Summary
Her presenterer vi en metode for å studere Colorado-potetbille dvalemodus under de naturlige forholdene i den tempererte sonen, samt en teknikk for å samle biller om vinteren. Denne metoden gjør det mulig å oppnå et ønsket antall overvintrende individer for ulike analyser på et hvilket som helst stadium av dvalemodus.
Abstract
En av de største av potet Solanum tuberosum L. i den tempererte sonen er insektet Colorado potetbille (CPB). De fleste studier på immunitet og sykdommer i CPB utføres under aktive fôringsstadier. Likevel er det færre studier på hvilestadier, selv om disse billene tilbringer mesteparten av livssyklusen i en tilstand av vinterdiapause (dvalemodus). I dette arbeidet ble det utviklet og testet en metode for å undersøke CPB-dvalemodus under naturlige forhold, noe som gir mulighet til å samle et tilstrekkelig antall individer om vinteren. I denne artikkelen ble CPB-overlevelsen vurdert, og smittestoffer i ulike dvalestadier ble identifisert. CPB-dødeligheten økte under dvalemodusen, og nådde et maksimum i april-mai. Entomopatogene sopp (Beauveria, Isaria og Lecanicillium) og bakterier Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas og Serratia ble isolert fra de døde insekter. Overlevelsesgraden for biller for hele dvaleperioden var 61%. Ingen frosne eller uttørkede biller ble funnet, noe som indikerer suksessen til den presenterte metoden.
Introduction
Colorado potetbille Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) er et viktig av Solanaceae planter, hovedsakelig potet Solanum tuberosum L. Det geografiske området for denne arten er mer enn 16 millioner km2 og utvides stadig1. CPB har fakultativ vinterdiapause, og dvalemodus er obligatorisk i den tempererte sonen. Diapausen induseres av en fotoperiode på kort dag og moduleres av temperatur1. Disse billene overvintrer i voksenstadiet ved å grave seg ned i jord. Med økende breddegrader strekker varigheten av dvalemodusperioden seg. I den tempererte sonen, spesielt på nordlige områder av sitt område, varer overvintringen opptil 9 måneder: fra august-september til mai-juni (Noskov et al., personlige observasjoner). I løpet av denne perioden er CPB - akkurat som alle andre insekter i den tempererte sonen - utsatt for ugunstige vinterforhold og må øke sin kuldetoleranse. Samtidig øker kontakt av biller med jord risikoen for infeksjon av ulike opportunistiske og patogene mikroorganismer2. Derfor må disse billene opprettholde et visst nivå av immunsystemaktivitet under dvalemodus, noe som også er energisk kostbart. Likevel, selv om insektet overlever en infeksjon, kan sykdommen redusere sin kalde hardførhet3. Det skal bemerkes at lav temperatur ikke er den eneste grunnen til vinterdødeligheten til CPB. En viktig rolle spilles også av mangel på oksygen, og under noen forhold kan det være hovedfaktoren for vinterdødelighet 4,5.
Det er kjent at naturlig vinterdødelighet av CPB kan være svært høy, og nå 100% i leirleirjord6. Dermed er overvintring en av de mest avgjørende periodene i CPBs livssyklus. Likevel er data om fysiologi, immunsystemaktivitet, overlevelse og andre parametere for CPB-dvalemodus under naturlige forhold fortsatt begrenset. Det er studier på differensielt genuttrykk og ulike fysiologiske parametere hos CPB-voksne under diapausen og som respons på kuldesjokk 7,8,9,10,11,12; Imidlertid har disse analysene hovedsakelig blitt utført ved induksjon av diapause eller kuldespenning under laboratorieforhold uten naturlige svingninger i temperatur, fuktighet og naturlig patogenbelastning. Likevel er forskning på fysiologien til disse billene samlet inn ved utgraving fra jord under naturlige forhold viktig. Ulike aspekter ved CPB-overvintring under naturlige forhold ble aktivt studert på 1970-1980-tallet 13,14,15,16,17,18. På den annen side involverte disse studiene ikke CPB-utgraving fra jorda om vinteren. I tillegg er en teknikk for kontrollert dvalemodus av CPB og en beskrivelse av burene ikke gitt i detalj. Derfor er det nødvendig med undersøkelse av fysiologien til CPB som overvintrer i naturlige omgivelser19.
Målet med denne studien var å utvikle og teste en metode for kontrollert dvalemodus hos CPB-voksne under naturlige forhold. Den foreslåtte metoden gjør det mulig å oppnå et ønsket antall CPB-individer for mikrobiologiske, immunologiske og andre analyser under dvalemodus under feltforhold i et kontinentalt klima. Denne metoden kan tilpasses og brukes på andre insektarter som overvintrer i jord under snø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beskrivelse av burene for dvalemodus
MERK: Avhengig av målene med forsøket, varierer antall bur. Bruk minst tre merder per prøvetakingsdato. For å estimere antall biller som vil dukke opp, forberede minst tre ekstra bur, som ikke vil bli tatt ut av jorden til våren.
- Bruk bur laget av en stiv treramme med en størrelse på 25 × 25 × 40 cm (L × B × H).
- For å bygge en ramme for buret, bruk trelast minst 2 cm tykk og 4 cm bred.
- Dekk innsiden av buret med et rustfritt stålnett med en størrelse på åpninger som ikke er større enn 5 mm × 3 mm. Bruk en trestiftemaskin for å fikse nettet.
- Fest nettet i rustfritt stål på utsiden av bunnen med stiftemaskinen.
- Kle innsiden av buret med et svart syntetisk geotekstil med en tetthet på 60 g/m2.
MERK: Geotekstilet fungerer som en ekstra barriere for å hindre billenes flukt. Ikke bruk den i eksperimenter relatert til aktivt bevegelige entomopatogener og parasitoider. - Fest et rør av syntetisk gjennomsiktig pustende stoff ca 60 cm høyt til toppen av buret.
- Kryss og fest to sterke tau til bunnen av buret for å trekke det ut fra jorden når det trengs.
2. Montering av merdene
- Grav et hull 40 cm dypt i jorden og plasser buret inni.
- Legg tørt gress eller høy på hullet.
- Plasser buret inne slik at hø eller tørt gress er mellom burets vegger og jorda.
- Fyll burene opp med jord fra samme potetåker hvor insektene samles inn.
- Installer vanntette temperatur- og fuktighetsdataloggere i merdene på nødvendige dybder.
MERK: Dataloggere fra enhver produsent kan brukes og må kunne operere ved lave temperaturer. - Plant potetplanter inne i hvert bur 3-4 uker før billenes introduksjon og vann dem moderat.
- Fest et rør av syntetisk stoff vertikalt til en pinne av noe materiale som er installert på utsiden av buret.
3. Oppdrett av insekter før overvintring
- Samle opp voksne biller manuelt i sprøytemiddelfrie potetåkre mot slutten av potetvegetasjonen.
MERK: Voksne biller skiller seg vesentlig fra larver og er preget av stripet elytra, mens larver er røde. - Hold de oppsamlede billene i 15-20 L plastbøtter (maks 200 personer per bøtte) som inneholder potetplater for å mate insektene før du plasserer dem i burene.
- Dekk bøttene med pustende stoff.
NOTAT: Ikke hold insekter i bøtter i mer enn 12 timer. Bruk store nok potetplater for å forhindre opphopning av biller i bunnen av bøttene. - Plasser ikke mer enn 200 CPB-personer på potetplantene dekket med det syntetiske stoffnettet.
- Når potettoppene er fortært, tilsett nye som er satt i en plastkrukke som inneholder vann og bytt potetoppene daglig etterpå.
NOTAT: For å fikse stilker i en krukke, bruk bomullsull og parafilm. Sjekk nøye gamle stilker for biller når du fjerner dem. - Når alle billene er gravd ned i jorden for overvintring, løsner du røret av syntetisk stoff fra pinnen og legger stoffet ned.
4. Innsamling av insekter i vintersesongen
- Fjern snø over overflaten av buret.
- Løsne buret på hver side med en sterk spade.
- Trekk buret ut av jorden ved hjelp av tauene.
- Ta buret til laboratoriet.
MERK: Avhengig av målet med forsøket, kan dvalebiller måtte være inaktive før analysen. I dette tilfellet bør temperaturen i laboratoriet under isolering av biller fra jorda være ~ 2-5 ° C. - Fjern jorda fra esken i små porsjoner, bryt forsiktig opp store jordstykker og isoler biller ved hjelp av pinsett.
- Separate levende biller fra. Levende friske biller skaper kompakt jord rundt dem, danner et lufthulrom (en såkalt vugge), og skilles derfor lett fra jorda. Biller drept av sopp er mumifisert eller har synlig mycel på overflaten. Bakterielt nedbrytende insekter er mørke.
- Sikt jorden gjennom en sil for å sikre at alle biller er isolert og ikke skadet.
- Plasser med symptomer på soppinfeksjon eller bakteriell nedbrytning i et individuelt sterilt 15 ml sentrifugerør for fremtidig identifikasjon.
- Oppbevar levende biller i kjøleskap ved en temperatur på 0-2 °C inntil analyse i en lukket ventilert beholder som inneholder en fuktig bomullsdott.
5. Fremstilling av organ- og vevsprøver
- For å samle hemolymfe, gjør en punktering i den laterale delen av magen under elytra ved hjelp av en insulinnål.
MERK: Under overvintring reduseres mengden hemolymf betydelig, noe som gjør det vanskelig å samle denne væsken. - For å isolere tarmen, kutt av hodekapselen, klem ut alt innholdet i en petriskål med fosfatbuffer, skille tarmen og rens den for fett og malpighiske kar.
- Separat en ønsket del av tarmen, for eksempel foregut, midgut eller hindgut.
- For å isolere fettlegemet, skille det fra andre vev etter isolering av tarmen.
MERK: De isolerte vevene kan brukes til å måle aktiviteten til antioksidanter og avgiftende enzymer (et eksempel: tilleggsfigur 1), analyse av regulering av immunsignalveigener (et eksempel: tilleggsfigur 2), eller metastrekkoding av insekttarminnhold osv.
6. Isolering av mikroorganismer fra
- For å isolere entomopatogene sopp fra, legg de mumifiserte insekter inn i et sterilt fuktighetskammer.
- Bruk antennekonidia (hvis tilgjengelig) eller skleroti fra billenes indre innhold til plettering på Sabouraud druesukkeragar med 0,4 % melkesyre.
NOTAT: Bruk biller med mycel og konidier til plating umiddelbart (uten å plassere dem i fuktighetskamre). - Isoler bakterier fra med symptomer på bakteriell nedbrytning.
- Klipp av hodet til en bille, klem ut det indre innholdet, og samle dem i rør for etterfølgende plating på media for bakterier (Luria-Bertani agar, endo agar og galle esculin agar).
MERK: Bruk mikroskopi og molekylære metoder for å identifisere slekter og arter av patogener. Om nødvendig kan en analyse for tilstedeværelse av andre parasitter utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene nedenfor på overvintrende CPB viser jordtemperatur, overlevelse og infeksjoner.
Jordtemperaturdynamikk.
Fra slutten av november til begynnelsen av april ble det registrert minusgrader i merdene på 30 cm dyp (figur 1). Gjennomsnittstemperaturen i denne perioden var minus 3,3 ± 0,1 °C (gjennomsnitt ± standardfeil). Laveste registrerte temperatur var minus 7,9 °C i midten av februar.
Overlevelse av overvintrende CPB.
Insektdødelighet ble sett under dvalemodus og nådde et maksimum om våren før fremvekst. Det opprinnelige antallet biller var 2000, hvorav 1470 personer overlevde innen utgangen av mai. Overlevelsen til billene under dvalen var 61 % (figur 2).
Infeksjoner i overvintrende CPB.
En analyse av 530 døde biller viste at i dvaleperioden hadde 53 % av dem symptomer på bakteriell nedbrytning, og 25 % hadde symptomer på soppinfeksjoner (figur 3). Beauveria dominerte (45 isolater) blant de isolerte kulturene av entomopatogene sopp. Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) og Lecanicillium var mye mindre vanlige (to isolater hver). Blant bakteriene isolert fra med symptomer på bakteriell forråtnelse (n = 30) ble det identifisert arter tilhørende slektene Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella og Glutamicibacter (tilleggstabell 1).
Figur 1: Jordtemperaturdynamikk. Jordtemperaturdynamikk målt av en vanntett temperaturdatalogger installert på en dybde på 30 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Overlevelse av overvintrende Colorado-potetbiller i ulike dvaleperioder. Burene ble gravd ut, og de overlevende og døde billene ble talt i november, januar, april og mai. Barer representerer antall overlevende biller. Whiskers indikerer standardfeil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Infeksjoner hos overvintrende Colorado-potetbillekadavre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsmateriale: Klikk her for å laste ned tilleggsfilene nedenfor.
Tilleggsfigur 1. Aktivitet av ikke-spesifikke esteraser i midten av CPB under dvalemodus. Whiskers betegner standardfeil. Ulike bokstaver indikerer signifikante forskjeller mellom tidspunkter (Dunns test, P < 0,05).
Tilleggsfigur 2: Endringer i uttrykket av transkripsjonsfaktor NFkB (IMD-banen) i tarmen og fettlegemet til CPB under dvalemodus. Data presenteres som foldeendringer i forhold til et tidspunkt i august. Rp4, Rp18 og Arf19 ble brukt som referansegener. Værhår viser standardfeil.
Tilleggstabell 1: Antatt identifisering av 16S rRNA (~800 bp) gensekvenser av bakterier isolert fra en død CPB under dvalemodus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien viser at den foreslåtte metoden for å studere overvintring av CPB gjør det mulig for oss å skaffe et tilstrekkelig antall insekter i forskjellige dvaleperioder. Suksessen til den presenterte teknikken avhenger av flere uavhengige faktorer, hvorav det viktigste er værforholdene. I en kald, snøfri vinter kan jorden fryse til hele dybden av buret. I dette tilfellet øker risikoen for død av alle biller betydelig18. Bjelkens overlevelse avhenger av en kombinasjon av mange faktorer, som kan variere betydelig fra år til år6.
I forsøket falt ikke jordtemperaturen inne i merdene om vinteren under minus 7,9 °C. Ingen is ble observert på en dybde større enn 25 cm, og jorda forble løs selv i perioden med størst avkjøling (januar-februar). De fleste biller akkumuleres i den nedre delen av hvert bur, i en dybde på 30-40 cm. Billene kan ha gravd seg dypere med større dybde i burene. På den annen side vil økt dybde på merden føre til en økning i vekt, noe som gjør det utfordrende å trekke ut merden fra jorda, spesielt om vinteren. Videre, ifølge våre observasjoner i potetfelt i regionen under studien, går CPB ikke dypere enn 35 cm for overvintring. Dette funnet kan forklares av leirejordlaget på dybden 30-35 cm, som billene ikke kan overvinne. I vårt eksperiment ble sandaktig, lammende jord fra den øvre 30 cm horisonten brukt. Dette er trolig grunnen til at billene klarte å grave dypere enn under naturlige forhold. Dybden der CPB går i dvale er typisk 10-25 cm (ref. 1), men dette kan variere mellom geografiske regioner. For eksempel, i det nordøstlige USA (New Jersey), dvale de fleste biller på en dybde på 10-13 cm (ref. 13). Lignende overvintringsdyp av biller (≤15 cm) er også dokumentert i Wisconsin, USA18. I de sørlige uralene (Russland) er dybden der CPB graver for overvintring i området 5-30 cm (ref. 20). Det skal bemerkes at overlevelsesgraden av insekter ikke alltid positivt korrelerer med en økning i overvintringsdybde1. Faktisk, i et feltovervintringseksperiment i Estland6, ble det vist at overlevelsesgraden til CPB var høyere i en dybde på 30 cm enn i en dybde på 50 cm. Disse forfatterne foreslår at dette funnet kan skyldes mangel på oksygen. Lignende data ble oppnådd i et feltforsøk i Wisconsin, USA18: Den høyeste overlevelsesraten (51,5%) av overvintrende CPB ble registrert på en dybde på 15-25 cm. Samtidig ble18 100% dødelighet av boblen notert på en dybde på 25-35 cm. Vi tror at en dybde på 40 cm er tilstrekkelig for eksperimenter i den tempererte sonen fordi prosentandelen av overlevende biller var høy, og jordfrysingen ikke strakte seg til hele burets dybde. Tilstedeværelsen av snødekke bidrar til mindre avkjøling av jorda. Om nødvendig kan tykkelsen på snødekket over overflaten av burene justeres.
Et annet sentralt punkt i protokollen er den mulige utilstrekkelige beredskapen til CPB for overvintring på grunn av en liten mengde lagrede næringsstoffer. Noen voksne CPB-er ble igjen på jordoverflaten etter massegravingen av billene i jorden. Det er mulig at de ikke lagret nok fett fordi suksessen med overvintring også avhenger av mengden akkumulerte næringsstoffer21. I tillegg, da burene ble fjernet fra jorden om vinteren, var noen av billene i frossen tilstand på jordoverflaten eller i laget nær overflaten. Kanskje dette var biller som ikke hadde nok energi til å grave på grunn av underernæring, infeksjoner eller andre skadelige faktorer. Lashomb et al.13 bemerket i eksperimenter med CPB-overvintring at ~ 15 % av voksne ikke gravde seg ned i jorden for overvintring. Disse forfatterne diskuterte ikke årsakene. I alle fall er det nødvendig å gi biller med nok mat.
Avhengig av studiens mål, kan det være nødvendig å holde biller i dvalemodus etter at de er samlet inn fra jorden. For dette formål bør laboratorietemperaturen være kjølig, og billene skal umiddelbart plasseres i forhold på 0-2 ° C etter utvinning fra jorda. Det ble observert i vårt arbeid at i høst og vår starter CPB nesten umiddelbart lokomotorisk aktivitet etter å ha blitt utgravd fra jorden; Denne prosessen foregår mye langsommere midt på vinteren.
Denne studien tok ikke hensyn til aktivt bevegelige entomopatogener og parasitoider. Vi brukte et geotekstil som en ekstra barriere mot spredning av CPB. Merk at en geotekstil ikke bør brukes i forskning på aktivt bevegelige entomopatogener (f.eks. Entomopatogene nematoder), rovdyr eller parasitoider fordi det vil hindre deres bevegelse gjennom det.
Det er viktig å påpeke at studier på immunitet og sykdommer i CPB hovedsakelig utføres under aktive fôringsstadier. Hvilestadier er mindre undersøkt og har blitt undersøkt hovedsakelig under laboratorieforhold. Under disse forholdene er det imidlertid vanskelig å simulere svingningene i temperatur, fuktighet og lufting som oppstår på naturlige avlssteder. Dermed er feltforsøk å foretrekke22. For å fastslå årsakene til CPB-vinterdødelighet i felt i forskjellige dvaleperioder, er det nødvendig å utgrave overvintrende biller fra jorda. Studier av CPB-overvintring under naturlige forhold ble aktivt utført på 1970-1980-tallet. Metodene beskrevet i disse artiklene består hovedsakelig av å samle og telle individer som dukker opp våren 13, evaluere effektiviteten av å bruke entomopatogene sopp 14,15,16 eller entomopatogene nematoder 15 før overvintring, og samle overvintrende biller fra jorden om våren og høsten for å bestemme naturlig vinterdødelighet 17. Samtidig varierte størrelser og former på burene som ble brukt i disse forsøkene fra 20×20 cm til 90×90×90 cm (ref.13) eller 180×60×30 cm (ref.18). Det bør påpekes at de nevnte studiene ikke var rettet mot å utvikle metodikken for CPB-overvintring med muligheten for å samle insekter om vinteren. I motsetning til eksisterende metoder gjør teknikken beskrevet i denne artikkelen det mulig å undersøke naturlige CPB-populasjoner i en snøperiode.
Avslutningsvis gjør den foreslåtte metoden det mulig for forskere å oppnå ønsket antall overvintrende CPB-individer under naturlige forhold med relativt lav dødelighet av insektene og til en lav kostnad. Undersøkelse av ulike aspekter av CPB-dvalemodus er viktig fra både grunnleggende forskning og anvendte synspunkter: for å forbedre tilnærminger til kontroll av dette. Denne teknikken kan tilpasses andre insektarter som overvintrer i jord. Fremtidige forskere kan bruke denne metoden til å studere generell fysiologi og biokjemi - inkludert immunitet av overvintrende faser - av ulike insektarter. I tillegg kan denne metoden brukes til å forutsi overflod av av interesse, på grunnlag av vinterdødeligheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker våre kolleger Vladimir Shilo, Vera Morozovа, Ulyana Rotskaya, Olga Polenogova og Oksana Tomilova for deres hjelp med organisering og gjennomføring av felt- og laboratorieprosedyrer.
Forskningen ble støttet av Russian Science Foundation, prosjekt nr. 22-14-00309.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
References
- Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. Colorado potato beetle. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 29-43 (2022).
- Alyokhin, A., Kryukov, V. Ecology of a potato field. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 451-462 (2022).
- Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A. Ice-nucleating active bacteria reduce the cold-hardiness of the freeze-intolerant Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 87 (2), 377-381 (1994).
- Ushatinskaja, R. S. Diapause of insects and its modifications. Journal of General Biology. 34, In Russian 194-215 (1973).
- Zheng, X. L., et al. Effect of soil moisture on overwintering pupae in Spodopteraexigua (Lepidoptera: Noctuidae). Applied Entomology and Zoology. 48, 365-371 (2013).
- Hiiesaar, K., Metspalu, L., Jõudu, J., Jõgar, K. Over-wintering of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) in field conditions and factors affecting its population density in Estonia. Agronomy Research. 4 (1), 21-30 (2006).
- Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Chirumamilla-Chapara, A., Larson, M. L. Characterization of gene expression patterns during the initiation and maintenance phases of diapause in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Physiology. 55 (1), 32-39 (2009).
- Yocum, G. D., Buckner, J. S., Fatland, C. L. A comparison of internal and external lipids of nondiapausing and diapause initiation phase adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 159 (3), 163-170 (2011).
- Nikonorov, Y. M., Syrtlanova, L. A., Kitaev, K. A., Benkovskaya, G. V. Transcription activity of genes involved in diapause regulation in the Colorado Potato beetle and its change under a fipronil impact. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 8, 80-86 (2018).
- Govaere, L., et al. Transcriptome and proteome analyses to investigate the molecular underpinnings of cold response in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Cryobiology. 88, 54-63 (2019).
- Lehmann, P., Westberg, M., Tang, P., Lindström, L., Käkelä, R. The diapause lipidomes of three closely related beetle species reveal mechanisms for tolerating energetic and cold stress in high-latitude seasonal environments. Frontiers in Physiology. 11, 576617 (2020).
- Lebenzon, J. E., Torson, A. S., Sinclair, B. J. Diapause differentially modulates the transcriptomes of fat body and flight muscle in the Colorado potato beetle. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 40, 100906 (2021).
- Lashomb, J. H., Ng, Y. S., Ghidiu, G., Green, E. Description of spring emergence by the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), in New Jersey. Environmental entomology. 13 (3), 907-910 (1984).
- Cantwell, G. E., Cantelo, W. W., Schroder, R. F. Effect of Beauveria bassiana on underground stages of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). The Great Lakes Entomologist. 19 (2), 6 (1986).
- Fedorko, A., Bajan, C., Kmitowa, K., Wojciehowska, M. Effectiveness of the use of selected microorganisms to control the Colorado beetle during hibernation. Ecological Studies. 3 (2), 127-134 (1977).
- Gaugler, R., Costa, S. D., Lashomb, J. Stability and efficacy of Beauveria bassiana soil inoculations. Environmental Entomology. 18 (3), 412-417 (1989).
- Bajan, C., Kmitowa, K. Contribution of entomopathogenic fungi to the natural winter reduction of Colorado beetle adults. Polish Ecological Studies. 3 (2), 107-114 (1977).
- Milner, M., Kung, K. S., Wyman, J. A., Feldman, J., Nordheim, E. Enhancing overwintering mortality of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) by manipulating the temperature of its diapause habitat. Journal of Economic Entomology. 85 (5), 1701-1708 (1992).
- Doğan, C., et al. Characterization of calcium signaling proteins from the fat body of the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae): Implications for diapause and lipid metabolism. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 133, 103549 (2021).
- Benkovskaya, G. V., Udalov, M. B. Colorado potato beetle investigations in the south Urals. Nova Science Publishers. , (2011).
- Short, C. A., Hahn, D. A. Fat enough for the winter? Does nutritional status affect diapause. Journal of Insect Physiology. , 104488 (2023).
- McDonald, J. R., Bale, J. S., Walters, K. F. A. Low-temperature mortality and overwintering of the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae). Bulletin of Entomological Research. 87 (5), 497-505 (1997).
