Summary
Burada, ılıman bölgenin doğal koşulları altında Colorado patates böceği hazırda bekletme modunu incelemek için bir yöntem ve kışın böcek toplama tekniği sunuyoruz. Bu yöntem, hazırda bekletme modunun herhangi bir aşamasında çeşitli analizler için istenen sayıda kışlayan bireyin elde edilmesini sağlar.
Abstract
Ilıman bölgedeki patates Solanum tuberosum L.'nin en büyük zararlılarından biri, Colorado patates böceği (CPB) böceğidir. CPB'nin bağışıklığı ve hastalıkları ile ilgili çalışmaların çoğu aktif beslenme aşamalarında yapılır. Bununla birlikte, bu böcekler yaşam döngülerinin çoğunu kış diyapozu (kış uykusu) durumunda geçirmelerine rağmen, dinlenme aşamaları hakkında daha az çalışma vardır. Bu çalışmada, doğal koşullar altında CPB hazırda bekletme modunu araştırmak için bir yöntem geliştirildi ve test edildi ve kışın yeterli sayıda birey toplama fırsatı sunuldu. Bu makalede, KPB sağkalımı değerlendirildi ve farklı hiberasyon evrelerindeki enfeksiyöz ajanlar tanımlandı. CPB mortalitesi kış uykusu sırasında artarak Nisan-Mayıs aylarında maksimuma ulaştı. Ölü böceklerden entomopatojenik mantarlar (Beauveria, Isaria ve Lecanicillium) ve bakteriler Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas ve Serratia izole edildi. Böceklerin tüm kış uykusu süresi boyunca hayatta kalma oranı% 61 idi. Sunulan yöntemin başarısını gösteren donmuş veya kurutulmuş böcek bulunamadı.
Introduction
Colorado patates böceği Leptinotarsa decemlineata Say (CPB), ağırlıklı olarak patates Solanum tuberosum L olmak üzere Solanaceae bitkilerinin önemli bir zararlısıdır. Bu türün coğrafi aralığı 16 milyonkm2'den fazladır ve sürekli genişler1. CPB'nin fakültatif kış diyapozu vardır ve ılıman bölgede kış uykusu zorunludur. Diyapoz, kısa günlük bir fotoperiyot ile indüklenir ve sıcaklık1 ile modüle edilir. Bu böcekler yetişkin aşamasında toprağa girerek kışı geçirirler. Artan enlemlerle, hazırda bekletme süresinin süresi uzar. Ilıman bölgede, özellikle menzilinin kuzey bölgelerinde, kışlama 9 aya kadar sürer: Ağustos-Eylül'den Mayıs-Haziran'a kadar (Noskov ve diğerleri, kişisel gözlemler). Bu süre zarfında, CPB - tıpkı ılıman bölgedeki diğer böcekler gibi - elverişsiz kış koşullarına maruz kalır ve soğuğa toleransını arttırmalıdır. Aynı zamanda, böceklerin toprakla teması, çeşitli fırsatçı ve patojenik mikroorganizmalar tarafından enfeksiyon riskini arttırır2. Bu nedenle, bu böceklerin kış uykusu sırasında belirli bir bağışıklık sistemi aktivitesini sürdürmeleri gerekir ve bu da enerjik olarak maliyetlidir. Bununla birlikte, böcek bir enfeksiyondan kurtulsa bile, hastalık soğuğa dayanıklılığını azaltabilir3. Düşük sıcaklığın, CPB'nin kış mortalitesinin tek nedeni olmadığı unutulmamalıdır. Oksijen eksikliği de önemli bir rol oynar ve bazı koşullar altında kış ölümlerinin ana faktörü olabilir 4,5.
CPB'nin doğal kış ölüm oranının çok yüksek olabileceği ve killi tınlı topraklarda% 100'e ulaşabileceğibilinmektedir 6. Bu nedenle, kışlama, CPB yaşam döngüsündeki en önemli dönemlerden biridir. Bununla birlikte, doğal koşullar altında CPB hazırda bekletmenin fizyolojisi, bağışıklık sistemi aktivitesi, sağkalımı ve diğer parametreleri hakkındaki veriler hala sınırlıdır. CPB erişkinlerinde diyapoz sırasında ve soğuk şokuna yanıt olarak diferansiyel gen ekspresyonu ve çeşitli fizyolojik parametreler üzerine çalışmalar vardır 7,8,9,10,11,12; Bununla birlikte, bu analizler esas olarak, sıcaklık, nem ve doğal patojen yükünde doğal dalgalanmalar olmaksızın laboratuvar koşullarında diyapoz veya soğuk stresinin indüklenmesiyle gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, doğal koşullar altında topraktan kazı yoluyla toplanan bu böceklerin fizyolojisi üzerine araştırmalar önemlidir. 1970'ler-1980'lerdedoğal koşullar altında kışlamanın farklı yönleri aktif olarak incelenmiştir 13,14,15,16,17,18. Öte yandan, bu çalışmalarda kışın topraktan CPB kazısı yapılmamıştır. Ek olarak, CPB'nin kontrollü hazırda bekletme modu için bir teknik ve kafeslerin bir açıklaması ayrıntılı olarak sağlanmamıştır. Bu nedenle, doğal ortamlarda kışlayan CPB'lerin fizyolojisinin araştırılmasına ihtiyaç vardır19.
Bu çalışmanın amacı, KPB erginlerinin doğal koşullar altında kontrollü kış uykusuna yatması için bir yöntem geliştirmek ve test etmektir. Önerilen yöntem, karasal iklimin tarla koşulları altında kış uykusu sırasında mikrobiyolojik, immünolojik ve diğer tahliller için istenen sayıda CPB bireyinin elde edilmesine izin verir. Bu yöntem, kar altında toprakta kışı geçiren diğer böcek türlerine uyarlanabilir ve uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırda bekletme kafeslerinin tanımı
NOT: Deneyin amaçlarına bağlı olarak kafes sayısı değişmektedir. Numune alma tarihi başına en az üç kafes kullanın. Ortaya çıkacak böcek sayısını tahmin etmek için, ilkbahara kadar topraktan çıkarılmayacak en az üç ek kafes hazırlayın.
- 25 × 25 × 40 cm (U × G × Y) boyutlarında sert ahşap çerçeveden yapılmış kafesler kullanın.
- Kafes için bir çerçeve oluşturmak için en az 2 cm kalınlığında ve 4 cm genişliğinde ahşap çıtalar kullanın.
- Kafesin içini, 5 mm × 3 mm'den büyük olmayan açıklıklara sahip paslanmaz çelik bir ağ ile örtün. Ağı sabitlemek için ahşap zımba kullanın.
- Paslanmaz çelik ağı zımba ile tabanın dışına sabitleyin.
- Kafesin içini 60 g/m2 yoğunluğa sahip siyah sentetik bir jeotekstil ile hizalayın.
NOT: Geotekstil, böceklerin kaçmasını önlemek için ek bir bariyer görevi görür. Aktif olarak hareket eden entomopatojenler ve parazitoidlerle ilgili deneylerde kullanmayın. - Kafesin üst kısmına yaklaşık 60 cm yüksekliğinde sentetik yarı saydam nefes alabilen bir kumaş tüpünü sıkıca takın.
- Gerektiğinde topraktan çıkarmak için iki güçlü ipi kafesin dibine çaprazlayın ve sabitleyin.
2. Kafeslerin montajı
- Toprağa 40 cm derinliğinde bir çukur kazın ve kafesi içine yerleştirin.
- Deliğin üzerine kuru ot veya saman koyun.
- Kafesi, saman veya kuru ot kafesin duvarları ile toprak arasında olacak şekilde yerleştirin.
- Kafesleri, böceklerin toplandığı aynı patates tarlasından toprakla doldurun.
- Su geçirmez sıcaklık ve nem dataloggerlarını kafeslere gerekli derinliklerde monte edin.
NOT: Herhangi bir üreticinin veri kaydedicileri kullanılabilir ve düşük sıcaklıklarda çalışabilmelidir. - Böceklerin girişinden 3-4 hafta önce her kafesin içine patates fideleri dikin ve orta derecede sulayın.
- Bir sentetik kumaş tüpünü, kafesin dışına monte edilmiş herhangi bir malzemeden bir çubuğa dikey olarak sabitleyin.
3. Kışlamadan önce böceklerin yetiştirilmesi
- Patates bitki örtüsünün sonuna doğru pestisit içermeyen patates tarlalarında yetişkin böcekleri elle toplayın.
NOT: Yetişkin böcekler larvalardan önemli ölçüde farklıdır ve çizgili elytra ile karakterize edilirken, larvalar kırmızıdır. - Toplanan böcekleri kafeslere yerleştirmeden önce böcekleri beslemek için patates üstleri içeren 15-20 L'lik plastik kovalarda (kova başına en fazla 200 kişi) saklayın.
- Kovaları nefes alabilen kumaşla örtün.
NOT: Böcekleri kovalarda 12 saatten fazla tutmayın. Kovaların dibinde böcek birikmesini önlemek için yeterince büyük patates üstleri kullanın. - Sentetik kumaş ağ ile kaplı patates bitkilerinin üzerine 200'den fazla CPB bireyi yerleştirmeyin.
- Patates üstleri tüketildiğinde, su içeren plastik bir kavanoza yerleştirilmiş taze olanları ekleyin ve daha sonra patates üstlerini günlük olarak değiştirin.
NOT: Sapları bir kavanoza sabitlemek için pamuk yünü ve parafilm kullanın. Böcekleri çıkarırken eski sapları dikkatlice kontrol edin. - Tüm böcekler kışlama için toprağa gömüldükten sonra, sentetik kumaş tüpünü çubuktan çözün ve kumaşı yere koyun.
4. Kış mevsiminde böceklerin toplanması
- Kafes yüzeyinin üzerindeki karı temizleyin.
- Kafesi her iki taraftan güçlü bir kürekle gevşetin.
- Halatları kullanarak kafesi topraktan dışarı çekin.
- Kafesi laboratuvara getirin.
NOT: Deneyin amaçlarına bağlı olarak, kış uykusundaki böceklerin analizden önce inaktif olması gerekebilir. Bu durumda böceklerin topraktan izolasyonu sırasında laboratuvardaki sıcaklık ~2-5 °C olmalıdır. - Toprağı kutudan küçük porsiyonlarda çıkarın, büyük toprak parçalarını dikkatlice parçalayın ve cımbız kullanarak böcekleri izole edin.
- Canlı böcekleri kadavralardan ayırın. Canlı sağlıklı böcekler, etraflarında kompakt bir toprak oluşturarak bir hava boşluğu (beşik olarak adlandırılır) oluşturur ve bu nedenle topraktan kolayca ayrılır. Mantarlar tarafından öldürülen böcekler mumyalanır veya yüzeyde görünür miselyum bulunur. Bakteriyel olarak ayrışan böcekler karanlıktır.
- Tüm böceklerin izole edildiğinden ve zarar görmediğinden emin olmak için toprağı bir elek ile eleyin.
- Mantar enfeksiyonu veya bakteriyel ayrışma semptomları olan kadavraları, ileride tanımlamak için ayrı bir steril 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Canlı böcekleri, nemli bir pamuk topu içeren kapalı havalandırılan bir kapta analize kadar 0-2 °C sıcaklıktaki bir buzdolabında saklayın.
5. Organ ve doku örneklerinin hazırlanması
- Hemolenf toplamak için, bir insülin iğnesi kullanarak elytra altında karnın lateral kısmında bir delik açın.
NOT: Kışlama sırasında, hemolenf miktarı önemli ölçüde azalır ve bu da bu sıvının toplanmasını zorlaştırır. - Bağırsakları izole etmek için kafa kapsülünü kesin, tüm içeriği fosfat tamponlu bir Petri kabına sıkın, bağırsağı ayırın ve yağ ve Malpighian damarlarından arındırın.
- Ön bağırsak, orta bağırsak veya arka bağırsak gibi bağırsağın istenen bir bölümünü ayırın.
- Yağ gövdesini izole etmek için, bağırsağın izolasyonundan sonra diğer dokulardan ayırın.
NOT: İzole edilen dokular, antioksidan ve detoksifiye edici enzimlerin aktivitesini ölçmek için kullanılabilir (bir örnek: Ek Şekil 1), bağışıklık sinyal yolu genlerinin düzenlenmesinin analizi (bir örnek: Ek Şekil 2) veya böcek bağırsak içeriğinin metabarkodlaması vb.
6. Kadavralardan mikroorganizmaların izolasyonu
- Entomopatojenik mantarları kadavralardan izole etmek için mumyalanmış böcekleri steril bir nem odasına koyun.
- % 0.4 laktik asit ile Sabouraud dekstroz agar üzerine kaplama için böceklerin iç içeriğinden hava conidia (varsa) veya sklerotia kullanın.
NOT: Hemen kaplamak için miselyum ve conidia içeren böcekleri kullanın (nem odalarına koymadan). - Bakteriyel ayrışma belirtileri olan kadavralardan bakterileri izole edin.
- Bir böceğin kafasını kesin, iç içeriğini sıkın ve daha sonra bakteri (Luria-Bertani agar, endo agar ve safra esculin agar) için ortam üzerine kaplama yapmak üzere tüplere toplayın.
NOT: Patojenlerin cinslerini ve türlerini tanımlamak için mikroskopi ve moleküler yöntemler kullanın. Gerekirse, diğer parazitlerin varlığı için bir analiz yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kışlayan CPB'lerle ilgili aşağıdaki sonuçlar toprak sıcaklığını, hayatta kalmayı ve enfeksiyonları göstermektedir.
Toprak sıcaklığı dinamiği.
Kasım ayının sonundan Nisan ayının başına kadar 30 cm derinlikteki kafeslerde sıfırın altındaki sıcaklıklar kaydedilmiştir (Şekil 1). Bu dönemde ortalama sıcaklık eksi 3,3 ± 0,1 °C idi (standart hata ±). Kaydedilen en düşük sıcaklık Şubat ortasında eksi 7,9 °C idi.
Kışlayan CPB'lerin hayatta kalması.
Böcek ölümleri kış uykusu sırasında görüldü ve ortaya çıkmadan önce ilkbaharda maksimuma ulaştı. İlk böcek sayısı 2000 idi ve bunların 1470'i Mayıs ayı sonuna kadar hayatta kaldı. Kış uykusu sırasında böceklerin hayatta kalma oranı% 61 idi (Şekil 2).
Kışlayan CPB'lerde enfeksiyonlar.
530 ölü böceğin analizi, kış uykusu döneminde% 53'ünün bakteriyel ayrışma semptomları ve% 25'inin mantar enfeksiyonu semptomları olduğunu göstermiştir (Şekil 3). Beauveria , entomopatojenik mantarların izole kültürleri arasında baskındı (45 izolat). Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) ve Lecanicillium çok daha az yaygındı (her biri iki izolat). Kadavralardan izole edilen ve bakteriyel ayrışma belirtileri gösteren bakteriler arasında (n=30) Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella ve Glutamicibacter cinslerine ait türler tespit edilmiştir (Ek Tablo 1).
Şekil 1: Toprak sıcaklığı dinamiği. 30 cm derinliğe monte edilmiş su geçirmez bir sıcaklık dataloggerı ile ölçülen toprak sıcaklığı dinamikleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kışı geçiren Colorado patates böceklerinin farklı kış uykusu dönemlerinde hayatta kalması. Kafesler kazıldı ve hayatta kalan ve ölü böcekler Kasım, Ocak, Nisan ve Mayıs aylarında sayıldı. Çubuklar, hayatta kalan böceklerin sayısını temsil eder. Bıyıklar standart hatayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kışlayan Colorado patates böceği kadavralarındaki enfeksiyonlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Materyaller: Aşağıdaki Ek Dosyaları indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1. Hazırda bekletme sırasında CPB'nin orta bağırsağında spesifik olmayan esterazların aktivitesi. Bıyıklar standart hatayı gösterir. Farklı harfler zaman noktaları arasında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (Dunn testi, P < 0.05).
Ek Şekil 2: Hazırda bekletme sırasında CPB'nin bağırsak ve yağ gövdesindeki transkripsiyon faktörü NFkB (IMD yolu) ekspresyonunun değişiklikleri. Veriler, Ağustos zaman noktasına göre kat değişiklikleri olarak sunulur. Rp4, Rp18 ve Arf19 referans genler olarak kullanıldı. Bıyıklar standart hata gösteriyor.
Ek Tablo 1: Hazırda bekletme sırasında ölü bir CPB'den izole edilen bakterilerin 16S rRNA (~ 800 bp) gen dizilerinin varsayılan tanımlanması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, CPB'lerin kışlamasını incelemek için önerilen yöntemin, farklı kış uykusu dönemlerinde yeterli sayıda böcek elde etmemizi sağladığını göstermektedir. Sunulan tekniğin başarısı, en önemlisi hava koşulları olan birkaç bağımsız faktöre bağlıdır. Soğuk ve karsız bir kış aylarında, toprak kafesin tüm derinliğine kadar donabilir. Bu durumda, tüm böceklerin ölüm riski önemli ölçüde artar18. Böceğin hayatta kalması,yıldan yıla 6. yıla önemli ölçüde değişebilen birçok faktörün kombinasyonuna bağlıdır.
Deneyde, kış aylarında kafeslerin içindeki toprak sıcaklığı eksi 7.9 °C'nin altına düşmedi. 25 cm'den daha derin bir derinlikte buz gözlenmedi ve en büyük soğuma döneminde (Ocak-Şubat) bile toprak gevşek kaldı. Çoğu böcek, her kafesin alt kısmında, 30-40 cm derinlikte birikmiştir. Böcekler, kafeslerin daha derin olmasıyla daha derine inmiş olabilir. Öte yandan, kafesin derinliğinin arttırılması, ağırlığın artmasına neden olacak ve özellikle kış aylarında kafesin topraktan çıkarılmasını zorlaştıracaktır. Ayrıca, incelenen bölgenin patates tarlalarındaki gözlemlerimize göre, CPB kışlama için 35 cm'den daha derine inmez. Bu bulgu, böceklerin üstesinden gelemediği 30-35 cm derinlikteki killi toprak tabakası ile açıklanabilir. Denememizde üst 30 cm horizondan kumlu, tınlı toprak kullanılmıştır. Muhtemelen böceklerin doğal koşullardan daha derine inebilmelerinin nedeni budur. CPB'nin hazırda bekletme derinliği tipik olarak 10-25 cm'dir (ref. 1), ancak bu coğrafi bölgelere göre değişebilir. Örneğin, kuzeydoğu Amerika Birleşik Devletleri'nde (New Jersey), böceklerin çoğu 10-13 cm derinlikte kış uykusuna yatar (ref. 13). Böceklerin benzer kışlama derinlikleri (≤15 cm) Wisconsin, ABD'de de belgelenmiştir18. Güney Urallarda (Rusya), CPB'nin kışlama için yuvalandığı derinlik 5-30 cm aralığındadır (ref. 20). Böceklerin hayatta kalma oranının, kışlama derinliğindeki1 artışla her zaman pozitif bir şekilde ilişkili olmadığına dikkat edilmelidir. Gerçekten de, Estonya6'daki bir tarla kışlama deneyinde, CPB'nin hayatta kalma oranının 30 cm derinlikte 50 cm derinlikten daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Bu yazarlar, bu bulgunun oksijen eksikliğinden kaynaklanabileceğini öne sürüyorlar. ABD'nin Wisconsin eyaletinde yapılan bir saha deneyinde de benzer veriler elde edilmiştir18: Kışlayan CPB'lerin en yüksek sağkalım oranı (%51.5) 15-25 cm derinlikte kaydedilmiştir. Aynı zamanda, böceğin%18,100 ölüm oranı 25-35 cm derinlikte kaydedildi. Ilıman bölgedeki deneyler için 40 cm'lik bir derinliğin yeterli olduğuna inanıyoruz çünkü hayatta kalan böceklerin yüzdesi yüksekti ve toprak donması kafesin tüm derinliğine uzanmadı. Kar örtüsünün varlığı toprağın daha az soğumasına katkıda bulunur. Gerekirse, kafeslerin yüzeyinin üzerindeki kar örtüsünün kalınlığı ayarlanabilir.
Protokoldeki bir diğer önemli nokta, az miktarda depolanmış besin maddesi nedeniyle CPB'nin kışlama için olası yetersiz hazır olmasıdır. Bazı yetişkin CPB'ler, böceklerin toprağa toplu olarak gömülmesinden sonra toprak yüzeyinde kaldı. Kışlamanın başarısı aynı zamanda biriken besin miktarına da bağlı olduğu için yeterince yağ depolamamış olmaları mümkündür21. Ek olarak, kışın kafesler topraktan çıkarıldığında, böceklerin bir kısmı toprak yüzeyinde veya yüzeye yakın tabakada donmuş haldeydi. Belki de bunlar, yetersiz beslenme, enfeksiyonlar veya diğer zararlı faktörler nedeniyle yuva yapmak için yeterli enerjiye sahip olmayan böceklerdi. Lashomb ve ark.13, CPB kışlaması ile yapılan deneylerde, yetişkinlerin ~%15'inin kışlama için toprağa girmediğini belirtmiştir. Bu yazarlar nedenlerini tartışmadılar. Her durumda, böceklere yeterli yiyecek sağlamak gerekir.
Bir çalışmanın amaçlarına bağlı olarak, böcekleri topraktan toplandıktan sonra hazırda bekletme durumunda tutmak gerekebilir. Bu amaçla, laboratuvar sıcaklığı soğuk olmalı ve böcekler topraktan çıkarıldıktan hemen sonra 0-2 ° C koşullarına yerleştirilmelidir. Çalışmamızda, sonbahar ve ilkbaharda, CPB'lerin topraktan kazıldıktan hemen sonra lokomotor aktiviteye başladığı gözlemlendi; Bu süreç kışın ortasında çok daha yavaş gerçekleşir.
Bu çalışmada aktif olarak hareket eden entomopatojenler ve parazitoidler dikkate alınmamıştır. CPB'nin yayılmasına karşı ek bir bariyer olarak bir jeotekstil kullandık. Bir jeotekstilin, aktif olarak hareket eden entomopatojenler (örneğin, entomopatojenik nematodlar), yırtıcılar veya parazitoidler üzerindeki araştırmalarda kullanılmaması gerektiğini, çünkü bunların hareketlerini engelleyeceğini unutmayın.
KPB'nin bağışıklığı ve hastalıkları ile ilgili çalışmaların çoğunlukla aktif beslenme aşamalarında yapıldığını belirtmek önemlidir. Dinlenme aşamaları daha az araştırılmıştır ve esas olarak laboratuvar koşullarında incelenmiştir. Bununla birlikte, bu koşullar altında, doğal üreme alanlarında meydana gelen sıcaklık, nem ve havalandırma dalgalanmalarını simüle etmek zordur. Bu nedenle, saha deneyleri tercih edilir22. Farklı kış uykusu dönemlerinde tarlada CPB kış ölümlerinin nedenlerini belirlemek için, kışlayan böcekleri topraktan kazmak gerekir. 1970-1980'lerde doğal koşullar altında kışlama ile ilgili çalışmalar aktif olarak yürütülmüştür. Bu makalelerde açıklanan yöntemler esas olarak ilkbaharda ortaya çıkan bireylerintoplanması ve sayılmasından 13, kışlamadan önce entomopatojenik mantarların14,15,16 veya entomopatojenik nematodların 15 kullanılmasının etkinliğinin değerlendirilmesi ve doğal kış ölümlerini belirlemek için ilkbahar ve sonbaharda kışlayan böceklerin topraktan toplanmasından oluşur 17. Aynı zamanda bu deneylerde kullanılan kafeslerin boyutları ve şekilleri 20×20 cm ile 90×90×90 cm (ref.13) veya 180×60×30 cm (ref.18) arasında değişiyordu. Yukarıda belirtilen çalışmaların, kışın böcek toplama olasılığı ile CPB kışlaması için metodoloji geliştirmeyi amaçlamadığına dikkat edilmelidir. Mevcut yöntemlerden farklı olarak, bu makalede açıklanan teknik, kar döneminde doğal CPB popülasyonlarını araştırmayı mümkün kılmaktadır.
Sonuç olarak, önerilen yöntem, araştırmacıların doğal koşullar altında, böceklerin nispeten düşük ölüm oranı ile ve düşük bir maliyetle istenen sayıda kışlayan CPB bireyi elde etmelerini sağlar. CPB hazırda bekletme modunun çeşitli yönlerinin araştırılması, hem temel araştırma hem de uygulamalı bakış açılarından çok önemlidir: bu zararlının kontrolüne yönelik yaklaşımları geliştirmek için. Bu teknik, toprakta kışı geçiren diğer böcek türlerine uyarlanabilir. Gelecekteki araştırmacılar bu yöntemi, çeşitli böcek türlerinin genel fizyolojisi ve biyokimyasını (kışlama evrelerinin bağışıklığı dahil) incelemek için uygulayabilirler. Ek olarak, bu yöntem, kış ölümlerine dayanarak, ilgilenilen zararlıların bolluğunu tahmin etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, çatışan çıkarların olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Meslektaşlarımız Vladimir Shilo, Vera Morozovа, Ulyana Rotskaya, Olga Polenogova ve Oksana Tomilova'ya saha ve laboratuvar prosedürlerinin düzenlenmesi ve yürütülmesindeki yardımları için teşekkür ederiz.
Araştırma, Rus Bilim Vakfı, proje No. 22-14-00309 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
References
- Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. Colorado potato beetle. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 29-43 (2022).
- Alyokhin, A., Kryukov, V. Ecology of a potato field. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 451-462 (2022).
- Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A. Ice-nucleating active bacteria reduce the cold-hardiness of the freeze-intolerant Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 87 (2), 377-381 (1994).
- Ushatinskaja, R. S. Diapause of insects and its modifications. Journal of General Biology. 34, In Russian 194-215 (1973).
- Zheng, X. L., et al. Effect of soil moisture on overwintering pupae in Spodopteraexigua (Lepidoptera: Noctuidae). Applied Entomology and Zoology. 48, 365-371 (2013).
- Hiiesaar, K., Metspalu, L., Jõudu, J., Jõgar, K. Over-wintering of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) in field conditions and factors affecting its population density in Estonia. Agronomy Research. 4 (1), 21-30 (2006).
- Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Chirumamilla-Chapara, A., Larson, M. L. Characterization of gene expression patterns during the initiation and maintenance phases of diapause in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Physiology. 55 (1), 32-39 (2009).
- Yocum, G. D., Buckner, J. S., Fatland, C. L. A comparison of internal and external lipids of nondiapausing and diapause initiation phase adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 159 (3), 163-170 (2011).
- Nikonorov, Y. M., Syrtlanova, L. A., Kitaev, K. A., Benkovskaya, G. V. Transcription activity of genes involved in diapause regulation in the Colorado Potato beetle and its change under a fipronil impact. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 8, 80-86 (2018).
- Govaere, L., et al. Transcriptome and proteome analyses to investigate the molecular underpinnings of cold response in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Cryobiology. 88, 54-63 (2019).
- Lehmann, P., Westberg, M., Tang, P., Lindström, L., Käkelä, R. The diapause lipidomes of three closely related beetle species reveal mechanisms for tolerating energetic and cold stress in high-latitude seasonal environments. Frontiers in Physiology. 11, 576617 (2020).
- Lebenzon, J. E., Torson, A. S., Sinclair, B. J. Diapause differentially modulates the transcriptomes of fat body and flight muscle in the Colorado potato beetle. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 40, 100906 (2021).
- Lashomb, J. H., Ng, Y. S., Ghidiu, G., Green, E. Description of spring emergence by the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), in New Jersey. Environmental entomology. 13 (3), 907-910 (1984).
- Cantwell, G. E., Cantelo, W. W., Schroder, R. F. Effect of Beauveria bassiana on underground stages of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). The Great Lakes Entomologist. 19 (2), 6 (1986).
- Fedorko, A., Bajan, C., Kmitowa, K., Wojciehowska, M. Effectiveness of the use of selected microorganisms to control the Colorado beetle during hibernation. Ecological Studies. 3 (2), 127-134 (1977).
- Gaugler, R., Costa, S. D., Lashomb, J. Stability and efficacy of Beauveria bassiana soil inoculations. Environmental Entomology. 18 (3), 412-417 (1989).
- Bajan, C., Kmitowa, K. Contribution of entomopathogenic fungi to the natural winter reduction of Colorado beetle adults. Polish Ecological Studies. 3 (2), 107-114 (1977).
- Milner, M., Kung, K. S., Wyman, J. A., Feldman, J., Nordheim, E. Enhancing overwintering mortality of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) by manipulating the temperature of its diapause habitat. Journal of Economic Entomology. 85 (5), 1701-1708 (1992).
- Doğan, C., et al. Characterization of calcium signaling proteins from the fat body of the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae): Implications for diapause and lipid metabolism. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 133, 103549 (2021).
- Benkovskaya, G. V., Udalov, M. B. Colorado potato beetle investigations in the south Urals. Nova Science Publishers. , (2011).
- Short, C. A., Hahn, D. A. Fat enough for the winter? Does nutritional status affect diapause. Journal of Insect Physiology. , 104488 (2023).
- McDonald, J. R., Bale, J. S., Walters, K. F. A. Low-temperature mortality and overwintering of the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae). Bulletin of Entomological Research. 87 (5), 497-505 (1997).
