Summary
نقدم هنا طريقة لدراسة سبات خنفساء البطاطس في كولورادو في ظل الظروف الطبيعية للمنطقة المعتدلة بالإضافة إلى تقنية لجمع الخنافس في الشتاء. تسمح هذه الطريقة بالحصول على العدد المطلوب من الأفراد الذين يقضون الشتاء لإجراء تحليلات مختلفة في أي مرحلة من مراحل السبات.
Abstract
واحدة من الآفات الرئيسية للبطاطس Solanum tuberosum L. في المنطقة المعتدلة هي حشرة خنفساء البطاطس كولورادو (CPB). تجرى معظم الدراسات حول مناعة وأمراض CPB خلال مراحل التغذية النشطة. ومع ذلك ، هناك عدد أقل من الدراسات حول مراحل الراحة ، على الرغم من أن هذه الخنافس تقضي معظم دورة حياتها في حالة توقف الشتاء (السبات). في هذا العمل ، تم تطوير واختبار طريقة للتحقيق في سبات CPB في ظل الظروف الطبيعية ، مما يتيح فرصة لجمع عدد كاف من الأفراد في فصل الشتاء. في هذه المقالة ، تم تقييم بقاء CPB ، وتم تحديد العوامل المعدية في مراحل مختلفة من السبات. وزاد معدل الوفيات الناجمة عن انخفاض معدل وفيات الشلل الانفجاري خلال فترة السبات، حيث بلغ الحد الأقصى في نيسان/أبريل وأيار/مايو. تم عزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (Beauveria و Isaria و Lecanicillium) والبكتيريا Bacillus و Sphingobacterium و Peribacillus و Pseudomonas و Serratia من الحشرات الميتة. كان معدل بقاء الخنافس طوال فترة السبات 61٪. لم يتم العثور على خنافس مجمدة أو مجففة ، مما يشير إلى نجاح الطريقة المقدمة.
Introduction
تعتبر خنفساء البطاطس في كولورادو Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) آفة مهمة لنباتات Solanaceae ، ومعظمها البطاطس Solanum tuberosum L. النطاق الجغرافي لهذا النوع هو أكثر من 16 مليون كم2 ويتوسع باستمرار1. يحتوي CPB على توقف شتوي اختياري ، والسبات إلزامي في المنطقة المعتدلة. يحدث الانقطاع المؤقت بسبب فترة ضوئية قصيرة اليوم ويتم تعديله بواسطة درجة الحرارة1. تقضي هذه الخنافس الشتاء في مرحلة البلوغ عن طريق الحفر في التربة. مع زيادة خطوط العرض ، تمتد مدة فترة السبات. في المنطقة المعتدلة ، خاصة في المناطق الشمالية من مداها ، يستمر فصل الشتاء لمدة تصل إلى 9 أشهر: من أغسطس إلى سبتمبر حتى مايو ويونيو (Noskov et al. ، ملاحظات شخصية). خلال هذه الفترة ، تتعرض CPB - تماما مثل أي حشرة أخرى في المنطقة المعتدلة - لظروف الشتاء غير المواتية ويجب أن تزيد من تحملها للبرد. في الوقت نفسه ، يزيد ملامسة الخنافس للتربة من خطر الإصابة بمختلف الكائنات الحية الدقيقة الانتهازية والمسببة للأمراض2. لذلك ، تحتاج هذه الخنافس إلى الحفاظ على مستوى معين من نشاط الجهاز المناعي أثناء السبات ، وهو أمر مكلف أيضا بالطاقة. ومع ذلك ، حتى لو نجت الحشرة من العدوى ، فقد يقلل المرض من صلابتها الباردة3. تجدر الإشارة إلى أن انخفاض درجة الحرارة ليس هو السبب الوحيد لوفيات الشتاء من CPB. يلعب نقص الأكسجين دورا مهما أيضا ، وفي ظل بعض الظروف ، يمكن أن يكون العامل الرئيسي لوفيات الشتاء 4,5.
من المعروف أن معدل الوفيات الشتوي الطبيعي ل CPB يمكن أن يكون مرتفعا جدا ، حيث يصل إلى 100٪ في التربة الطينيةالطينية 6. وبالتالي ، فإن فصل الشتاء هو واحد من أكثر الفترات أهمية في دورة حياة CPB. ومع ذلك ، لا تزال البيانات المتعلقة بعلم وظائف الأعضاء ، ونشاط الجهاز المناعي ، والبقاء على قيد الحياة ، وغيرها من المعلمات لسبات CPB في ظل الظروف الطبيعية محدودة. هناك دراسات حول التعبير الجيني التفاضلي والمعلمات الفسيولوجية المختلفة في البالغين CPB أثناء التوقف واستجابة للصدمة الباردة7،8،9،10،11،12 ؛ ومع ذلك ، فقد تم إجراء هذه التحليلات بشكل أساسي عن طريق تحريض الإجهاد المؤقت أو البارد في ظل ظروف المختبر دون تقلبات طبيعية في درجة الحرارة والرطوبة وحمل مسببات الأمراض المحلية. ومع ذلك ، فإن البحث في فسيولوجيا هذه الخنافس التي تم جمعها عن طريق التنقيب من التربة في ظل الظروف الطبيعية أمر مهم. تمت دراسة جوانب مختلفة من CPB overwintering في ظل الظروف الطبيعية بنشاط في سبعينيات القرن العشرين-ثمانينيات القرن العشرين13،14،15،16،17،18. من ناحية أخرى ، لم تتضمن هذه الدراسات حفر CPB من التربة في الشتاء. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم توفير تقنية للإسبات المتحكم فيه ل CPB ووصف الأقفاص بالتفصيل. وبالتالي ، هناك حاجة إلى التحقيق في فسيولوجيا CPBs التي تقضي الشتاء في البيئات الطبيعية19.
كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير واختبار طريقة للسبات الخاضع للرقابة للبالغين CPB في ظل الظروف الطبيعية. تسمح الطريقة المقترحة بالحصول على العدد المطلوب من أفراد CPB للفحوصات الميكروبيولوجية والمناعية وغيرها أثناء السبات في ظل الظروف الميدانية للمناخ القاري. يمكن تكييف هذه الطريقة وتطبيقها على أنواع الحشرات الأخرى التي تقضي الشتاء في التربة تحت الثلج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. وصف أقفاص السبات
ملاحظة: اعتمادا على أهداف التجربة ، يختلف عدد الأقفاص. استخدم ثلاثة أقفاص على الأقل لكل تاريخ أخذ العينات. لتقدير عدد الخنافس التي ستظهر ، قم بإعداد ثلاثة أقفاص إضافية على الأقل ، والتي لن يتم إخراجها من التربة حتى الربيع.
- استخدم أقفاصا مصنوعة من إطار خشبي صلب بحجم 25 × 25 × 40 سم (الطول × العرض × الارتفاع).
- لبناء إطار للقفص ، استخدم شرائح خشبية بسمك 2 سم على الأقل وعرض 4 سم.
- قم بتغطية الجزء الداخلي من القفص بشبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ بحجم فتحات لا يزيد حجمها عن 5 مم × 3 مم. استخدم دباسة خشبية لإصلاح الشبكة.
- ثبت شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ إلى الخارج من الأسفل باستخدام الدباسة.
- قم بتبطين الجزء الداخلي من القفص بنسيج أرضي صناعي أسود بكثافة 60 جم / م2.
ملاحظة: يعمل التكسية الأرضية كحاجز إضافي لمنع هروب الخنافس. لا تستخدمه في التجارب المتعلقة بتحريك مسببات الأمراض الحشرية والطفيليات بنشاط. - نعلق بإحكام أنبوب من النسيج الصناعي الشفاف تنفس حوالي 60 سم إلى أعلى القفص.
- اعبر وثبت حبلين قويين في قاع القفص لسحبه من التربة عند الحاجة.
2. تركيب الأقفاص
- احفر حفرة بعمق 40 سم في التربة وضع القفص بالداخل.
- وضع العشب الجاف أو القش على الحفرة.
- ضع القفص بالداخل بحيث يكون القش أو العشب الجاف بين جدران القفص والتربة.
- املأ الأقفاص بالتربة من نفس حقل البطاطس حيث يتم جمع الحشرات.
- قم بتركيب أجهزة تسجيل بيانات درجة الحرارة والرطوبة المقاومة للماء في الأقفاص على الأعماق المطلوبة.
ملاحظة: يمكن استخدام مسجلات البيانات من أي مصنع ويجب أن تكون قادرة على العمل في درجات حرارة منخفضة. - ازرع شتلات البطاطس داخل كل قفص قبل 3-4 أسابيع من إدخال الخنافس وسقيها بشكل معتدل.
- ثبت أنبوبا من القماش الصناعي عموديا على عصا من أي مادة مثبتة على السطح الخارجي للقفص.
3. تربية الحشرات قبل فصل الشتاء
- اجمع الخنافس البالغة يدويا في حقول البطاطس الخالية من المبيدات الحشرية قرب نهاية نباتات البطاطس.
ملاحظة: تختلف الخنافس البالغة اختلافا كبيرا عن اليرقات وتتميز بالإليترا المخططة ، في حين أن اليرقات حمراء. - احتفظ بالخنافس المجمعة في دلاء بلاستيكية سعة 15-20 لترا (200 فرد كحد أقصى لكل دلو) تحتوي على قمم بطاطس لتغذية الحشرات قبل وضعها في الأقفاص.
- تغطية الدلاء بنسيج تنفس.
ملاحظة: لا تحتفظ بالحشرات في دلاء لأكثر من 12 ساعة. استخدم قمم بطاطس كبيرة بما يكفي لمنع تراكم الخنافس في قاع الدلاء. - ضع ما لا يزيد عن 200 فرد من CPB على نباتات البطاطس المغطاة بشبكة النسيج الاصطناعية.
- عندما تستهلك قمم البطاطس ، أضيفي أخرى طازجة موضوعة في وعاء بلاستيكي يحتوي على الماء وقم بتغيير قمم البطاطس يوميا بعد ذلك.
ملاحظة: لإصلاح السيقان في جرة ، استخدم الصوف القطني والبارافيلم. تحقق بعناية من السيقان القديمة بحثا عن الخنافس عند إزالتها. - بمجرد حفر جميع الخنافس في التربة لفصل الشتاء ، قم بفك أنبوب النسيج الصناعي من العصا ووضع القماش.
4. جمع الحشرات خلال فصل الشتاء
- إزالة الثلج فوق سطح القفص.
- قم بفك القفص على كل جانب بمجرفة قوية.
- اسحب القفص من التربة باستخدام الحبال.
- أحضر القفص إلى المختبر.
ملاحظة: اعتمادا على أهداف التجربة ، قد تضطر الخنافس السبات إلى أن تكون غير نشطة قبل التحليل. في هذه الحالة ، يجب أن تكون درجة الحرارة في المختبر أثناء عزل الخنافس من التربة ~ 2-5 °C. - قم بإزالة التربة من الصندوق في أجزاء صغيرة ، وقم بتفتيت قطع كبيرة من التربة بعناية ، وعزل الخنافس باستخدام الملقط.
- افصل الخنافس الحية عن الجثث. تخلق الخنافس الصحية الحية تربة مدمجة حولها ، وتشكل تجويف هواء (ما يسمى المهد) ، وبالتالي يمكن فصلها بسهولة عن التربة. الخنافس التي تقتلها الفطريات محنطة أو لها أفطورة مرئية على السطح. الحشرات المتحللة بكتريا مظلمة.
- نخل التربة من خلال غربال للتأكد من عزل جميع الخنافس وعدم تلفها.
- ضع الجثث التي تظهر عليها أعراض العدوى الفطرية أو التحلل البكتيري في أنبوب طرد مركزي معقم فردي سعة 15 مل للتعرف عليه في المستقبل.
- قم بتخزين الخنافس الحية في الثلاجة عند درجة حرارة 0-2 درجة مئوية حتى يتم تحليلها في حاوية مغلقة التهوية تحتوي على كرة قطنية مبللة.
5. تحضير عينات الأعضاء والأنسجة
- لجمع الدملمف ، قم بعمل ثقب في الجزء الجانبي من البطن تحت elytra باستخدام إبرة الأنسولين.
ملاحظة: خلال فصل الشتاء ، يتم تقليل كمية الدملمف بشكل كبير ، مما يجعل من الصعب جمع هذا السائل. - لعزل القناة الهضمية ، قم بقطع كبسولة الرأس ، واضغط على جميع المحتويات في طبق بتري مع عازلة للفوسفات ، وافصل القناة الهضمية ، ونظفها من الدهون والأوعية المالبيغية.
- افصل الجزء المرغوب فيه من القناة الهضمية ، مثل الأمعاء الأمامية أو الأمعاء الوسطى أو الأمعاء الخلفية.
- لعزل الجسم الدهني ، افصله عن الأنسجة الأخرى بعد عزل الأمعاء.
ملاحظة: يمكن استخدام الأنسجة المعزولة لقياس نشاط الإنزيمات المضادة للأكسدة وإزالة السموم (مثال: الشكل التكميلي 1) ، أو تحليل تنظيم جينات مسار الإشارات المناعية (مثال: الشكل التكميلي 2) ، أو metabarcoding لمحتويات أمعاء الحشرات ، إلخ.
6. عزل الكائنات الحية الدقيقة من الجثث
- لعزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية من الجثث ، ضع الحشرات المحنطة في غرفة رطوبة معقمة.
- استخدم الكونيديا الهوائية (إن وجدت) أو التصلب من المحتويات الداخلية للخنافس للطلاء على أجار سكر العنب Sabouraud مع حمض اللبنيك 0.4٪.
ملاحظة: استخدم الخنافس مع الفطريات والكونيديا للطلاء على الفور (دون وضعها في غرف الرطوبة). - عزل البكتيريا من الجثث مع أعراض التحلل البكتيري.
- قطع رأس خنفساء ، والضغط على المحتويات الداخلية ، وجمعها في أنابيب للطلاء اللاحق على الوسائط للبكتيريا (لوريا بيرتاني أجار ، إندو أجار ، وأجار إسكولين الصفراوي).
ملاحظة: استخدم الفحص المجهري والطرق الجزيئية لتحديد أجناس وأنواع مسببات الأمراض. إذا لزم الأمر ، يمكن إجراء تحليل لوجود طفيليات أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر النتائج أدناه حول CPBs الشتوية درجة حرارة التربة والبقاء على قيد الحياة والالتهابات.
ديناميات درجة حرارة التربة.
تم تسجيل درجات حرارة أقل من الصفر في الأقفاص على عمق 30 سم من نهاية نوفمبر إلى بداية أبريل (الشكل 1). كان متوسط درجة الحرارة خلال هذه الفترة ناقص 3.3 ± 0.1 درجة مئوية (متوسط ± خطأ قياسي). وكانت أدنى درجة حرارة مسجلة 7.9 درجة مئوية تحت الصفر في منتصف فبراير.
البقاء على قيد الحياة من CPBs الشتوية.
شوهد معدل وفيات الحشرات أثناء السبات ووصل إلى الحد الأقصى في الربيع قبل ظهوره. كان العدد الأولي للخنافس 2000 ، نجا منها 1470 فردا بحلول نهاية مايو. كان معدل بقاء الخنافس أثناء السبات 61٪ (الشكل 2).
العدوى في CPBs في فصل الشتاء.
أظهر تحليل ل 530 خنفساء ميتة أنه خلال فترة السبات ، كان 53٪ منهم يعانون من أعراض التحلل البكتيري ، و 25٪ لديهم أعراض الالتهابات الفطرية (الشكل 3). سيطرت بوفيريا (45 عزلة) بين الثقافات المعزولة للفطريات المسببة للأمراض الحشرية. كانت Metarhizium و Cordyceps (= Isaria) و Lecanicillium أقل شيوعا (عزلتان لكل منهما). ومن بين البكتيريا المعزولة من الجثث التي تظهر عليها أعراض التحلل البكتيري (ن = 30)، تم تحديد الأنواع التي تنتمي إلى أجناس العصوية، وأبو الهول، والعصيباتير، والزائفة، وسيراتيا، ورانيلا، والجلوتاميسيباكتر (الجدول التكميلي 1).
الشكل 1: ديناميات درجة حرارة التربة. ديناميكيات درجة حرارة التربة كما تم قياسها بواسطة مسجل بيانات درجة حرارة مقاوم للماء مثبت على عمق 30 سم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: بقاء خنافس البطاطس في كولورادو الشتوية في فترات مختلفة من السبات. تم حفر الأقفاص ، وتم إحصاء الخنافس الباقية والميتة في نوفمبر ويناير وأبريل ومايو. تمثل القضبان عدد الخنافس الباقية. تشير الشعيرات إلى خطأ قياسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: العدوى في الشتاء جثث خنفساء البطاطس في كولورادو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المواد التكميلية: الرجاء النقر هنا لتنزيل الملفات التكميلية أدناه.
الشكل التكميلي 1. نشاط استرات غير محددة في منتصف الأمعاء من CPB أثناء السبات. شعيرات تدل على خطأ قياسي. تشير الأحرف المختلفة إلى اختلافات كبيرة بين النقاط الزمنية (اختبار دان ، P < 0.05).
الشكل التكميلي 2: تعديلات التعبير عن عامل النسخ NFkB (مسار IMD) في الأمعاء والجسم الدهني ل CPB أثناء السبات. يتم تقديم البيانات كتغييرات أضعاف بالنسبة إلى نقطة زمنية في أغسطس. تم استخدام Rp4 و Rp18 و Arf19 كجينات مرجعية. شعيرات تظهر خطأ قياسي.
الجدول التكميلي 1: التحديد المفترض لتسلسل جينات 16S rRNA (~ 800 bp) للبكتيريا المعزولة من CPB ميت أثناء السبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توضح هذه الدراسة أن الطريقة المقترحة لدراسة فصل الشتاء من CPBs تمكننا من الحصول على عدد كاف من الحشرات في فترات مختلفة من السبات. يعتمد نجاح التقنية المقدمة على عدة عوامل مستقلة ، أهمها الظروف الجوية. في فصل الشتاء البارد الخالي من الثلوج ، قد تتجمد التربة إلى عمق القفص بالكامل. في هذه الحالة ، يرتفع خطر وفاة جميع الخنافس بشكل ملحوظ18. يعتمد بقاء الخنفساء على مجموعة من العوامل العديدة ، والتي يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا من سنة إلى أخرى6.
في التجربة ، لم تنخفض درجة حرارة التربة داخل الأقفاص خلال فصل الشتاء عن 7.9 درجة مئوية تحت الصفر. لم يلاحظ أي جليد على عمق أكبر من 25 سم ، وظلت التربة فضفاضة حتى خلال فترة التبريد الأكبر (يناير-فبراير). تراكمت معظم الخنافس في الجزء السفلي من كل قفص ، على عمق 30-40 سم. ربما تكون الخنافس قد حفرت أعمق مع عمق أكبر للأقفاص. من ناحية أخرى ، فإن زيادة عمق القفص سيؤدي إلى زيادة الوزن ، مما يجعل من الصعب استخراج القفص من التربة ، خاصة في فصل الشتاء. علاوة على ذلك ، وفقا لملاحظاتنا في حقول البطاطس في المنطقة قيد الدراسة ، فإن CPB لا يحفر أعمق من 35 سم لقضاء فصل الشتاء. يمكن تفسير هذه النتيجة من خلال طبقة التربة الطينية على عمق 30-35 سم ، والتي لا تستطيع الخنافس التغلب عليها. في تجربتنا ، تم استخدام التربة الرملية الطميية من الأفق العلوي 30 سم. ربما هذا هو السبب في أن الخنافس كانت قادرة على الحفر أعمق مما كانت عليه في ظل الظروف الطبيعية. عادة ما يكون العمق الذي يسبت فيه CPB 10-25 سم (المرجع 1) ، ولكن هذا قد يختلف بين المناطق الجغرافية. على سبيل المثال ، في شمال شرق الولايات المتحدة (نيو جيرسي) ، تسبت معظم الخنافس على عمق 10-13 سم (المرجع 13). كما تم توثيق أعماق مماثلة للخنافس في فصل الشتاء (≤15 سم) في ولاية ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية18. في جنوب جبال الأورال (روسيا) ، يتراوح العمق الذي يحفر فيه CPB لفصل الشتاء بين 5-30 سم (المرجع 20). تجدر الإشارة إلى أن معدل بقاء الحشرات لا يرتبط دائما بشكل إيجابي بزيادة عمق الشتاء1. في الواقع ، في تجربة فصل الشتاء الميداني في إستونيا6 ، تبين أن معدل بقاء CPB كان أعلى على عمق 30 سم منه على عمق 50 سم. يقترح هؤلاء المؤلفون أن هذه النتيجة قد تكون بسبب نقص الأكسجين. تم الحصول على بيانات مماثلة في تجربة ميدانية في ولاية ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية18: تم تسجيل أعلى معدل للبقاء على قيد الحياة (51.5 ٪) من CPBs الشتوية على عمق 15-25 سم. في الوقت نفسه ، لوحظ18 ، وفيات 100 ٪ من الخنفساء على عمق 25-35 سم. نعتقد أن عمق 40 سم يكفي للتجارب في المنطقة المعتدلة لأن نسبة الخنافس الباقية كانت عالية ، ولم يمتد تجميد التربة إلى عمق القفص بالكامل. يساهم وجود الغطاء الثلجي في تقليل تبريد التربة. إذا لزم الأمر ، يمكن تعديل سمك الغطاء الثلجي فوق سطح الأقفاص.
نقطة رئيسية أخرى في البروتوكول هي احتمال عدم كفاية استعداد CPB لفصل الشتاء بسبب كمية صغيرة من المغذيات المخزنة. بقيت بعض CPBs البالغة على سطح التربة بعد الحفر الجماعي للخنافس في التربة. من المحتمل أنهم لم يخزنوا ما يكفي من الدهون لأن نجاح فصل الشتاء يعتمد أيضا على كمية العناصر الغذائية المتراكمة21. بالإضافة إلى ذلك ، عندما تمت إزالة الأقفاص من التربة في الشتاء ، كانت بعض الخنافس في حالة تجمد على سطح التربة أو في الطبقة القريبة من السطح. ربما كانت هذه هي الخنافس التي لم يكن لديها طاقة كافية للحفر بسبب سوء التغذية أو الالتهابات أو غيرها من العوامل الضارة. لاحظ Lashomb et al.13 في تجارب مع CPB overwintering أن ~ 15 ٪ من البالغين لم يحفروا في التربة لقضاء فصل الشتاء. ولم يناقش هؤلاء المؤلفون الأسباب. في أي حال ، من الضروري تزويد الخنافس بما يكفي من الطعام.
اعتمادا على أهداف الدراسة ، قد يكون من الضروري إبقاء الخنافس في حالة السبات بعد جمعها من التربة. تحقيقا لهذه الغاية ، يجب أن تكون درجة حرارة المختبر باردة ، ويجب وضع الخنافس على الفور في ظروف 0-2 درجة مئوية بعد الاستخراج من التربة. وقد لوحظ في عملنا أنه في الخريف والربيع ، تبدأ CPBs على الفور تقريبا النشاط الحركي بعد التنقيب عنها من التربة. تتم هذه العملية ببطء أكثر في منتصف الشتاء.
لم تأخذ هذه الدراسة في الاعتبار تحريك مسببات الأمراض الحشرية والطفيليات بنشاط. استخدمنا التكسية الأرضية كحاجز إضافي ضد انتشار CPB. لاحظ أنه لا ينبغي استخدام التكسية الأرضية في الأبحاث حول مسببات الأمراض الحشرية المتحركة بنشاط (على سبيل المثال ، الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية) أو الحيوانات المفترسة أو الطفيليات لأنها ستعيق حركتها من خلالها.
من المهم الإشارة إلى أن الدراسات حول مناعة وأمراض CPB تجرى في الغالب خلال مراحل التغذية النشطة. مراحل الراحة أقل تحقيقا وتم فحصها بشكل رئيسي في ظل ظروف المختبر. ومع ذلك ، في ظل هذه الظروف ، من الصعب محاكاة تقلبات درجة الحرارة والرطوبة والتهوية التي تحدث في مواقع التكاثر الطبيعية. وبالتالي ، فإن التجارب الميدانية هي الأفضل22. لتحديد أسباب وفيات الشتاء CPB في الحقل في فترات السبات المختلفة ، من الضروري حفر الخنافس الشتوية من التربة. أجريت دراسات على CPB overwintering في ظل الظروف الطبيعية بنشاط في سبعينيات القرن العشرين-ثمانينيات القرن العشرين. تتكون الطرق الموصوفة في تلك الأوراق بشكل أساسي من جمع وإحصاء الأفراد الذين يظهرون في الربيع 13 ، وتقييم فعالية استخدام الفطريات المسببة للأمراض الحشرية 14،15،16 أو الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية 15 قبل فصل الشتاء ، وجمع الخنافس الشتوية من التربة في الربيع والخريف لتحديد الوفيات الشتوية الطبيعية 17. في الوقت نفسه ، تراوحت أحجام وأشكال الأقفاص المستخدمة في تلك التجارب من 20×20 سم إلى 90×90×90 سم (المرجع 13) أو 180×60×30 سم (المرجع 18). وتجدر الإشارة إلى أن الدراسات المذكورة أعلاه لم تكن تهدف إلى تطوير منهجية CPB overwinter مع إمكانية جمع الحشرات في فصل الشتاء. على عكس الطرق الحالية ، فإن التقنية الموضحة في هذه المقالة تجعل من الممكن التحقيق في مجموعات CPB الطبيعية في فترة الثلوج.
في الختام ، تمكن الطريقة المقترحة الباحثين من الحصول على العدد المطلوب من أفراد CPB الذين يقضون الشتاء في ظل ظروف طبيعية مع معدل وفيات منخفض نسبيا للحشرات وبتكلفة منخفضة. يعد التحقيق في الجوانب المختلفة لسبات CPB أمرا ضروريا من وجهة نظر البحث الأساسية والتطبيقية: لتحسين مناهج مكافحة هذه الآفة. يمكن تكييف هذه التقنية مع أنواع الحشرات الأخرى التي تقضي الشتاء في التربة. قد يطبق الباحثون في المستقبل هذه الطريقة لدراسة علم وظائف الأعضاء العام والكيمياء الحيوية - بما في ذلك مناعة مراحل الشتاء - لأنواع الحشرات المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة للتنبؤ بوفرة الآفات ذات الأهمية ، على أساس وفيات الشتاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نشكر زملائنا فلاديمير شيلو وفيرا موروزوف وأوليانا روتسكايا وأولغا بولينوغوفا وأوكسانا توميلوفا على مساعدتهم في تنظيم وتنفيذ الإجراءات الميدانية والمختبرية.
تم دعم البحث من قبل مؤسسة العلوم الروسية ، المشروع رقم 22-14-00309.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
References
- Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. Colorado potato beetle. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 29-43 (2022).
- Alyokhin, A., Kryukov, V. Ecology of a potato field. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 451-462 (2022).
- Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A. Ice-nucleating active bacteria reduce the cold-hardiness of the freeze-intolerant Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 87 (2), 377-381 (1994).
- Ushatinskaja, R. S. Diapause of insects and its modifications. Journal of General Biology. 34, In Russian 194-215 (1973).
- Zheng, X. L., et al. Effect of soil moisture on overwintering pupae in Spodopteraexigua (Lepidoptera: Noctuidae). Applied Entomology and Zoology. 48, 365-371 (2013).
- Hiiesaar, K., Metspalu, L., Jõudu, J., Jõgar, K. Over-wintering of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) in field conditions and factors affecting its population density in Estonia. Agronomy Research. 4 (1), 21-30 (2006).
- Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Chirumamilla-Chapara, A., Larson, M. L. Characterization of gene expression patterns during the initiation and maintenance phases of diapause in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Physiology. 55 (1), 32-39 (2009).
- Yocum, G. D., Buckner, J. S., Fatland, C. L. A comparison of internal and external lipids of nondiapausing and diapause initiation phase adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 159 (3), 163-170 (2011).
- Nikonorov, Y. M., Syrtlanova, L. A., Kitaev, K. A., Benkovskaya, G. V. Transcription activity of genes involved in diapause regulation in the Colorado Potato beetle and its change under a fipronil impact. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 8, 80-86 (2018).
- Govaere, L., et al. Transcriptome and proteome analyses to investigate the molecular underpinnings of cold response in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Cryobiology. 88, 54-63 (2019).
- Lehmann, P., Westberg, M., Tang, P., Lindström, L., Käkelä, R. The diapause lipidomes of three closely related beetle species reveal mechanisms for tolerating energetic and cold stress in high-latitude seasonal environments. Frontiers in Physiology. 11, 576617 (2020).
- Lebenzon, J. E., Torson, A. S., Sinclair, B. J. Diapause differentially modulates the transcriptomes of fat body and flight muscle in the Colorado potato beetle. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 40, 100906 (2021).
- Lashomb, J. H., Ng, Y. S., Ghidiu, G., Green, E. Description of spring emergence by the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), in New Jersey. Environmental entomology. 13 (3), 907-910 (1984).
- Cantwell, G. E., Cantelo, W. W., Schroder, R. F. Effect of Beauveria bassiana on underground stages of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). The Great Lakes Entomologist. 19 (2), 6 (1986).
- Fedorko, A., Bajan, C., Kmitowa, K., Wojciehowska, M. Effectiveness of the use of selected microorganisms to control the Colorado beetle during hibernation. Ecological Studies. 3 (2), 127-134 (1977).
- Gaugler, R., Costa, S. D., Lashomb, J. Stability and efficacy of Beauveria bassiana soil inoculations. Environmental Entomology. 18 (3), 412-417 (1989).
- Bajan, C., Kmitowa, K. Contribution of entomopathogenic fungi to the natural winter reduction of Colorado beetle adults. Polish Ecological Studies. 3 (2), 107-114 (1977).
- Milner, M., Kung, K. S., Wyman, J. A., Feldman, J., Nordheim, E. Enhancing overwintering mortality of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) by manipulating the temperature of its diapause habitat. Journal of Economic Entomology. 85 (5), 1701-1708 (1992).
- Doğan, C., et al. Characterization of calcium signaling proteins from the fat body of the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae): Implications for diapause and lipid metabolism. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 133, 103549 (2021).
- Benkovskaya, G. V., Udalov, M. B. Colorado potato beetle investigations in the south Urals. Nova Science Publishers. , (2011).
- Short, C. A., Hahn, D. A. Fat enough for the winter? Does nutritional status affect diapause. Journal of Insect Physiology. , 104488 (2023).
- McDonald, J. R., Bale, J. S., Walters, K. F. A. Low-temperature mortality and overwintering of the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae). Bulletin of Entomological Research. 87 (5), 497-505 (1997).
