. 뇌에 우발적인 손상이 없도록 하기 위해 포인트별 포인트는 가장자리 절단 중에 드릴 오프셋을 사용하지만 사용자는 테스트를 통해 이 설정을 미리 결정해야 합니다. 선형 보간 방법은 가장 얕은 종자 지점을 기본으로 통합하여 두개골 주변의 두꺼운 종자에서 뇌에 손상이 발생하지 않도록 할 수 있습니다. 필요한 경우 사용자는 항상 두개골의 두꺼운 영역으로 돌아가 더 깊게 드릴링할 수 있습니다. 수평 절삭 단계는 모서리 점을 중심으로 회전할 때마다 깊이 절삭 간격(기본값 100μm)을 사용합니다. 이것은 또한 너무 깊게 뚫고 뇌를 손상시키는 것을 피하기 위해 두개골 두께에 따라 결정할 수 있습니다.
형질전환 마우스는 생체 내 다광자 이미징을 위한 강력한 실험 모델입니다. 형질전환 마우스의 두개골 창에 수술 로봇을 사용하는 것이 이 연구에서 강조되지만 다른 두개골 수술에서 수술 로봇의 사용에 주목하는 것이 중요합니다. 드릴링을 제어하고 표준화하는 능력은 현장 전반에 걸친 대규모 동물 연구에서 두개술에 이점을 제공합니다. 약간의 기계적 손상이 육안으로 관찰되었지만 이는 생쥐의 뇌와 두개골 사이의 간격이 극히 작기 때문일 가능성이 큽니다. 쥐와 같은 몸집이 큰 동물은 지주막하 공간이 더 많고 경막이 더 두꺼워서 로봇 드릴링으로 인한 기계적 손상 위험이 적다25. 여기에서 펄스 방법을 사용하여 표시된 열 손상 감소와 함께 수술 로봇은 다양한 동물 모델에 걸쳐 드릴링으로 인해 발생하는 손상을 크게 줄일 수 있습니다.
전반적으로, 펄스 포인트 바이 포인트 방법은 뇌에 대한 열이 적거나 기계적 손상이 적기 때문에 손상이 가장 적은 것으로 나타났습니다. 손으로 드릴링하는 것은 손상을 방지하기 위해 보다 통제된 방법을 제공할 수 있지만 수술 로봇의 이점을 강조하는 것이 중요합니다. 로봇은 교육이 덜 필요하고, 외과 의사 간 변동성을 줄이는 데 도움이 될 수 있으며, 완전히 최적화되면 실험실 전체에서 보다 표준화된 절차를 제공할 수 있습니다. 또한 수술 로봇의 학습 곡선은 수동 수술보다 훨씬 낮습니다. 이것은 기술을 배우는 데 필요한 시간을 줄일뿐만 아니라 훈련 목적으로 사용되는 동물의 수를 줄입니다. 두개골 창 드릴링의 보급은 발표된 논문20,37에서 볼 수 있듯이 뇌를 통한 다광자 이미징의 혁신으로 증가했습니다. 열전대 및 EB 염료 이미징과 같은 특성화 방법을 사용하면 드릴링 기술을 최적화하는 데 도움이 되며, 로봇을 사용하면 어려운 수술에 더 쉽게 접근할 수 있고 널리 퍼질 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 보고할 이해 상충이 없습니다. 내용은 미국 재향군인회, 국립보건원(National Institutes of Health) 또는 미국 정부의 견해를 나타내지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국(미국) 재향군인회 재활 연구 개발 서비스의 Merit Review Awards GRANT12418820(Capadona) 및 GRANTI01RX003420(Shoffstall/Capadona) 및 Research Career Scientist Award # GRANT12635707(Capadona)의 지원을 받았습니다. 또한 이 작업은 국립 보건원(National Institute of Health), 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke GRANT12635723)(카파도나) 및 국립 생물의학 영상 및 생명공학 연구소(National Institute for Biomedical Imaging and Bioengineering, T32EB004314)(카파도나/키르쉬)의 일부 지원을 받았습니다. 이 자료는 보조금 번호 GRANT12635723에 따라 National Science Foundation 대학원 연구 펠로우십이 지원하는 작업을 기반으로 합니다. 이 자료에 표현된 모든 의견, 발견, 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 National Science Foundation의 견해를 반영하는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent |
VWR | MRGF-6235 | For Evans Blue dilution |
| Aura Software Type: Tool |
Spectral Instruments Imaging | Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems | |
| Buprenorphine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool |
Stoelting | 58640-1 | |
| Carprofen Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Cefazolin Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Evans Blue Dye Type: Reagent |
Millipore Sigma | E2129 | Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline |
| Isoflurane Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| IVIS Lumina II Type: Tool |
Perkin Elmer | CLS136334 | IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market |
| Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool |
Jenco | 765JF | For Thermocouple setup |
| Ketamine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| LivingImage Type: Tool |
Perkin Elmer | Software for IVIS Lumina III | |
| Marcaine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Neurostar Software Type: Tool |
Stoelting | Comes with surgical robot purchase | |
| Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool |
Kent Scientific | PS-03 | Used to monitor vitals |
| PrismPlus mice Type: Animal |
Jackson Labortory | 031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old | Animals used for the study |
| Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool |
Stoelting | 58640 | Main robotic drill with stereotaxic frame |
| Thermocouple Type: Tool |
TC Direct | 206-557 | For Thermocouple setup |
| USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool |
National Instruments | USB-6008 | For Thermocouple setup |
| Xylazine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility |
References
- Kilic, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Frontiers in Physiology. 11, 612678 (2020).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100779 (2021).
- Wang, X., et al. A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain. Frontiers in Neuroscience. 15, 673740 (2021).
- Wang, Y., Xi, L. Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review. Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15 (2021).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protocols. 1 (3), 100194 (2020).
- Kunori, N., Takashima, I. An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging. Micromachines. 10 (11), 789 (2019).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sundaram, G. S., et al. Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice. Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).
- Spires, T. L., et al. Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).
- Price, D. L., et al. High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders. Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).
- Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).
- Hyman, B. T. The natural history of Alzheimer disease dissected through multiphoton imaging of transgenic mice. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 20 (4), 206-209 (2006).
- Korzhova, V., et al. Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice. Communications Biology. 4 (1), 1368 (2021).
- Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).
- Courtin, J., et al. A neuronal mechanism for motivational control of behavior. Science. 375 (6576), (2022).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
- Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study. Biomaterials. 195, 111-123 (2019).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001 (2018).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
- Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Scientific Reports. 4, 6588 (2014).
- Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7 (1), 15254 (2017).
- Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007 (2021).
- Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores. PLoS One. 7 (7), 40511 (2012).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).
- Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature. Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).
- Eriksson, A. R., Albrektsson, T. Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit. The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).
- Bonfield, W., Li, C. H. The temperature dependence of the deformation of bone. Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).
- Hrapkiewicz, K., Medina, L. Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed. , Blackwell Publishing. Ames Iowa. (2007).
- McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat. Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).
- Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments. (123), e52642 (2017).
