Summary
Qui presentiamo un metodo per studiare il letargo del coleottero della patata Colorado nelle condizioni naturali della zona temperata, nonché una tecnica per la raccolta dei coleotteri in inverno. Questo metodo consente di ottenere un numero desiderato di individui svernanti per varie analisi in qualsiasi fase del letargo.
Abstract
Uno dei principali parassiti della patata Solanum tuberosum L. nella zona temperata è l'insetto scarabeo della patata del Colorado (CPB). La maggior parte degli studi sull'immunità e sulle malattie del CPB sono condotti durante le fasi di alimentazione attiva. Tuttavia, ci sono meno studi sulle fasi di riposo, anche se questi coleotteri trascorrono la maggior parte del loro ciclo vitale in uno stato di diapausa invernale (letargo). In questo lavoro è stato sviluppato e testato un metodo per studiare l'ibernazione CPB in condizioni naturali, offrendo l'opportunità di raccogliere un numero sufficiente di individui in inverno. In questo articolo è stata valutata la sopravvivenza al CPB e sono stati identificati gli agenti infettivi in diverse fasi di ibernazione. La mortalità per CPB è aumentata durante il letargo, raggiungendo un massimo in aprile-maggio. Funghi entomopatogeni (Beauveria, Isaria e Lecanicillium) e batteri Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas e Serratia sono stati isolati dagli insetti morti. Il tasso di sopravvivenza dei coleotteri per l'intero periodo di ibernazione è stato del 61%. Non sono stati trovati coleotteri congelati o essiccati, il che indica il successo del metodo presentato.
Introduction
Il coleottero della patata del Colorado Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) è un importante parassita delle piante di Solanaceae, prevalentemente Solanum tuberosum L. L'areale geografico di questa specie è di oltre 16 milioni dikm2 e si espande costantemente1. Il CPB ha una diapausa invernale facoltativa e il letargo è obbligatorio nella zona temperata. La diapausa è indotta da un fotoperiodo a giorno corto e modulata dalla temperatura1. Questi coleotteri svernano allo stadio adulto scavando nel terreno. Con l'aumentare delle latitudini, la durata del periodo di ibernazione si allunga. Nella zona temperata, soprattutto nei territori settentrionali del suo areale, lo svernamento dura fino a 9 mesi: da agosto-settembre a maggio-giugno (Noskov et al., osservazioni personali). Durante questo periodo, il CPB – proprio come qualsiasi altro insetto della zona temperata – è esposto a condizioni invernali sfavorevoli e deve aumentare la sua tolleranza al freddo. Allo stesso tempo, il contatto dei coleotteri con il suolo aumenta il rischio di infezione da parte di vari microrganismi opportunisti e patogeni2. Pertanto, questi coleotteri hanno bisogno di mantenere un certo livello di attività del sistema immunitario durante il letargo, che è anche energeticamente costoso. Tuttavia, anche se l'insetto sopravvive a un'infezione, la malattia può ridurre la sua resistenza al freddo3. Va notato che la bassa temperatura non è l'unica ragione della mortalità invernale del CPB. Un ruolo importante è svolto anche dalla mancanza di ossigeno e, in alcune condizioni, potrebbe essere il principale fattore di mortalità invernale 4,5.
È noto che la mortalità invernale naturale del CPB può essere molto elevata, raggiungendo il 100% nei terreni franco-argillosi6. Pertanto, lo svernamento è uno dei periodi più cruciali nel ciclo di vita del CPB. Tuttavia, i dati sulla fisiologia, l'attività del sistema immunitario, la sopravvivenza e altri parametri dell'ibernazione CPB in condizioni naturali sono ancora limitati. Sono presenti studi sull'espressione genica differenziale e su vari parametri fisiologici negli adulti CPB durante la diapausa e in risposta allo shock da freddo 7,8,9,10,11,12; Tuttavia, queste analisi sono state effettuate principalmente mediante induzione di diapausa o stress da freddo in condizioni di laboratorio senza fluttuazioni naturali di temperatura, umidità e carico patogeno nativo. Ciononostante, la ricerca sulla fisiologia di questi coleotteri raccolti mediante scavo dal suolo in condizioni naturali è importante. Diversi aspetti dello svernamento del CPB in condizioni naturali sono stati attivamente studiati negli anni 1970-1980 13,14,15,16,17,18. D'altra parte, questi studi non hanno comportato lo scavo di CPB dal suolo in inverno. Inoltre, non vengono fornite in dettaglio una tecnica per l'ibernazione controllata del CPB e una descrizione delle gabbie. Pertanto, è necessaria un'indagine sulla fisiologia dei CPB che svernano in ambienti naturali19.
Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare e testare un metodo per l'ibernazione controllata degli adulti CPB in condizioni naturali. Il metodo proposto consente di ottenere un numero desiderato di individui CPB per saggi microbiologici, immunologici e di altro tipo durante l'ibernazione in condizioni di campo di un clima continentale. Questo metodo può essere adattato e applicato ad altre specie di insetti che svernano nel terreno sotto la neve.
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Protocol
1. Descrizione delle gabbie per il letargo
NOTA: A seconda degli obiettivi dell'esperimento, il numero di gabbie varia. Utilizzare almeno tre gabbie per data di campionamento. Per stimare il numero di coleotteri che emergeranno, prepara almeno tre gabbie aggiuntive, che non verranno estratte dal terreno fino alla primavera.
- Utilizzare gabbie costituite da un telaio rigido in legno con dimensioni di 25 × 25 × 40 cm (L × P × H).
- Per costruire un telaio per la gabbia, utilizzare doghe di legno di almeno 2 cm di spessore e 4 cm di larghezza.
- Coprire l'interno della gabbia con una rete in acciaio inossidabile avente una dimensione di aperture non superiore a 5 mm × 3 mm. Usa una cucitrice per legno per fissare la rete.
- Fissare la rete in acciaio inossidabile all'esterno del fondo con la cucitrice.
- Rivestire l'interno della gabbia con un geotessile sintetico nero con una densità di 60 g/m2.
NOTA: Il geotessile funge da barriera aggiuntiva per impedire la fuga dei coleotteri. Non utilizzarlo in esperimenti relativi a entomopatogeni e parassitoidi in movimento attivo. - Fissare saldamente un tubo di tessuto sintetico traslucido e traspirante alto circa 60 cm alla parte superiore della gabbia.
- Incrociare e fissare due robuste corde al fondo della gabbia per estrarla dal terreno quando necessario.
2. Installazione delle gabbie
- Scava una buca profonda 40 cm nel terreno e posiziona la gabbia all'interno.
- Stendere erba secca o fieno sulla buca.
- Posiziona la gabbia all'interno in modo che il fieno o l'erba secca si trovino tra le pareti della gabbia e il terreno.
- Riempi le gabbie con il terreno dello stesso campo di patate in cui vengono raccolti gli insetti.
- Installare data logger di temperatura e umidità impermeabili nelle gabbie alle profondità richieste.
NOTA: È possibile utilizzare data logger di qualsiasi produttore e devono essere in grado di funzionare a basse temperature. - Piantare piantine di patate all'interno di ogni gabbia 3-4 settimane prima dell'introduzione dei coleotteri e annaffiarle moderatamente.
- Fissare verticalmente un tubo di tessuto sintetico a un bastoncino di qualsiasi materiale installato all'esterno della gabbia.
3. Allevamento di insetti prima dello svernamento
- Raccogli manualmente i coleotteri adulti nei campi di patate privi di pesticidi verso la fine della vegetazione delle patate.
NOTA: I coleotteri adulti differiscono sostanzialmente dalle larve e sono caratterizzati da elitre striate, mentre le larve sono rosse. - Conservare i coleotteri raccolti in secchi di plastica da 15-20 L (max 200 individui per secchio) contenenti cime di patate per nutrire gli insetti prima di metterli nelle gabbie.
- Copri i secchi con tessuto traspirante.
NOTA: Non tenere gli insetti nei secchi per più di 12 ore. Usa cime di patate abbastanza grandi per evitare l'accumulo di coleotteri sul fondo dei secchi. - Posiziona non più di 200 individui CPB sulle piante di patate coperte con la rete di tessuto sintetico.
- Quando le cime di patate sono consumate, aggiungi quelle fresche messe in un barattolo di plastica contenente acqua e cambia le cime di patate ogni giorno.
NOTA: Per fissare i gambi in un barattolo, utilizzare un batuffolo di cotone e un parafilm. Controlla attentamente i vecchi steli per i coleotteri quando li rimuovi. - Una volta che tutti i coleotteri sono stati scavati nel terreno per lo svernamento, slega il tubo di tessuto sintetico dal bastoncino e stendi il tessuto.
4. Raccolta di insetti durante la stagione invernale
- Rimuovere la neve sopra la superficie della gabbia.
- Allentare la gabbia su ciascun lato con una pala robusta.
- Estrarre la gabbia dal terreno usando le corde.
- Porta la gabbia in laboratorio.
NOTA: A seconda degli obiettivi dell'esperimento, potrebbe essere necessario che i coleotteri in letargo siano inattivi prima dell'analisi. In questo caso, la temperatura in laboratorio durante l'isolamento dei coleotteri dal suolo dovrebbe essere di ~2-5 °C. - Rimuovi il terreno dalla scatola in piccole porzioni, rompi con cura grandi pezzi di terra e isola i coleotteri usando una pinzetta.
- Separare i coleotteri vivi dai cadaveri. I coleotteri vivi e sani creano un terreno compatto intorno a loro, formando una cavità d'aria (una cosiddetta culla) e sono, quindi, facilmente separabili dal suolo. I coleotteri uccisi dai funghi sono mummificati o hanno micelio visibile sulla superficie. Gli insetti che si decompongono battericamente sono scuri.
- Setacciare il terreno attraverso un setaccio per assicurarsi che tutti i coleotteri siano isolati e non danneggiati.
- Collocare i cadaveri con sintomi di infezione fungina o decomposizione batterica in una provetta da centrifuga sterile individuale da 15 mL per una futura identificazione.
- Conservare i coleotteri vivi in frigorifero a una temperatura di 0-2 °C fino all'analisi in un contenitore chiuso e ventilato contenente un batuffolo di cotone umido.
5. Preparazione di campioni di organi e tessuti
- Per raccogliere l'emolinfa, praticare una puntura nella parte laterale dell'addome sotto le elitre utilizzando un ago da insulina.
NOTA: Durante lo svernamento, la quantità di emolinfa è significativamente ridotta, il che rende difficile la raccolta di questo liquido. - Per isolare l'intestino, tagliare la capsula della testa, spremere tutto il contenuto in una capsula di Petri con tampone fosfato, separare l'intestino e pulirlo dal grasso e dai vasi malpighiani.
- Separa una sezione desiderata dell'intestino, come l'intestino anteriore, l'intestino medio o l'intestino posteriore.
- Per isolare il corpo adiposo, separarlo dagli altri tessuti dopo l'isolamento dell'intestino.
NOTA: I tessuti isolati possono essere utilizzati per misurare l'attività degli enzimi antiossidanti e disintossicanti (un esempio: Figura 1 supplementare), l'analisi della regolazione dei geni della via di segnalazione immunitaria (un esempio: Figura 2 supplementare) o il metabarcoding del contenuto intestinale degli insetti, ecc.
6. Isolamento dei microrganismi dai cadaveri
- Per isolare i funghi entomopatogeni dai cadaveri, mettere gli insetti mummificati in una camera di umidità sterile.
- Utilizzare i conidi aerei (se disponibili) o gli sclerozi del contenuto interno dei coleotteri per la placcatura su agar destrosio Sabouraud con acido lattico allo 0,4%.
NOTA: Utilizzare coleotteri con micelio e conidi per la placcatura immediata (senza metterli in camere di umidità). - Isolare i batteri dai cadaveri con sintomi di decomposizione batterica.
- Tagliare la testa di uno scarabeo, spremere il contenuto interno e raccoglierlo in tubi per la successiva placcatura su terreni per batteri (agar Luria-Bertani, agar endo e agar esculina biliare).
NOTA: Utilizzare la microscopia e i metodi molecolari per identificare i generi e le specie dei patogeni. Se necessario, può essere eseguita un'analisi per la presenza di altri parassiti.
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Representative Results
I risultati riportati di seguito sui CPB svernanti mostrano la temperatura del suolo, la sopravvivenza e le infezioni.
Dinamica della temperatura del suolo.
Temperature sotto lo zero nelle gabbie a una profondità di 30 cm sono state registrate dalla fine di novembre all'inizio di aprile (Figura 1). La temperatura media durante questo periodo è stata di -3,3 ± 0,1 °C (errore medio ± standard). La temperatura più bassa registrata è stata di -7,9 °C a metà febbraio.
Sopravvivenza dei CPB svernanti.
La mortalità degli insetti è stata osservata durante il letargo e ha raggiunto un massimo in primavera prima dell'emergenza. Il numero iniziale di coleotteri era di 2000, di cui 1470 individui sono sopravvissuti alla fine di maggio. Il tasso di sopravvivenza dei coleotteri durante il letargo è stato del 61% (Figura 2).
Infezioni nei CPB svernanti.
Un'analisi di 530 coleotteri morti ha mostrato che durante il periodo di ibernazione, il 53% di loro presentava sintomi di decomposizione batterica e il 25% presentava sintomi di infezioni fungine (Figura 3). La Beauveria ha dominato (45 isolati) tra le colture isolate di funghi entomopatogeni. Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) e Lecanicillium erano molto meno comuni (due isolati ciascuno). Tra i batteri isolati dai cadaveri con sintomi di decomposizione batterica (n=30) sono state identificate specie appartenenti ai generi Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella e Glutamicibacter (Tabella supplementare 1).
Figura 1: Dinamica della temperatura del suolo. Dinamica della temperatura del suolo misurata da un data logger di temperatura impermeabile installato a una profondità di 30 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sopravvivenza dei coleotteri della patata svernanti in diversi periodi di letargo. Le gabbie sono state scavate e i coleotteri sopravvissuti e morti sono stati contati a novembre, gennaio, aprile e maggio. Le barre rappresentano il numero di coleotteri sopravvissuti. I baffi indicano l'errore standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Infezioni nei cadaveri di scarabeo della patata svernante. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Materiali supplementari: Fare clic qui per scaricare i file supplementari riportati di seguito.
Figura supplementare 1. Attività delle esterasi aspecifiche nell'intestino medio del CPB durante il letargo. I baffi indicano l'errore standard. Lettere diverse indicano differenze significative tra i punti temporali (test di Dunn, P < 0,05).
Figura 2 supplementare: Alterazioni dell'espressione del fattore di trascrizione NFkB (via IMD) nell'intestino e nel corpo adiposo del CPB durante il letargo. I dati sono presentati come variazioni di piegatura rispetto a un punto temporale di agosto. Rp4, Rp18 e Arf19 sono stati utilizzati come geni di riferimento. I baffi mostrano un errore standard.
Tabella supplementare 1: Identificazione putativa di sequenze geniche rRNA 16S (~800 bp) di batteri isolati da un CPB morto durante l'ibernazione.
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Discussion
Questo studio dimostra che il metodo proposto per studiare lo svernamento dei CPB ci permette di ottenere un numero sufficiente di insetti in diversi periodi di letargo. Il successo della tecnica presentata dipende da diversi fattori indipendenti, il più importante dei quali sono le condizioni meteorologiche. In un inverno freddo e senza neve, il terreno può congelare fino all'intera profondità della gabbia. In questo caso, il rischio di morte di tutti i coleotteri aumenta significativamente18. La sopravvivenza del coleottero dipende da una combinazione di molti fattori, che possono variare significativamente da un anno all'altro6.
Nell'esperimento, la temperatura del suolo all'interno delle gabbie durante l'inverno non è scesa al di sotto di meno 7,9 °C. Non è stato osservato ghiaccio a una profondità superiore a 25 cm e il suolo è rimasto sciolto anche durante il periodo di maggior raffreddamento (gennaio-febbraio). La maggior parte dei coleotteri si è accumulata nella parte inferiore di ogni gabbia, ad una profondità di 30-40 cm. I coleotteri potrebbero aver scavato più in profondità con una maggiore profondità delle gabbie. D'altra parte, aumentare la profondità della gabbia porterebbe ad un aumento di peso, rendendo difficile l'estrazione della gabbia dal terreno, soprattutto in inverno. Inoltre, secondo le nostre osservazioni nei campi di patate della regione oggetto di studio, il CPB non scava più in profondità di 35 cm per lo svernamento. Questo risultato può essere spiegato dallo strato di terreno argilloso alla profondità di 30-35 cm, che i coleotteri non riescono a superare. Nel nostro esperimento, è stato utilizzato un terreno sabbioso e argilloso dell'orizzonte superiore di 30 cm. Questo è probabilmente il motivo per cui i coleotteri sono stati in grado di scavare più in profondità che in condizioni naturali. La profondità alla quale il CPB va in letargo è tipicamente di 10-25 cm (rif. 1), ma questo può variare a seconda delle regioni geografiche. Ad esempio, nel nord-est degli Stati Uniti (New Jersey), la maggior parte dei coleotteri va in letargo a una profondità di 10-13 cm (rif. 13). Simili profondità di svernamento dei coleotteri (≤15 cm) sono state documentate anche nel Wisconsin, USA18. Negli Urali meridionali (Russia), la profondità alla quale il CPB scava per lo svernamento è compresa tra 5 e 30 cm (rif. 20). Va notato che il tasso di sopravvivenza degli insetti non è sempre correlato positivamente con un aumento della profondità di svernamento1. Infatti, in un esperimento di svernamento sul campo in Estonia6, è stato dimostrato che il tasso di sopravvivenza del CPB era più alto a una profondità di 30 cm che a una profondità di 50 cm. Questi autori propongono che questa scoperta possa essere dovuta alla mancanza di ossigeno. Dati simili sono stati ottenuti in un esperimento sul campo in Wisconsin, USA18: il più alto tasso di sopravvivenza (51,5%) dei CPB svernanti è stato registrato ad una profondità di 15-25 cm. Allo stesso tempo,18, 100% di mortalità del coleottero è stato notato a una profondità di 25-35 cm. Riteniamo che una profondità di 40 cm sia sufficiente per gli esperimenti nella zona temperata perché la percentuale di coleotteri sopravvissuti era alta e il congelamento del suolo non si estendeva all'intera profondità della gabbia. La presenza di manto nevoso contribuisce al minor raffreddamento del suolo. Se necessario, è possibile regolare lo spessore del manto nevoso sopra la superficie delle gabbie.
Un altro punto chiave del protocollo è la possibile insufficiente prontezza del CPB per lo svernamento a causa di una piccola quantità di nutrienti immagazzinati. Alcuni CPB adulti sono rimasti sulla superficie del suolo dopo la massiccia scavatura dei coleotteri nel terreno. È possibile che non abbiano immagazzinato abbastanza grasso perché il successo dello svernamento dipende anche dalla quantità di nutrienti accumulati21. Inoltre, quando le gabbie sono state rimosse dal terreno in inverno, alcuni dei coleotteri erano congelati sulla superficie del suolo o nello strato vicino alla superficie. Forse questi erano i coleotteri che non avevano abbastanza energia per scavare a causa della malnutrizione, delle infezioni o di altri fattori dannosi. Lashomb et al.13 hanno notato in esperimenti con lo svernamento di CPB che ~ 15 % degli adulti non ha scavato nel terreno per lo svernamento. Tali autori non ne hanno discusso le ragioni. In ogni caso, è necessario fornire agli scarafaggi cibo a sufficienza.
A seconda degli obiettivi di uno studio, potrebbe essere necessario mantenere i coleotteri in uno stato di ibernazione dopo che sono stati raccolti dal suolo. A tal fine, la temperatura di laboratorio dovrebbe essere fresca e i coleotteri dovrebbero essere immediatamente posti in condizioni di 0-2 °C dopo l'estrazione dal terreno. Nel nostro lavoro è stato osservato che in autunno e in primavera, i CPB iniziano quasi immediatamente l'attività locomotoria dopo essere stati scavati dal terreno; Questo processo avviene molto più lentamente in pieno inverno.
Questo studio non ha preso in considerazione entomopatogeni e parassitoidi in movimento attivo. Abbiamo utilizzato un geotessile come ulteriore barriera contro la diffusione del CPB. Si noti che un geotessile non dovrebbe essere utilizzato nella ricerca su entomopatogeni in movimento attivo (ad esempio, nematodi entomopatogeni), predatori o parassitoidi perché impedirebbe il loro movimento attraverso di esso.
È importante sottolineare che gli studi sull'immunità e sulle malattie del CPB sono condotti principalmente durante le fasi di alimentazione attiva. Le fasi di riposo sono meno studiate e sono state esaminate principalmente in condizioni di laboratorio. In queste condizioni, tuttavia, è difficile simulare le fluttuazioni di temperatura, umidità e aerazione che si verificano nei siti di riproduzione naturali. Pertanto, gli esperimenti sul campo sono preferibili22. Per determinare le cause della mortalità invernale del CPB sul campo in diversi periodi di ibernazione, è necessario scavare i coleotteri svernanti dal suolo. Negli anni 1970-1980 sono stati condotti attivamente studi sullo svernamento del CPB in condizioni naturali. I metodi descritti in questi articoli consistono principalmente nella raccolta e nel conteggio degli individui che emergono in primavera 13, nella valutazione dell'efficacia dell'uso di funghi entomopatogeni 14,15,16 o nematodi entomopatogeni15 prima dello svernamento e nella raccolta di coleotteri svernanti dal suolo in primavera e in autunno per determinare la mortalità invernale naturale 17. Allo stesso tempo, le dimensioni e le forme delle gabbie utilizzate in questi esperimenti variavano da 20×20 cm a 90×90×90 cm (rif.13) o 180×60×30 cm (rif.18). Va precisato che i suddetti studi non erano finalizzati a sviluppare la metodologia per lo svernamento del CPB con la possibilità di raccogliere insetti in inverno. A differenza dei metodi esistenti, la tecnica descritta in questo articolo consente di studiare le popolazioni naturali di CPB in un periodo nevoso.
In conclusione, il metodo proposto consente ai ricercatori di ottenere il numero desiderato di individui CPB svernanti in condizioni naturali con una mortalità relativamente bassa degli insetti e a basso costo. Lo studio dei vari aspetti dell'ibernazione CPB è essenziale sia dal punto di vista della ricerca di base che da quello applicato: per migliorare gli approcci al controllo di questo parassita. Questa tecnica può essere adattata ad altre specie di insetti che svernano nel terreno. I futuri ricercatori potrebbero applicare questo metodo per studiare la fisiologia generale e la biochimica, compresa l'immunità delle fasi di svernamento, di varie specie di insetti. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per prevedere l'abbondanza di parassiti di interesse, sulla base della loro mortalità invernale.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi sono interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo i nostri colleghi Vladimir Shilo, Vera Morozovа, Ulyana Rotskaya, Olga Polenogova e Oksana Tomilova per il loro aiuto nell'organizzazione e nell'esecuzione delle procedure sul campo e di laboratorio.
La ricerca è stata sostenuta dalla Russian Science Foundation, progetto n. 22-14-00309.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
References
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