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Immunology and Infection

माइक्रोबियल और रासायनिक उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप का रूपात्मक और रचनात्मक विश्लेषण

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/64522
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 3, 1
1Clinical Immunology Research Department of Biochemical Sciences Faculty, Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca, 2Department of Molecular Biomedicine, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, 3CONACYT- Medicine and Surgery Faculty, Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca, 4Molecular Immunology Research Department of Medicine and Surgery Faculty, Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca

Summary

यहां प्रस्तुत इन विट्रो न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) के प्रेरण और विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल है। डीएनए, कैथेलिसिडिन (एलएल 37), और एंजाइम गतिविधि का परिमाणीकरण डेटा प्राप्त करता है जो समान नियंत्रित परिस्थितियों में माइक्रोबियल और रासायनिक उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित एनईटी की संरचना और आकृति विज्ञान में परिवर्तनशीलता दिखाता है।

Abstract

न्यूट्रोफिल विभिन्न तंत्रों को नियोजित करके एक जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में सेलुलर रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करते हैं, जैसे कि न्यूट्रोफिल बाह्य जाल (एनईटी) का गठन। यह अध्ययन मानव कोशिकाओं के साथ नेट प्रेरण और लक्षण वर्णन के लिए मानकीकृत इन विट्रो पद्धतियों का उपयोग करके माइक्रोबियल और रासायनिक उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित एनईटी में रूपात्मक और रचनात्मक परिवर्तनों का विश्लेषण करता है। यहां वर्णित प्रक्रियाएं नेट आकृति विज्ञान (लिटिक या गैर-लिटिक) और संरचना (डीएनए-प्रोटीन संरचनाओं और एंजाइमेटिक गतिविधि) के विश्लेषण और ऐसी विशेषताओं पर घुलनशील कारकों या सेलुलर संपर्क के प्रभाव की अनुमति देती हैं। इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित तकनीकों को नेट संरचना पर बहिर्जात घुलनशील कारकों या सेलुलर संपर्क के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

लागू तकनीकों में दोहरे घनत्व ढाल (1.079-1.098 ग्राम / एमएल) का उपयोग करके मानव परिधीय रक्त से पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर कोशिकाओं का शुद्धिकरण शामिल है, जो इष्टतम शुद्धता और व्यवहार्यता (≥ 95%) की गारंटी देता है, जैसा कि राइट के धुंधलापन, ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रदर्शित किया गया है, जिसमें एफएससी बनाम एसएससी विश्लेषण और 7 एएडी धुंधलापन शामिल है। नेट गठन माइक्रोबियल (स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, स्टेफिलोकोकस ऑरियस, और कैंडिडा अल्बिकन्स) और रासायनिक (फोरबोल मायरिस्टेट एसीटेट, एचओसीएल) उत्तेजनाओं के साथ प्रेरित होता है, और एनईटी को डीएनए-डीएपीआई धुंधला, रोगाणुरोधी पेप्टाइड कैथेलिसिडिन (एलएल 37) के लिए इम्यूनोस्टेनिंग, और एंजाइमेटिक गतिविधि (न्यूट्रोफिल इलास्टेस, कैथेप्सिन जी, और मायलोपेरोक्सीडेज) की मात्रा का परिमाणीकरण की विशेषता है। छवियों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त किया जाता है और इमेजजे के साथ विश्लेषण किया जाता है।

Introduction

न्यूट्रोफिल रक्तप्रवाह में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स हैं, जो कई तंत्रों द्वारा रोगजनक एजेंटों की निकासी के दौरान एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिसमें डीएनए और कई परमाणु, साइटोप्लाज्मिक और दानेदार जीवाणुरोधी प्रोटीनसे बने बड़े क्रोमैटिन संरचनाओं की रिहाई शामिल है। न्यूट्रोफिल की इस रोगाणुरोधी भूमिका का वर्णन करने वाला प्रत्यक्ष पूर्ववर्ती 1996 में टाकेई एट अल.3 द्वारा बनाया गया था। इन लेखकों ने न्यूट्रोफिल में एपोप्टोसिस और नेक्रोप्टोसिस से अलग मृत्यु के एक नए रूप की सूचना दी, परमाणु टूटने का प्रदर्शन करने वाले रूपात्मक परिवर्तन दिखाए, इसके बाद न्यूक्लियोप्लाज्म से साइटोप्लाज्म में फैल गया, और फोरबोल मायरिस्टेट एसीटेट (पीएमए) 2,3 के साथ इनक्यूबेशन के 3 घंटे से झिल्ली पारगम्यता में वृद्धि हुई। हालांकि, यह 2004 तक नहीं था कि "न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी)"शब्द का उपयोग किया गया था।

माइक्रोबियल प्रसार को बेअसर करने, मारने और रोकने के लिए विभिन्न स्थितियों, जैसे बैक्टीरियल, फंगल5, वायरल6 और परजीवी संक्रमण में नेट गठन देखा गयाहै। अन्य अध्ययनों से पता चलता है कि यह गैर-रोगजनक स्थितियों में बाँझ उत्तेजनाओं, जैसे साइटोकिन्स, मोनोसोडियम यूरिक एसिड या कोलेस्ट्रॉल क्रिस्टल, ऑटोएंटीबॉडी, प्रतिरक्षा परिसर और सक्रिय प्लेटलेट्स 7 द्वारा भी होसकता है। लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस), इंटरल्यूकिन -8 (आईएल -8), और पीएमए एनईटी इंड्यूसर के रूप में वर्णित पहले इन विट्रो उत्तेजनाओं में से थे, और रोगजनक प्रक्रियाओं में विवो नेट की भागीदारी तीव्र सूजन के दो मॉडलों में प्रदर्शित की गई थी: प्रयोगात्मक पेचिश और सहज मानव एपेंडिसाइटिस4। डीएनए एक आवश्यक नेट घटक है। पकड़े गए रोगाणुओं की ओर रोगाणुरोधी अणुओं की उच्च स्थानीय एकाग्रता प्रदान करके सूक्ष्मजीवों के पृथक्करण और हत्या के लिए इसकी उपयुक्त संरचना और संरचना आवश्यक है, जैसा कि एक संक्षिप्त डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिज़ (डीनेस) उपचार द्वारा प्रदर्शित किया गया है जो एनईटी और उनके माइक्रोबिसाइडल गुणोंको विघटित करता है। डीएनए के अलावा, एनईटी में हिस्टोन, न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई), कैथेप्सिन जी (सीजी), प्रोटीनेज 3, लैक्टोफेरिन, जिलेटिनेस, मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ), और एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स (एएमपी) जैसे संलग्न प्रोटीन शामिलहैं। इस तरह के समुच्चय 50 एनएम तक व्यास के साथ बड़े धागे बना सकते हैं। ये कारक माइक्रोबियल विषाणु कारकों या रोगज़नक़ कोशिका झिल्ली की अखंडता को बाधित कर सकते हैं; इसके अतिरिक्त, एएमपी बैक्टीरिया न्यूक्लियस10 द्वारा गिरावट के खिलाफ नेट-व्युत्पन्न डीएनए को स्थिर कर सकते हैं।

नेट गठन को विनियमित करने वाले विशिष्ट तंत्र अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किए गए हैं। नेट रिलीज के लिए सबसे अच्छी विशेषता वाला मार्ग ईआरके सिग्नलिंग के माध्यम से है, जो एनएडीपीएच ऑक्सीडेज सक्रियण और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन की ओर जाता है, साथ ही इंट्रासेल्युलर कैल्शियम में वृद्धि होती है जो एमपीओ मार्ग के सक्रियण को ट्रिगर करती है। यह बदले में हाइड्रोजन पेरोक्साइड को हाइपोक्लोरस एसिड में बदल देता है, ऑक्सीकरण11,12 द्वारा एनई को सक्रिय करता है। एनई साइटोस्केलेटन के एक्टिन फिलामेंट्स को फागोसाइटोसिस को अवरुद्ध करने और पीएडी 4 द्वारा प्रोटियोलिटिक दरार और डीमिनेशन द्वारा प्रसंस्करण के लिए नाभिक में स्थानांतरित करने के लिए जिम्मेदार है जो क्रोमैटिन फाइबर के डिसेन्सिटाइजेशन को चलाते हैं, जो ग्रेन्युल और साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन के साथ जुड़ते हैं, और फिरबाह्य रूप से जारी किए जाते हैं। इन प्रोटीज में एज़ुरोफिल ग्रैन्यूल्स और कैथेप्सिन जी13 जैसे अन्य प्रोटीज के अज़ुरोसोम कॉम्प्लेक्स से जारी किए गए शामिल हैं।

न्यूट्रोफिल में रूपात्मक परिवर्तनों के आधार पर, एनईटी को दो प्रकारों में वर्गीकृत किया जाता है: आत्मघाती या लिटिक नेट गठन जिससे कोशिका मृत्युहोती है 4, और परमाणु या माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की वेसिकुलर रिलीज द्वारा मध्यस्थ व्यवहार्य कोशिकाओं द्वारा निर्मित महत्वपूर्ण या गैर-लिटिक नेट गठन, जिसमें फागोसाइटिक क्षमता14,15 के साथ एक एन्यूक्लिएटेड साइटोप्लास्ट का अवशेष होता है। आम तौर पर, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए से बने एनईटी एक लम्बी फाइबर14 आकृति विज्ञान प्रस्तुत करते हैं, जबकि परमाणु डीएनए से संरचित लोगों में बादल जैसी उपस्थितिहोती है। हालांकि, यह ज्ञात नहीं है कि न्यूट्रोफिल अपने डीएनए मूल को कैसे चुनता है। पिछले अध्ययनों के विपरीत जो एनईटी के कैननिकल मार्गों को कई घंटों की आवश्यकता के रूप में वर्णित करते हैं, महत्वपूर्ण मार्ग केवल 5-60 मिनट15 में तेजी से सक्रिय होता है।

इन प्रगति के बावजूद, एनईटी संरचना उत्तेजना के आधार पर भिन्न होती है; उदाहरण के लिए, पी एरुगिनोसा के विभिन्न श्लेष्म और गैर-श्लेष्म उपभेद 33 सामान्य प्रोटीन और 50 चर प्रोटीन युक्त एनईटी के गठन को प्रेरित करतेहैं। इस प्रकार, उन तकनीकों को समरूप करना आवश्यक है जो अनुसंधान समूहों में उद्देश्य निष्कर्षों की पीढ़ी की अनुमति देते हैं। यह पेपर विभिन्न तकनीकों के साथ एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो विभिन्न सूक्ष्मजीवों के साथ प्रेरित एनईटी की संरचना, संरचना और आकृति विज्ञान की तुलना और मूल्यांकन की अनुमति देता है: स्टेफिलोकोकस ऑरियस (ग्राम-पॉजिटिव जीवाणु), स्यूडोमोनास एरुगिनोसा (ग्राम-नकारात्मक जीवाणु), और कैंडिडा अल्बिकन्स (कवक), साथ ही स्वस्थ व्यक्तियों से मानव न्यूट्रोफिल में रासायनिक उत्तेजना (पीएमए, एचओसीएल)। प्रतिनिधि परिणाम तुलनात्मक इन विट्रो स्थितियों के तहत उनके उत्प्रेरण उत्तेजना के आधार पर एनईटी की विविधता को प्रदर्शित करते हैं, जो डीएनए-डीएपीआई धुंधलापन, एलएल 37 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग और एंजाइमेटिक गतिविधि (एनई, सीजी और एमपीओ) की मात्रा का निर्धारण करते हैं।

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Protocol

सूचित सहमति के बाद नैदानिक रूप से स्वस्थ प्रतिभागियों से दान के रूप में रक्त के नमूने प्राप्त किए गए थे। सभी प्रयोग जैव रासायनिक विज्ञान संकाय की मानव अनुसंधान आचार समिति की अनुमति से किए गए थे, ओक्साका के यूनिवर्सिड औटोनोमा 'बेनिटो जुआरेज़'।

नोट: अध्ययन में शामिल मानदंड अस्पष्ट लिंग और आयु थे, और रक्त का नमूना लेने से पहले प्रश्नावली के लिए प्रतिभागी प्रतिक्रियाओं के अनुसार चिकित्सकीय रूप से स्वस्थ थे। कोशिका गणना निर्धारित करने और संक्रमण या एनीमिया का पता लगाने के लिए एक हेमेटोलॉजिकल विश्लेषण किया गया था, साथ ही दाता में सूजन का पता लगाने के लिए सी-रिएक्टिव प्रोटीन परीक्षण भी किया गया था।

1. परिधीय रक्त संग्रह और एरिथ्रोसाइट और ल्यूकोसाइट पैकेज प्राप्त करना

  1. 1.8 मिलीग्राम / एमएल के साथ ट्यूबों में वेनिपंक्चर द्वारा 10 एमएल परिधीय रक्त एकत्र करें। सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद नैदानिक रूप से स्वस्थ व्यक्तियों से एंटीकोआगुलेंट (सामग्री की तालिका देखें) के रूप में ईडीटीए। फिर, संक्रमण या सूजन का पता लगाने के लिए मानक रक्त बायोमेट्री और सी-रिएक्टिव प्रोटीन परीक्षण करें, नमूने की गुणवत्ता सुनिश्चित करें।
  2. प्लेटलेट-समृद्ध प्लाज्मा को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए 82 x g पर परिधीय रक्त के नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, इसके बाद 5 मिनट के लिए 630 x g पर दूसरा सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया। एरिथ्रोसाइट और ल्यूकोसाइट पैकेज प्राप्त करने के लिए शेष प्लाज्मा को त्याग दें।
  3. इसे 1x Dulbecco के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (DPBS) के साथ 1: 1 अनुपात (v / v) में पतला करें।

2. डबल-घनत्व ढाल का उपयोग करके पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर न्यूट्रोफिल (पीएमएन) शुद्धिकरण

नोट: रक्त एकत्र होने के तुरंत बाद न्यूट्रोफिल शुद्धिकरण करें, क्योंकि उनके पास लगभग 8 घंटे का सीमित इन विट्रो जीवनकाल है।

  1. निम्नलिखित को बाँझ 10 एमएल ग्लास ट्यूब में जमा करें ( सामग्री की तालिका देखें) क्रम में: 1.098 ग्राम / एमएल घनत्व समाधान का 1 एमएल, 1.079 ग्राम / एमएल घनत्व समाधान का 1 एमएल ( सामग्री की तालिका देखें), और फिर पतला एरिथ्रोसाइट और ल्यूकोसाइट पैकेज का 4 एमएल। परतों के बीच सतह के तनाव को तोड़े बिना दीवारों पर डालें ताकि उन्हें मिश्रण से रोका जा सके।
  2. सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 320 x g पर, त्वरण / मंदी से बचता है ताकि सेंट्रीफ्यूज के उच्च बल ढाल को परेशान न करें।
  3. एस्पिरेटेड चरण जो ग्रैनुलोसाइट्स (चित्रा 1 ए) से मेल खाता है, और एक और बाँझ 10 एमएल ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित होता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर 1x DPBS के 4 एमएल से धो लें।
  4. सुपरनैटेंट को त्याग दें और शेष एरिथ्रोसाइट्स को हटाने के लिए आसमाटिक सदमे के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 0.2% खारा घोल का 4 एमएल जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। फिर झिल्ली अखंडता को बहाल करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए आइसोटोनिक घोल (0.65% खारा) के 4 एमएल जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
    नोट: 0.2% खारा समाधान एक हाइपोटोनिक माध्यम है, जिसमें आरबीसी इंट्रासेल्युलर माध्यम के सापेक्ष कम विलेय एकाग्रता होती है। हाइपोटोनिकमीडियम के संपर्क में पानी को आरबीसी में फैलाने की अनुमति मिलती है, जिससे उनकी सूजन और हेमोलिसिस होता है। सतह पर तैरने वाले से आरबीसी को हटाने की पुष्टि सूक्ष्म अवलोकन द्वारा की गई थी।
  5. सतह पर तैरने वाले को हटा दें। सेलुलर मलबे को हटाने के लिए कोशिकाओं को 1x DPBS के 4 mL में पुन: निलंबित करें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। अंत में, ठंडे हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) बफर के 2 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।

3. न्यूट्रोफिल आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता (चित्रा 1 बी)

  1. ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण परीक्षण
    1. सेल सस्पेंशन के 5 μL को 0.4% ट्रिपैन ब्लू (1: 5 अनुपात) के 20 μL में पतला करें। एक न्यूबॉयर कक्ष में कोशिकाओं की गणना करें और बहिष्करण परीक्षण का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता निर्धारित करें। उन कोशिकाओं पर विचार करें जो डाई को व्यवहार्य के रूप में स्थिर किए बिना अपनी झिल्ली की अखंडता को बनाए रखते हैं।
    2. एक स्लाइड पर सेल निलंबन का माउंट 5 μL; 15 सेकंड के लिए राइट के दाग के साथ सूखा और दाग। तुरंत 30 सेकंड के लिए फॉस्फेट बफर पीएच 6.4 के साथ नमूना ठीक करें। पर्याप्त आसुत जल से धोएं और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (100x) के तहत आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।
  2. 7एएडी-धुंधला और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण
    1. प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूबों में 1 x 105 कोशिकाओं को जोड़ें, और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एफएसीएस बफर (1x DPBS, 0.1% सोडियम एज़ाइड, और 10% ऑटोलॉगस डिकॉम्प्लीमेंट्ड प्लाज्मा) के 100 μL में 7AAD के 1 μL के साथ दाग दें।
    2. 10 मिनट के लिए 300 x g पर FACS बफर के 500 μL से धो लें। कोशिकाओं को 2% पैराफॉर्मलडिहाइड के 500 μL के साथ ठीक करें, और प्रवाह साइटोमीटर में उनके विश्लेषण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. एक मृत कोशिका नियंत्रण के लिए,30 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 200 μL के साथ 1 x 10 5 कोशिकाओं को ठीक करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर 1x PBS के 500 μL से धोएं। सतह पर तैरने वाले को निकालें और छोड़ दें। फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स -100 का 200 μL जोड़ें। चरण 3.2.1 में 1x PBS के 500 μL से धोएं और 7AAD के साथ दाग दें।
    4. प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें), सेल की शुद्धता का विश्लेषण करने के लिए एफएससी बनाम एसएससी विश्लेषण करें और सेल व्यवहार्यता का विश्लेषण करने के लिए एसएससी बनाम 7 एएडी धुंधला करें। पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर सेटिंग्स (एफएससी,400-490 और एसएससी, 300-320) में मध्यम प्रवाह (1,000 कोशिकाओं / एस) पर अपटेक वॉल्यूम के 100 μL में 3 x 10 4 घटनाओं को पढ़ें।
    5. प्रवाह साइटोमीटर सॉफ्टवेयर में कैप्चर किए गए डेटा का विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें), और डॉट प्लॉट और हिस्टोग्राम के माध्यम से प्रस्तुत पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर आबादी में 7 एएडी के लिए शुद्धता और सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करें।

4. सूक्ष्मजीवों का सीएफएसई धुंधला होना

  1. 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में 1 x 108 बैक्टीरिया या 1 x 106 फंगल स्यूडोहिफे जोड़ें, और 1x PBS में घुले 5 μM कार्बोक्सीफ्लोरेसिन सक्सिनिमिडिल एस्टर (CFSE) के 200 μL के साथ दाग लगाएं। कुछ सेकंड के लिए मिलाएं, और अंधेरे में 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. डिकॉम्प्लीमेंट्ड प्लाज्मा के 500 μL को जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें, और स्यूडोहिफे के लिए 10 मिनट के लिए 620 x g पर सेंट्रीफ्यूज या बैक्टीरिया के लिए 10 मिनट के लिए 1,800 x g पर।
  3. सतह पर तैरने वाले कणों को छोड़ दें और चरण 4.2 में सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ 1 एमएल 1x पीबीएस के साथ छर्रों को धोएं। अंत में, सूक्ष्मजीवों को 1x PBS के 250 μL में पुन: निलंबित करें।
  4. नेट प्रेरण के लिए 2 x 107 बैक्टीरिया (एमओआई: 100) या 2 x 10 5 स्यूडोहिफे (एमओआई: 1) के साथ 1.5 एमएल के माइक्रोट्यूबमें 50 μL एलिकोट तैयार करें।

5. नेट प्रेरण

  1. 24-वेल प्लेट में 10 मिमी x 10 मिमी बाँझ ग्लास कवरलिप रखें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.001% पॉली-एल-लाइसिन के 10 μL के साथ कवर करें। 1x PBS के 100 μL के साथ दो बार धोएं, हवा सूखें, और 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ विकिरणित करें।
  2. चरण 2.5 में न्यूट्रोफिल निलंबन के एचबीएसएस समाधान को आरपीएमआई 1640 माध्यम के साथ 10% ऑटोलॉगस प्लाज्मा के साथ प्रतिस्थापित करें। 24-वेल प्लेट (चरण 5.1) में, 2 x 10 5 न्यूट्रोफिल / वेल की अंतिम एकाग्रता के लिए, इस सेल निलंबन के350 μL जोड़ें।
  3. कोशिकाओं को 5% CO2 के साथ 37 °C पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके कुओं के तल का पालन करने की अनुमति दें।
  4. 50 μL में NET गठन को प्रेरित करने के लिए उत्तेजनाओं को जोड़ें: माइक्रोबियल उत्तेजना-ग्राम-पॉजिटिव जीवाणु S. Aureus (ATCC 25923), ग्राम-नकारात्मक जीवाणु P. Aruginosa (ATCC 10145) MOI 100 पर, और MOI: 1 पर C. albicans (ATCC 10231) के स्यूडोहिफे; जैव रासायनिक उत्तेजना-पीएमए (200 एनएम) और एचओसीएल (4.5 एमएम), और उत्तेजना अनुपस्थित के साथ नियंत्रण (एचबीएसएस का 50 μL)।
  5. प्रति अच्छी तरह से 400 μL की अंतिम मात्रा प्राप्त करें। 30 सेकंड के लिए 140 आरपीएम पर एक प्लेट शेकर पर मिलाएं, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

6. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा एनईटी का विज़ुअलाइज़ेशन

  1. डीएनए और एलएल 37 इम्यूनोस्टेनिंग
    1. एनईटी प्रेरण के बाद, ध्यान से पाइपिंग करके कुओं से सतह पर तैरने वाले तत्वों को हटा दें, और कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 300 μL के साथ ठीक करें।
    2. सेंट्रीफ्यूजिंग के बिना 1x PBS के 200 μL के साथ कोशिकाओं को धोएं, और 30 मिनट के लिए 200 μL ब्लॉकिंग बफर (1x PBS में 10% विघटित प्लाज्मा) जोड़ें।
    3. एलएल -37 दाग के लिए, एंटीबॉडी को कोशिकाओं में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए 1x PBS में 0.2% ट्राइटन X-100 के 200 μL के साथ कोशिकाओं को स्थिर करें। अतिरिक्त डिटर्जेंट को हटाने के लिए 1x PBS के साथ 2x को सावधानी से धोएं।
    4. ग्लास स्लाइड पर कवरलिप्स माउंट करें (प्रत्येक स्लाइड पर चार कवरलिप)। डीएनए कोशिकाओं को 2 μL DAPI ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ दाग देता है, कवरलिप्स को सील करता है, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करता है जब तक कि कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा उनका विश्लेषण नहीं किया जाता है।
  2. फ्लोरोसेंट छवियों का अधिग्रहण और विश्लेषण
    1. अपने घटकों को निर्धारित करने के लिए नेट छवियों का उपयोग करें, और कंप्यूटर के सॉफ्टवेयर के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) में संबंधित फिल्टर का उपयोग करें।
      नोट: विचार करें कि डीएनए DAPI (नीला रंग) से सना हुआ है, जो 360 nm पर उत्तेजना और 460 nm पर उत्सर्जन दिखाता है। सूक्ष्मजीवों को सीएफएसई (हरे रंग) से दाग दिया जाता है, जिसमें 492 एनएम की उत्तेजना और 521 एनएम का उत्सर्जन होता है। एलएल 37 पेप्टाइड को एंटी-एलएल 37 एलेक्सा फ्लोर 594 एंटीबॉडी (लाल रंग) के साथ लेबल किया गया है, जिसमें 594 एनएम की उत्तेजना और 614 एनएम का उत्सर्जन है।
    2. माइक्रोस्कोप को कैलिब्रेट करें। सामान्य प्रकाश के साथ विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) का उपयोग करके स्लाइड और फोकस रखें। मॉनिटर पर छवि प्रोजेक्ट करने के लिए लाइव चुनें।
    3. लाइट बंद करें और फ्लोरोक्रोम संबंधित चैनल का चयन करें। उदाहरण के लिए, DAPI के लिए फ़िल्टर 365 nm/blue, Alexa 594 के लिए 43 HE DsRed, या CFSE के लिए 38 HE GFP का चयन करें।
    4. एलएल 37 के लिए आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी और डीएपीआई और सीएफएसई के लिए बिना दाग वाली कोशिकाओं के साथ सेटिंग्स समायोजित करें। समान परिस्थितियों में सभी छवियों को कैप्चर करने के लिए एक ही एक्सपोज़र समय, वोल्टेज, कंट्रास्ट और लेंस सेटिंग्स सेट करें।
      नोट: इस अध्ययन में, एक्सपोजर समय, वोल्टेज और कंट्रास्ट को क्रमशः 1.0 एमएस, 4.0 वी और 0.0 पर सेट किया गया था, जिसमें 40x उद्देश्य था। नमूने के लिए सर्वोत्तम छवि कैप्चर की सुविधा के लिए इन मूल्यों को समायोजित किया जा सकता है।
    5. छवि कैप्चर करने के लिए स्नैप का चयन करें। प्रति अच्छी तरह से पांच छवियों (चार चरम सीमाओं और केंद्र) को सहेजें, और डीएनए / एलएल 37 / सीएफएसई के कोलोकलाइजेशन (विलय) की।
    6. पिक्सेल के तीन वर्गों को प्रत्येक रंग की स्वतंत्र छवियों के साथ पृष्ठभूमि के रूप में परिभाषित करें और छवि जे सॉफ्टवेयर के साथ प्रति क्षेत्र मीन ग्रे सिग्नल मान का विश्लेषण करें।

7. एंजाइमैटिक गतिविधि परिमाणीकरण

  1. 96-वेल प्लेट में, एचबीएसएस में 90 μL सेल सस्पेंशन जोड़ें जिसमें नेट प्रेरण के लिए 1 x 105 न्यूट्रोफिल होते हैं, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO 2 पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. तुरंत, संबंधित उत्तेजनाओं के 10 μL जोड़ें (चरण 5.4 में एकाग्रता) और 5% CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. सतह पर तैरने वाले तत्वों को त्याग दें और कोशिकाओं को एचबीएसएस के 100 μL से धो लें। डीएनए-प्रोटीन संरचनाओं की रिहाई के पक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए डीनेस के 1 यू / एमएल के साथ इलाज करें, और 10 मिनट के लिए 1,800 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सुपरनैटेंट को पुनर्प्राप्त करें और कलरमेट्रिक प्रतिक्रियाओं का उपयोग करके सुपरनैटेंट में एंजाइम गतिविधि का मूल्यांकन करें जैसा कि पहले व्हाइट एट अल .17 द्वारा वर्णित किया गया था।
  5. नेट प्रेरण के लिए किसी भी उत्तेजना को जोड़े बिना समान प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत न्यूट्रोफिल में एनई, सीजी और एमपीओ की अधिकतम एंजाइम गतिविधि निर्धारित करें। फिर, सेल के नमूने को -70 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें और पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर पिघल जाएं, जिससे सेल लाइसिस द्वारा इंट्रासेल प्रोटीन की रिहाई के पक्ष में तापमान झटका पैदा होता है। सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 1,800 x g पर और सुपरनैटेंट को पुनर्प्राप्त करें।
  6. 96-वेल प्लेटों में प्रत्येक कुएं में सतह पर तैरने वाले का 50 μL जोड़ें, और फिर चरण 7.7 में दर्शाए अनुसार प्रत्येक सब्सट्रेट का 50 μL जोड़ें।
  7. एनई के लिए सब्सट्रेट के रूप में एन-मेथॉक्सिसुसिनिल-अला-अला-प्रो-वैल-पी-नाइट्रो एनिलिन का 0.5 एम जोड़ें, और सीजी के लिए एन-सक्सिनिल-अला-अला-अला-प्रो-फे-पी-नाइट्रोनिलाइड का 1 एमएम जोड़ें। कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। एमपीओ के लिए, 3,3', 5,5'-टेट्रामिथाइलबेंजिडीन (टीएमबी) का 1.6 एमएम जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. पोस्ट-इनक्यूबेशन, एमपीओ के लिए स्टॉप सॉल्यूशन (0.5 एम एच2एसओ4) के 50 μL जोड़ें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एनई और सीजी के लिए 405 एनएम और एमपीओ के लिए 450 एनएम पर अवशोषण मापें।
  9. संबंधित अंशांकन वक्रों के साथ प्राप्त मूल्यों की तुलना करें और अधिकतम एंजाइम गतिविधि (100%) के सापेक्ष प्रत्येक स्थिति के परिणाम दिखाएं।

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग (एन = 10) के लिए तीन प्रतियों में माप डेटा का विश्लेषण करें और 95% आत्मविश्वास स्तर के साथ समूहों की तुलना करके सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक एनोवा करें।

Figure 1
चित्र 1: पीएमएन शुद्धिकरण और नेट प्रेरण प्रोटोकॉल। (ए) प्लाज्मा को एरिथ्रोसाइट और ल्यूकोसाइट पैकेज प्राप्त करने के लिए परिधीय रक्त से हटा दिया गया था और 1x DPBS के साथ 1: 1 (v / v) को पतला किया गया था। फिर, कमजोर पड़ने के 4 एमएल को दीवार के साथ डबल-घनत्व ग्रेडिएंट ट्यूब में जोड़ा गया था, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 320 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, विभिन्न सेल परतों के पृथक्करण को प्राप्त किया गया और पीएमएन के अनुरूप एक को पुनर्प्राप्त किया गया। (बी) शुद्ध कोशिकाओं की गणना की गई थी, और राइट के धुंधलापन द्वारा उनकी आकृति विज्ञान का विश्लेषण किया गया था। व्यवहार्यता फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण और 7एएडी धुंधला द्वारा निर्धारित की गई थी। एक बार इष्टतम न्यूट्रोफिल शुद्धता और व्यवहार्यता सत्यापित हो जाने के बाद, डीएपीआई-डीएनए, एंटी-एलएल 37 एलेक्सा फ्लूर 594 और सूक्ष्मजीव-सीएफएसई धुंधला के साथ फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए 24-वेल प्लेटों में रोगाणुओं (एस ऑरियस, पी एरुगिनोसा और सी अल्बिकन्स) या रसायनों (पीएमए, एचओसीएल) को जोड़कर नेट गठन को प्रेरित किया गया था। एंजाइम परिमाणीकरण के लिए, एनईटी को 3 घंटे के लिए 96-वेल प्लेटों में प्रेरित किया गया था और डीनेस के साथ इलाज किया गया था, इसके बाद प्रत्येक एंजाइम के लिए सब्सट्रेट्स को जोड़ा गया था: एनई, सीजी और एमपीओ; रंग परिवर्तन ों को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था। डीपीबीएस = डलबेको का फॉस्फेट-बफर्ड खारा; पीबीएमसी = परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं; पीएमएन = पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर न्यूट्रोफिल; एनई = न्यूट्रोफिल इलास्टेस; सीजी = कैथेप्सिन जी; एमपीओ = मायलोपेरोक्सीडेज; पीएमए = फोरबोल माइरिसिटेट एसीटेट; एचओसीएल = हाइपोक्लोरस एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

न्यूट्रोफिल की शुद्धता और व्यवहार्यता
गतिशील सेलुलर चरणों को डबल-घनत्व ढाल शुद्धिकरण से ट्यूब में देखा जाता है। इन परतों के भीतर, ग्रैनुलोसाइट्स के अनुरूप परत 1.079 ग्राम / एमएल घनत्व परत से ऊपर है, जो परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लिओसाइट्स (पीबीएमसी) और एरिथ्रोसाइट्स (चित्रा 1 ए) के चरणों से अलग है। शुद्ध कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को परिपक्व न्यूट्रोफिल के अनुरूप धागे जैसे फिलामेंट्स से जुड़े खंडित नाभिक वाली कोशिकाओं को देखकर राइट के धुंधला होने के साथ सत्यापित किया गया था (चित्रा 2 ए)। न्यूट्रोफिल के कम आधे जीवन के कारण, निम्नलिखित नेट प्रेरण प्रयोगों के लिए व्यवहार्यता एक महत्वपूर्ण बिंदु है। इसलिए, सेल व्यवहार्यता को ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण धुंधला होने के साथ सत्यापित किया गया था, जब डाई प्रवेश नहीं करती है तो प्लाज्मा झिल्ली की अखंडता का मूल्यांकन किया जाता है (चित्रा 2 बी)। इसके अतिरिक्त, 7एएडी डीएनए के साइटोसिन और गुआनिन आधारों में इंटरकैलेट करता है और प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है, जो मृत कोशिकाओं के बहिष्करण की सुविधा प्रदान करता है (चित्रा 2 सी, डी)। इन प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप 10 प्रदर्शन किए गए प्रयोगों में 98.9% ± 0.06% की सेल शुद्धता और 95.5% ± 4.2% की सेल व्यवहार्यता हुई।

Figure 2
चित्र 2: ताजा शुद्ध न्यूट्रोफिल की आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता। (ए) ढाल शुद्धिकरण के बाद, राइट के धुंधलापन (100x) द्वारा विशिष्ट न्यूट्रोफिल आकृति विज्ञान की पुष्टि की गई थी। कोशिकाओं ने रक्तप्रवाह में परिपक्व न्यूट्रोफिल की एक बहुरंगी नाभिक विशेषता दिखाई और (बी) झिल्ली व्यवधान के बिना ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण द्वारा इष्टतम व्यवहार्यता दिखाई। (ग) फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एसएससी बनाम एफएससी का विश्लेषण पीएमएन के अनुरूप जनसंख्या की पुष्टि करता है, 98.9% ± 0.06% (एन = 10) की सेल शुद्धता प्राप्त करता है। (डी) पीएमएन डॉट प्लॉट्स को उनके संबंधित हिस्टोग्राम (बिना दाग वाले सेल, बाएं पैनल बनाम 7एडी दाग वाले सेल राइट पैनल) के साथ प्रस्तुत किया जाता है , जो परिणामों को मान्य करने के लिए 0.1% ट्राइटन (निचले पैनलों) के साथ 0.1% ट्राइटन (निचले पैनल) के साथ 95.5% ± 4.2% (एन = 10) की उच्च सेल व्यवहार्यता का संकेत देता है। 7एएडी डाई डीएनए को बांधता है और व्यवहार्य कोशिकाओं से बाहर रखा जाता है, इसलिए डिटर्जेंट प्रथागत ने कोशिका झिल्ली में परिवर्तन किया और 7एएडी के प्रवेश की अनुमति दी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रासायनिक और माइक्रोबायोलॉजिक उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित एनईटी की आकृति विज्ञान और संरचना
चित्र 3 इनक्यूबेशन के 4 घंटे के बाद रासायनिक (पीएमए, एचओसीएल) या माइक्रोबियल (सी अल्बिकन्स, एस ऑरियस और पी एरुगिनोसा) एजेंटों की कार्रवाई द्वारा इन विट्रो नेट प्रेरण को साबित करने वाली प्रतिनिधि छवियों को दर्शाता है (चित्रा 3 ए)। एलएल 37 धुंधला द्वारा नेट संरचना निर्धारित की गई थी, और छवियों को इमेजजे (चित्रा 3 बी, सी) के साथ क्षेत्र में औसत ग्रे मूल्यों की मात्रा का ठहराव करने के लिए कैप्चर किया गया था। आत्मघाती (लिटिक) या महत्वपूर्ण (गैर-लिटिक) नेट गठन को उनकी आकृति विज्ञान के आधार पर वर्णित किया गया था। इसकी तुलना में, 4 घंटे के लिए एचबीएसएस में संवर्धित अनियंत्रित नियंत्रण न्यूट्रोफिल ने इन आराम कोशिकाओं की विशेषता संघनित मल्टीलोबेड-सेगमेंटेड क्रोमैटिन (चित्रा 3 ए 1-3) के साथ साइटोप्लाज्म में एलएल 37 को स्थानीयकृत दिखाया।

पीएमए पीकेसी सक्रियण के माध्यम से एक शक्तिशाली आरओएस इंड्यूसर है, इस प्रकार आत्मघाती (लिटिक) नेट गठन को प्रेरित करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। पीएमए-प्रेरित एनईटी की छवियां आत्महत्या मार्ग (चित्रा 3 ए 4-6) से जुड़ी क्लाउड जैसी संरचनाओं का निर्माण करने वाले प्रचुर क्रोमैटिन डीकंडेनसेशन वाले नेटवर्क दिखाती हैं, जिसमें विश्लेषण किए गए क्षेत्र के बड़े अनुपात को कवर करने वाले बाह्य अंतरिक्ष में प्रचुर मात्रा में डीएनए जारी होने के कारण न्यूट्रोफिल मर जाता है। डीएनए को कवर करने वाले इन बादल वाले क्षेत्रों के भीतर, एलएल 37 को उच्च सांद्रता (चित्रा 3 ए 6, बी-सी) में इंट्रा- और बाह्य रूप से सह-स्थानीयकृत किया गया था। इसके विपरीत, एचओसीएल एक शारीरिक, जैव रासायनिक यौगिक है जो एमपीओ की ऑक्सीडेटिव गतिविधि के उत्पाद के रूप में उत्पन्न होता है। एचओसीएल के साथ गठित एनईटी ने फिलामेंटस आकृति विज्ञान के साथ बाह्य अंतरिक्ष में मामूली डीएनए फैलाव दिखाया जो कोशिका झिल्ली से प्राप्त होता है (चित्रा 3 ए 7-9)। इस तरह की आकृति विज्ञान विशेषताएं महत्वपूर्ण नेट गठन के अनुरूप हैं, और उन्होंने डीएनए फिलामेंट्स के साथ एलएल 37 के सह-स्थानीयकरण को नहीं दिखाया; एलएल 37 परमाणु स्तर पर स्थानीयकृत रहा (चित्रा 3 ए 7-9, सी)। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि समान नियंत्रित परिस्थितियों में, ये रासायनिक एजेंट जारी किए गए एनईटी की संरचना में विचलन दिखाते हैं, दोनों डीएनए और एलएल 37।

सूक्ष्मजीवों द्वारा प्रेरित एनईटी के विश्लेषण से पता चला है कि सी अल्बिकन्स के स्यूडोहिफे ने फिलामेंटस संरचनाओं के साथ बाह्य अंतरिक्ष में जारी डीएनए की कम सांद्रता के साथ नेटवर्क को प्रेरित किया, जो महत्वपूर्ण नेट गठन (चित्रा 3 ए 10-13) की विशेषता वाले एन्यूक्लिएटेड साइटोप्लास्ट जैसी संरचनाओं की उपस्थिति को उजागर करता है, जो एचओसीएल और एस ऑरियस के साथ नहीं देखे जाते हैं। जो इस मार्ग को सक्रिय करता है। इस बीच, एलएल 37 सेलुलर स्तर पर डीएनए के साथ सह-स्थानीयकरण करता है, और कम सांद्रता स्यूडोहिफे से जुड़ी होती है, जिससे उनके प्रसार का परिसीमन होता है। दोनों घटकों ने एचबीएसएस (चित्रा 3 बी, सी) के साथ नियंत्रण से सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। ऑरियस दुनिया भर में सबसे आम रोगजनक बैक्टीरिया में से एक है, जिसमें एनईटी को प्रेरित करने की क्षमता एक महत्वपूर्ण जैसी आकृति विज्ञान दिखाती है जैसा कि पहले कईअध्ययनों में बताया गया था। प्रचुर मात्रा में डीएनए को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण सांद्रता में फिलामेंटस संरचनाओं के रूप में जारी किया गया था जो एलएल 37 के साथ मिलकर बने थे और जीवाणु समूहों का गठन करते थे, यह दर्शाता है कि मचान बैक्टीरिया के उन्मूलन को सीमांकित और अनुकूलित कर सकता है (चित्रा 3 ए 14-17)। एरुगिनोसा ने आत्महत्या नेट गठन से जुड़े बादल आकृति विज्ञान के साथ डीएनए की बड़ी सांद्रता की रिहाई को प्रेरित किया, और एलएल 37 ने डीएनए और बैक्टीरिया (चित्रा 3 ए 18-21, बी, सी) के साथ काफी सह-स्थानीयकरण किया।

फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा एनईटी के विज़ुअलाइज़ेशन से पता चला कि एचओसीएल, एस ऑरियस और सी अल्बिकन्स द्वारा प्रेरित एनईटी फिलामेंटस संरचनाओं के साथ महत्वपूर्ण जैसी आकृति विज्ञान प्रस्तुत करते हैं। हालांकि, केवल एस ऑरियस ने सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मात्रा में डीएनए की रिहाई का नेतृत्व किया। अन्य दो उत्तेजनाओं (पीएमए और पी एरुगिनोसा) -प्रेरित एनईटी की आकृति विज्ञान आत्महत्या नेट गठन के प्रकार से मेल खाती है, जिसमें सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मात्रा में डीएनए और एलएल 37 की तुलना में अनियंत्रित न्यूट्रोफिल की तुलना में होती है। प्रचुर मात्रा में बादल जैसी डीएनए संरचनाएं थीं, जो पीएमए द्वारा प्रेरित लोगों की तुलना में पी एरुगिनोसा द्वारा प्रेरित एनईटी में अधिक महत्वपूर्ण थीं।

Figure 3
चित्र 3: रासायनिक और माइक्रोबियल उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित एनईटी की डीएनए और एलएल 37 संरचना और आकृति विज्ञान। (A) मानव रक्त-व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल को PMA (4-6), HOCl (7-9), C. अल्बिकन्स के स्यूडोहिफे (10-13), S. Aureus (14-17), P. Aruginosa (18-21), और HBSS में एक उत्तेजित नियंत्रण (1-3) के साथ उत्तेजित किया गया था। या आइसोटाइप नियंत्रण, और सूक्ष्मजीवों को 5 μM CFSE (हरा) के साथ पूर्व-दाग दिया गया था। छवियां तीन प्रतियों में किए गए 10 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परिणाम दिखाती हैं। (बी-सी) ग्राफ प्रति अच्छी तरह से पांच छवियों (चार चरम सीमाओं और केंद्र) के संकेतित रंगों के लिए प्रति क्षेत्र सिग्नल के औसत ग्रे मूल्य के एसडी के औसत ± एसडी दिखाते हैं और (बी) डीएपीआई-डीएनए और (सी) एलेक्सा फ्लोर 594-एलएल 37 धुंधला होने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया जाता है। एनोवा 95% के आत्मविश्वास स्तर के साथ प्रयोगात्मक स्थितियों के समूहों की तुलना करने के लिए किया गया था। * = पी ≤ 0.05। एचबीएसएस = हांक का संतुलित नमक समाधान; पीएमए = फोरबोल माइरिसिट एसीटेट; एचओसीएल = हाइपोक्लोरस एसिड। अनुमति के साथ सोसा-लुइस एट अल.16 से अनुकूलित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रासायनिक और सूक्ष्मजीवविज्ञानी उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित एनईटी में एनई, सीजी और एमपीओ की एंजाइमेटिक गतिविधि
इस अध्ययन का एक अन्य उद्देश्य एनईटी में केंद्रीय घटकों के रूप में वर्णित एंजाइमों की गतिविधि को निर्धारित करना था, जैसे एनई, सीजी और एमपीओ, जो एज़ुरोफिलिक कणिकाओं से प्राप्त रोगाणुरोधी गतिविधि के साथ प्रचुर मात्रा में हैं। इसलिए, एनईटी को प्रेरित किया गया था और सेल नेटवर्क को डीनेस के साथ इलाज किया गया था, जो संरचना से जुड़े प्रोटीन की रिहाई का पक्ष लेता था, और एंजाइम गतिविधि को कलरिमेट्रिक परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। विश्लेषण में एनई (2.3% ± 0.6%), सीजी (6.2% ± 2.7%), और एमपीओ (21.4% ± 2.0%) के लिए अवशिष्ट गतिविधि दिखाई गई, जो सभी एनईटी से प्राप्त डीएनए संरचनाओं से जुड़ी थी, जबकि लाइस्ड रेस्टिंग न्यूट्रोफिल से प्राप्त अधिकतम गतिविधि 100% के रूप में ली गई थी (चित्रा 4)। अधिकांश उत्तेजनाओं से प्रेरित एनईटी ने एनई और सीजी के लिए कम एंजाइम गतिविधि मूल्य दिखाए, एनई के लिए एस ऑरियस और सीजी के लिए पीएमए को छोड़कर, जिसने सांख्यिकीय महत्व दिखाया। दूसरी ओर, एमपीओ गतिविधि उनके बीच किसी भी सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर के बिना सभी उत्तेजनाओं में बढ़ी, लेकिन रासायनिक उत्तेजनाओं बनाम सूक्ष्मजीवों के समूहों के बीच महत्वपूर्ण थी।

ये परिणाम प्रस्तुत प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करते हैं, जो डीएनए, एलएल 37, और एंजाइम गतिविधि (एनई, सीजी और एमपीओ) को समान इन विट्रो स्थितियों के तहत विभिन्न उत्तेजनाओं के साथ निर्धारित करके नेट संरचना में विषमता पर जानकारी प्रदान करते हैं। परिणाम बताते हैं कि न्यूट्रोफिल अलग-अलग और विशेष रूप से नेट गठन के दौरान विभिन्न रोगाणुरोधी प्रोटीन के साथ उपयुक्त डीएनए संरचनाओं का निर्माण करके प्रत्येक उत्तेजना का जवाब दे सकते हैं।

Figure 4
चित्रा 4: रासायनिक और माइक्रोबियल उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित एनईटी में अवशिष्ट एंजाइमेटिक गतिविधि। डीनेस द्वारा डीएनए-प्रोटीन संरचनाओं को अलग करने के बाद एनईटी में एंजाइमेटिक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए कलरमेट्रिक परख का उपयोग किया गया था ताकि केवल नेट-बाध्य प्रोटीन का विश्लेषण किया जा सके। ग्राफ प्रत्येक रासायनिक या माइक्रोबियल उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित एनईटी में अवशिष्ट एंजाइमेटिक गतिविधि के प्रतिशत का औसत ± एसडी दिखाता है, जो एनई के लिए प्राप्त अधिकतम एंजाइमेटिक गतिविधि (-70 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज-पिघलने से उत्पन्न न्यूट्रोफिल के सुपरनैटेंट में), सीजी (34.90 ± ± 25.85 यू / एमएल), और एमपीओ (0.29 ± 0.13 यू / एमएल) के लिए प्राप्त किया जाता है। बेसल एचबीएसएस बफर में रखे न्यूट्रोफिल के सुपरनैटेंट में एंजाइमेटिक गतिविधि को दर्शाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण एनोवा द्वारा 10 स्वतंत्र प्रयोगों के डेटा के साथ किया गया था ताकि 95% के आत्मविश्वास स्तर के साथ प्रयोगात्मक स्थितियों के समूहों की तुलना की जा सके। * और ** = पी अन्य सभी उत्तेजनाओं की तुलना में 0.05 ≤। = पी ≤ 0.05 उत्तेजनाओं के संकेतित समूहों की तुलना करते हैं। एनई = न्यूट्रोफिल इलास्टेस; सीजी = कैथेप्सिन जी; एमपीओ = मायलोपेरोक्सीडेज; पीएमए = फोरबोल माइरिसिट एसीटेट; एचओसीएल = हाइपोक्लोरस एसिड। अनुमति के साथ सोसा-लुइस एट अल.16 से अनुकूलित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एनईटी की रिहाई को प्रेरित करने के लिए व्यवहार्य न्यूट्रोफिल की एक अत्यधिक शुद्ध आबादी प्राप्त की जानी चाहिए क्योंकि इन कोशिकाओं में औसतन 8 घंटे का सीमित पूर्व विवो जीवनकाल होता है, एक अवधि जिसके भीतर सभी प्रयोग किए जाने चाहिए। इसके लिए, आदर्श पद्धति गैर-सक्रिय कोशिकाओं को बहिर्जात उत्तेजना के प्रति अधिक उत्तरदायी बनाकर शुद्धिकरण समय को अनुकूलित करने के लिए डबल-घनत्व ढाल है, जो फिकोल-हिस्टोपैक ढाल या डेक्सट्रान अवसादन तकनीक17 के विपरीत है। डबल-घनत्व ढाल विधि का एक और लाभ उच्च शुद्धता सेल संवर्धन तकनीकों जैसे फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) और चुंबकीय रूप से सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) की तुलना में इसकी अपेक्षाकृत कम लागत है जो सेल सतह एंटीजन पर निर्भर करते हैं, जैसे कि न्यूट्रोफिल में सीडी 16हाय । उच्च लागत के अलावा, ये छंटाई विधियां एंटीबॉडी-एंटीजन इंटरैक्शन के दौरान लक्ष्य कोशिकाओं के अनपेक्षित सक्रियण का कारण बन सकती हैं, और न्यूट्रोफिल के पूर्व विवो समय को बढ़ा सकती हैं, क्योंकि इन दो तकनीकों का उपयोग आमतौर पर घनत्व ढाल शुद्धिकरण के बाद किया जाता है। सेल आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता शुद्ध न्यूट्रोफिल में परिवर्तन को खारिज करते हैं और पुष्टि करते हैं कि देखे गए परिवर्तन उत्तेजना के बिना समान प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत अतिरिक्त उत्तेजनाओं बनाम आराम करने वाले न्यूट्रोफिल के जवाब में विशिष्ट हैं (चित्रा 2)। यह सेल व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान को बदलने के बिना न्यूट्रोफिल अलगाव के लिए एक सड़न रोकनेवाला और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि के रूप में प्रोटोकॉल की दक्षता की पुष्टि करता है। ईोसिनोफिल का यह योगदान, जो आमतौर पर 2% से कम गिनती के साथ रक्त में पाया जाता है, को खारिज कर दिया गया था और परिणामों के सांख्यिकीय महत्व को नहीं बदला था, क्योंकि विभिन्न क्षेत्रों का विश्लेषण करते समय राइट के धुंधला होने पर नमूने में ईोसिनोफिल नहीं देखा गया था (चित्रा 2 ए)। सीडी 16 मार्कर का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा इसकी पुष्टि की जा सकती है, जो ईोसिनोफिल में मौजूद नहीं है लेकिन न्यूट्रोफिल में उच्च सांद्रता में मौजूद है।

एनईटी के अध्ययन में, आम सहमतिऔर विसंगतियां हैं; विभिन्न अध्ययनों ने एक ही उत्तेजना के जवाब में विरोधाभासी परिणामों की सूचना दी है, जो न्यूट्रोफिल अलगाव प्रोटोकॉल में अंतर के कारण हो सकता है, लंबे समय तक प्रयोग समय जो न्यूट्रोफिल को अनायास सक्रिय करता है, बफर, और एक ही उत्तेजना की विभिन्न सांद्रता का उपयोग किया जाता है। इसलिए, प्रोटोकॉल को स्पष्ट विवरण के साथ समरूप करना आवश्यक है ताकि प्रोटोकॉल को तुलना की अनुमति देने के लिए लगातार दोहराया जा सके। उपयोग किए जाने वाले सबसे आम तरीके इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री हैं, जो ग्रेन्युल-व्युत्पन्न प्रोटीन18 के साथ बाह्य डीएनए कोलोकलाइजिंग वाली संरचनाओं की पहचान करने में सक्षम हैं, जिसमें आमतौर पर जीवाणुनाशक गतिविधि वाले घटक शामिल होते हैं जो विषाणु कारक8, जैसे एनई, एमपीओ, सीजी और एलएल 37 को नष्ट करने में सक्षम होते हैं। इसके अतिरिक्त, नेट गठन की निगरानी के लिए हाल के अध्ययन वास्तविक समय लाइव-सेल विधियों जैसे इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी1,18 का उपयोग करके इस प्रक्रिया का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं। इस अध्ययन जैसे कुछ अध्ययन विभिन्न उत्तेजनाओं (बैक्टीरिया, कवक और रसायनों) 1,9 के तहत एनईटी की संरचना की तुलना करने के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों को एकजुट करते हैं, डीएनए-डीएपीआई, एलएल 37-एलेक्सा 594 के फैलाव की कल्पना करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की तकनीक का उपयोग करते हैं, और सूक्ष्मजीवों-सीएफएसई के साथ इसके सह-स्थानीयकरण। इसी तरह, DNase के साथ उपचार केवल उन प्रोटीनों को जारी करता है जो एनईटी की डीएनए संरचना से जुड़े होते हैं, इसलिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक तकनीक एमपीओ, एनई और सीजी की एंजाइमेटिक गतिविधि को निर्धारित करना सुनिश्चित करती है, जिससे पता चलता है कि वे अपघटन से आते हैं।

नेट आकृति विज्ञान को आत्मघाती या महत्वपूर्ण के रूप में परिभाषित किया जा सकता है, जिसमें बाह्य अंतरिक्ष में डीएनए द्वारा अपनाए गए फैलाव के अनुसार उन्हें अलग करने की संभावना है। आत्मघाती मार्ग को बादल जैसी संरचना की विशेषता है, जबकि महत्वपूर्ण मार्ग एक फिलामेंटस फॉर्म 15,19,20 है। इसके आधार पर, चित्रा 3 इंगित करता है कि पीएमए और पी एरुगिनोसा एक आत्मघाती नेट प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं। ये परिणाम हमारी स्थितियों के तहत इस तकनीक को दोहराते हैं, जिसे ब्रिंकमैन एट अल द्वारा पीएमए के साथ वर्णित किया गया था, जो सी-आरएएफ, एमईके, एकेटी, ईआरके और प्रोटीन काइनेज सी (पीकेसी) के सक्रियण को ट्रिगर करके एनईटी को प्रेरित करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला यौगिक है, जो बदले में एनएडीपीएच ऑक्सीडेज11 को सक्रिय करता है और इंट्रासेल्युलर आरओएस में तेज वृद्धि का कारण बनता है। इसके अलावा, परिणाम इस संभावना को खारिज करते हैं कि बाहरी कलाकृतियों, इनक्यूबेशन बार, या इस अध्ययन में उपयोग किए गए संक्षिप्त यांत्रिक आंदोलन ने बादल जैसी उपस्थिति के साथ एनईटी की सहज इन विट्रो रिलीज का कारण बना, जैसा कि कुछ लेखकों नेउल्लेख किया है, क्योंकि 4 घंटे के बाद उत्तेजना के बिना न्यूट्रोफिल को आराम देने से बरकरार क्रोमैटिन के साथ एक मल्टीलोबेड नाभिक दिखाई देता है (चित्रा 3 ए 1-3)।

इसी तरह, एनईटी एचओसीएल, सी के साथ प्रेरित है। अल्बिकन्स, और एस। ऑरियस ने फिलामेंटस आकृति विज्ञान प्रस्तुत किया, जो महत्वपूर्ण नेट आकृति विज्ञान (चित्रा 3 ए 7-17) के अनुरूप था। इस मार्ग को कोशिका लाइसिस के बिना एक अद्वितीय और ऑक्सीडेंट-स्वतंत्र तरीके से प्रतिक्रिया देने वाले न्यूट्रोफिल या यहां तक कि प्लाज्मा झिल्ली के टूटने की विशेषता है, केवल परमाणु डीएनए15 के साथ पुटिकाओं का उदय होता है। यह परिणाम फिर से इस तकनीक की क्षमता को मान्य करता है ताकि नेट उत्पादन के दोनों रूपात्मक दिखावे को आत्मघाती या महत्वपूर्ण माना जा सके। नेट संरचना के संबंध में, इस पद्धति का उपयोग करके प्राप्त परिणामों ने पीएमए और पी एरुगिनोसा उत्तेजना (चित्रा 3 सी) के लिए एलएल 37 की अंतर आवश्यकताओं में सांख्यिकीय महत्व दिखाया। एनई (केवल एस ऑरियस के लिए) और एमपीओ गतिविधि सूक्ष्मजीवों बनाम रासायनिक समूह (चित्रा 4) में अधिक थी। यह जानकारी फिर से प्रत्येक उत्तेजना का जवाब देने में न्यूट्रोफिल चयनात्मकता साबित करती है, जैसा कि केनी एट अल.5 द्वारा बताया गया है जब विट्रो में नेट उत्पादन में विभिन्न उत्तेजनाओं की तुलना की जाती है। यह वर्णित किया गया था कि कुछ मामलों में नेट के उत्पादन को आरओएस की आवश्यकता होती है या पीएडी 4 जैसे विशिष्ट एंजाइमों की अंतर आवश्यकताएं होती हैं, जबकि दूसरों में इन अणुओं की उपस्थिति उनके उत्पादनके लिए अप्रासंगिक है।

इस अध्ययन में वर्णित बाह्य अंतरिक्ष में डीएनए को निर्धारित करने की तकनीक की एक सीमा यह है कि डीएनए एक नेक्रोटिक मोर्फोटाइप के साथ कोशिका मृत्यु के अन्य रूपों से भी आ सकता है, और इस तकनीक के लिए उनके बीच अंतर करना असंभव है। हालांकि, यह बताया गया है कि दानेदार प्रोटीन18 की उपस्थिति की पुष्टि करके एनईटी को इस प्रक्रिया से अलग किया जा सकता है। इसी तरह, डीएनए की उत्पत्ति अज्ञात है, जिसे पीसीआर19 द्वारा ऑर्गेनेल-विशिष्ट, माइटोकॉन्ड्रियल या परमाणु जीन को बढ़ाकर पुष्टि की जा सकती है। एक और कमजोरी एनईटी को फाइब्रिन जैसे अन्य रेशेदार संरचनाओं से अलग कर रही है; इस तरह के विवेक के लिए परिष्कृत तकनीकों की आवश्यकता होगी जैसे कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी20। निष्कर्ष में, प्रस्तुत तकनीकें विभिन्न उत्तेजनाओं के साथ प्रेरित एनईटी की संरचना और आकृति विज्ञान के इन विट्रो लक्षण वर्णन (समान परिस्थितियों में) की अनुमति देती हैं, जो एक विशिष्ट उत्तेजना के लिए उनके कुछ घटकों (डीएनए, एलएल 37, एनई, सीजी, एमपीओ) की रिहाई में न्यूट्रोफिल की चयनात्मकता दिखाती हैं। इन तकनीकों को ऐसी नेट विशेषताओं पर बहिर्जात घुलनशील कारकों या सेलुलर संपर्क के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को कोनासाइट से एक बुनियादी विज्ञान अनुदान (# 285480) और जैव रासायनिक विज्ञान संकाय के क्लिनिकल इम्यूनोलॉजी रिसर्च विभाग द्वारा समर्थित किया गया था। ए.ए.ए., एस.ए.एस.एल. और डब्ल्यू.जे.आर.आर. के पास क्रमशः कोनासाइट नंबर # 799779, # 660793 और # 827788 की डॉक्टरेट फैलोशिप है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 Well plate for cell culture Corning 3526
7-aminoactinomycin D (7-AAD) BD Pharmingen 51-668981E
96 Well plate for cell culture Costar 3596 Flat bottom
Agitator CRM Globe CRM-OS1
Antibody LL37 Santa Cruz Biotechnology sc-166770
Blood collection tubes BD VACUTAINER 368171 K2 EDTA 7.2 mg
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) Sigma-Aldrich 21878
Centrifuge Hettich 1406-01
Coverslip Madesa M03-CUB-22X22 22 mm x 22 mm
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) Caisson 1201022
Falcon tubes 50 mL CORNING 430829
Flow Cytometry Tubes Miltenyi Biotec 5 mL - Without caps
FlowJo Software BD Biosciences Analyze flow cytometry data
Fluorescence microscope DM 2000 LEICA
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057
Incubator NUAIRE UN-4750
MACSQuant Analyzer Miltenyi Biotec Flow cytometer
Microplate reader photometer Clarkson Laboratory - CL
Microtubes 1.5 mL Zhejiang Runlab Tech 35200N wire snap
Minitab Software Minitab Statistical analysis
Needles BD VACUTAINER 301746 Diameter 1.34 mm
Optical microscope VELAB VE-B50
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Solution for density gradient
Phosphate Buffered Saline (10x) Caisson PBL07-500ML
Pyrex culture tubes CORNING CLS982025 N°9820
RPMI 1640 1x Corning 10-104-CV contains Glutagro
Slides Madesa PDI257550 22 mm x 75 mm
Trypan Blue solution 0.4% SIGMA T8154-100ML

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References

  1. De Buhr, N., Maren, K. B. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
  2. Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
  3. Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. eLife. 6, 24437 (2017).
  6. Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection. Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).
  7. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  8. Delgado-Rizo, V., et al. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).
  9. Petretto, A., et al. Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis. PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).
  10. Neumann, A., et al. Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases. Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).
  11. Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
  12. Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. NETosis in wound healing: When enough Is enough. Cells. 10 (3), 494 (2021).
  13. Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).
  14. Clark, S. R., et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).
  15. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  16. Sosa, S. A., et al. Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus. Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).
  17. White, P. C., et al. Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).
  18. Boeltz, S., et al. To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
  19. Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).
  20. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 189
माइक्रोबियल और रासायनिक उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप का रूपात्मक और रचनात्मक विश्लेषण
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Almaraz-Arreortua, A., Sosa-Luis, S. A., Ríos-Ríos, W. d. J., Romero-Tlalolini, M. d. l. Á., Aguilar-Ruiz, S. R., Baltiérrez-Hoyos, R., Torres Aguilar, H. Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli. J. Vis. Exp. (189), e64522, doi:10.3791/64522 (2022).

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